1Tecnología CRISPR

Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión.

Facultad de Ingeniería Industrial,Sistema e Informática.
Escuela de Ingeniería Industrial.

Saldaña Rosales Alondra Clarita.

Octubre 2019.
 Introducción

Las plantas que hoy se cultivan son diferentes a sus antepasados silvestres, ya que el

hombre ha modificado y seleccionado sus propiedades a lo largo de más de diez mil años en

función de sus necesidades.

A mediados del siglo pasado, esta actividad practicada por la mayoría de los agricultores

del mundo, se convirtió en una ciencia a partir del conocimiento de la genética de los seres vivos.

Lo que antes demandaba largos procesos de selección empírica, fue reemplazada o acelerada por

el mejoramiento genético en laboratorios y por la introducción de genes para potenciar las

plantas con relación a su entorno. Así se han obtenido variedades con nuevas características y

mayor resistencia a plagas y enfermedades, a la escasez del agua o a las variaciones climáticas

extremas.

En un peldaño superior, la biotecnología moderna ha combinado genes de especies

diferentes para obtener mayores resultados en la agricultura. Aún cuando hay resistencias a estas

acciones, lo cierto es que la ciencia deberá continuar buscando los caminos que permitan

producir más alimentos con menos recursos y que estos cultivares además, reduzcan los efectos

colaterales de una agricultura que requiere producir más alimentos e insumos para otras

actividades.

En cuanto a la biotecnología para el caso del Perú, requiere de considerable apoyo

tecnológico y económico. Fenómenos actuales en el mundo como la globalización y el Tratado

de Libre Comercio exigen una mejor competitividad de los cultivos y el desabastecimiento de

alimentos a futuro.
 Índice

Capítulo 1 Generalidades de la tecnología CRISPR........................................................................1

Cronología CRISPR.....................................................................................................................1

Funcionamiento CRISPR.............................................................................................................6

Aplicaciones de la tecnología CRISPR-Cas9..............................................................................9

Capítulo 2 Aplicaciones de CRISPR/Cas en biotecnología vegetal.............................................14

Particularidades del sistema CRISPR/Cas en plantas................................................................14

Métodos de detección de las modificaciones producidas por el sistema CRISPR/Cas.............16

Mejoramiento genético..............................................................................................................17

Mejoramiento a estrés biótico y abiótico...................................................................................17

Ingeniería Metabólica................................................................................................................21

Perspectivas, limitaciones y cuestiones éticas...........................................................................22

Capítulo 4 Conclusiones...............................................................................................................24

Bibliografía....................................................................................................................................25
 Lista de tablas

Tabla 1:. Algunos cultivos mejorados mediante CRISPR/Cas para resistencia a microorganismos

patógenos.......................................................................................................................................19
 Lista de figuras

Y
Figura 1:Emmanuelle Charpentier (izquierda) y Jennifer Doudna convirtieron CRISPR/Cas9 en

un editor genómico..........................................................................................................................6

Figura 2:fases del funcionamiento CRISPR....................................................................................8

Figura 3:CRISPR editor genómico..................................................................................................9

Figura 4:sustitución genética.........................................................................................................18

 1

Capítulo 1

Identificación Del Problema

La humanidad depende, directa o indirectamente, de las plantas para su alimentación, ya

que todos sus alimentos son vegetales o se derivan de éstos, por ejemplo: carne, huevos y

productos lácteos. De las plantas se deriva también directa o indirectamente, la mayoría de las

fibras textiles, fármacos, combustibles, lubricantes y materiales de construcción. Además,

algunas plantas desempeñan funciones de ornato.

Considerada la gran importancia de las plantas, no sorprende que el hombre se haya

preocupado desde hace miles de años por obtener tipos de plantas superiores para satisfacer sus

necesidades. Sin embargo, estos intentos se sistematizaron recientemente con el desarrollo de la

genética.

Las poblaciones humanas y las de animales siempre han padecido hambre, excepto

durante los breves periodos de abundancia. Cada uno de estos periodos ha producido aumentos

bruscos en las poblaciones, y casi siempre les siguen épocas de hambre y, consecuentemente, de

enfermedades, alta mortalidad infantil, vida pobre y desnutrida, etc.

La preocupación del hombre por aumentar la producción agrícola de acuerdo con sus

necesidades, se ha manifestado desde hace muchos siglos. Por ejemplo, en 1798 Thomas Robert

Malthus señaló que la población aumenta hasta que el hambre la controla, a no ser que

sobrevengan guerras o desastres. Además, profetizó una catástrofe, pues creía que la población

crecía en progresión geométrica y los alimentos en progresión aritmética.

 2

Cronología CRISPR

Conocer la historia del descubrimiento de CRISPR nos ayuda a entender su función en la

naturaleza y su utilidad para aplicarlo en ámbitos como la medicina, la alimentación y la

agricultura. Si no cuentas con conocimientos sobre bioquímica y genética puede ser difícil

comprender parte de la terminología en relación con los descubrimientos realizados, pero esto no

es un problema, porque para aquellos que no nos dedicamos a la investigación científica, lo más

importante es la aplicación que se pueda dar a esta tecnología.

A continuación, compartimos el cronograma de descubrimientos científicos que han

hecho posible que ahora se pueda comenzar a aplicar la tecnología CRISPR-Cas9 en situaciones

reales, que ayuden a mejorar la vida de las personas. Según vayas avanzando a lo largo del

artículo irás entendiendo la importancia de los diferentes descubrimientos que se han ido

produciendo y al mismo tiempo las bases de funcionamiento de esta tecnología.

 Año 1987 el investigador japonés Yoshizumi Ishino menciona por primera vez en un

artículo científico la existencia de secuencias repetidas palindrómicas en el ADN de las

bacterias. En estas secuencias de ADN es sobre las que se basa la tecnología CRISPR.

 Año 1993 el científico español Francisco J. M. Mojica, perteneciente a la Universidad

de Alicante, publica el resultado de sus investigaciones con las bacterias arqueas

halófilas, que tienen la capacidad de vivir en medios con unas concentraciones de sales

extremadamente elevadas. Mediante la secuenciación de parte del genoma de la

arquea identifica unas secuencias palindrómicas de 30 pares de bases separadas entre sí

por fragmentos de 36 pares de bases, los denominados espaciadores.

 Año 2000 Francisco J. M. Mojica y sus colaboradores detectan, buceando en bases de

datos, un gran número de estas secuencias repetidas en bacterias, arqueas y mitocondrias

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y proponen el nombre de Short Regularly Spaced Repeats (SRSR) (Repeticiones Cortas

Regularmente Espaciadas). Posteriormente se decidió cambiar el nombre por Clustered

Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats (CRISPR) (Repeticiones

Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas)

 Año 2002 en una publicación de microbiólogos holandeses se describen por vez primera

un conjunto de genes, algunos de los cuales codifican nucleasas o helicasas putativas,

asociados a las secuencias repetidas CRISPR (los genes cas o asociados a CRISPR)

 Año 2005 tres grupos de investigación independientes muestran que algunos de los

espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN de virus

bacteriofagos y ADN extracromosomal como los plásmidos. El grupo de investigación de

Francisco J. Mojica intuye que las secuencias CRISPR y los espaciadores asociados,

pueden formar parte de algún sistema inmune propio de estos microorganismos

procarióticos. Por otro lado Alexander Bolotin, del Instituto Francés de Investigación

Agronómica descubre en la bacteria Streptococcus thermophilus que carecen de algunos

de los genes cas conocidos y en su lugar contiene nuevos genes cas, incluyendo uno que

codifica una proteína que predice que tienen actividad de nucleasa, lo cual ahora se

denomina como Cas9.

 Año 2006 el científico Eugene Koonin del Centro Nacional de Información sobre

Biotecnología de Estados Unidos estudia grupos de proteínas por análisis computacional

y propone un esquema para cascadas de CRISPR que funcionan como sistema inmune

bacteriano, basado en inserciones homólogas al ADN del virus.

 Año 2007 el investigador Philippe Horvath (perteneciente a la industria alimenticia en

la empresa Danisco) y el grupo de Moineau en la Université Laval de Canadá muestran

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que es posible alterar la resistencia de Streptococcus thermophilus a ataques de fagos

gracias al ADN espaciador.

 Año 2008 el científico John van der Oost, de la Universidad de Wageningen en los

Países Bajos, demuestra que en la bacteria coli E-Scherichia , las secuencias

espaciadoras, que se derivan de fago, se transcriben en ARN, denominado ARN CRISPR

(crRNAs), que guía a las proteínas Cas hacia el ADN objetivo. Por otro lado Luciano

Marraffini y Erik Sontheimer,  de la Northwestern University en Illinois demuestran que

las moléculas objetivo son el ADN en lugar del ARN, como se pensaba hasta entonces, y

señalan que este sistema puede convertirse en una poderosa herramienta que transferir a

sistemas no bacterianos.

 Año 2009 el investigador Sylvain Moineau, de la Universidad de Laval en

Quebec demuestra que CRISPR-Cas9 crea roturas de doble cadena de ADN diana en

posiciones precisas y también confirma que Cas9 es la única proteína necesaria para la

escisión en el sistema de CRISPR-Cas9.

 Año 2011 la investigadora Emmanuelle Charpentier de la Universidad de Umee realiza

una pequeña secuenciación de ARN en Streptococcus pyogenes que contiene un sistema

de CRISPR-Cas9 y descubre que además de la crRNA, existe un segundo ARN que llama

trans-activación de CRISPR ARN (tracrRNA). Además demuestra que tracrRNA actúa

conjuntamente con el crRNA para guiar a Cas9 hacia sus objetivos.

 Año 2012 las científicas Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna de la

Universidad de California en Berkeley, demuestran cómo utilizar CRISPR como

herramienta de edición programable, que sirve para cortar cualquier cadena de

ADN in vitro. De esta forma es posible programar el sistema para que se dirija a una
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posición específica de un ADN cualquiera y cortarlo, para ello utilizan el sistema

CRISPR más simple que se basa en una proteína llamada Cas9. Descubren que las

bacterias responden ante un virus invasor al transcribir espaciadores y ADN palindrómico

en una larga molécula de ARN y que entonces la célula utiliza un ARN llamado Trans-

activating crRNA y la proteína Cas9 para cortarla en pedazos llamados ARNcr.

 Año 2013 el investigador Feng Zhang del Instituto Broad del MIT y Harvard, Instituto

McGovern para la Investigación del Cerebro en el MIT adapta con éxito el sistema

CRISPR-Cas9 para la edición del genoma en células eucariotas, para ello diseñan dos

genes ortólogos diferentes Cas9 y demuestran la escisión específica del genoma en

células humanas y de ratón.

Al margen de la investigación, durante el año 2013 se realizan las primeras solicitudes

de patentes sobre la tecnología CRISPR-Cas9. Por un lado el 15 de marzo de 2013, la

Universidad de California en Berkeley y la Universidad de Viena realizaron la

solicitud 13/842,859 de patente para el método de edición genética, con un documento,

que contenía 152 reivindicaciones que cubrían la protección de células no humanas y

presentaba como fecha de prioridad el 25 de mayo de 2012, apareciendo como inventores

de la patente Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier. Por otro lado Instituto

Broad del MIT solicitó una segunda patente con número 14/054,414 con fecha 15 de

octubre de 2013 y fecha de prioridad del documento el 12 de diciembre de 2012 en el que

consta Feng Zhang como inventor del método y en el que sí que se encuentra la

posibilidad de trabajar con células humanas. Aunque la solicitud de patente realizada

por Feng Zhang es posterior a la solicitud de Jennifer Doudna, ha sido el científico del

MIT el primero en recibir la autorización de patente por lo que posteriormente se ha

 6

producido un conflicto entre ambas partes por contar con la titularidad de la patente de la

tecnología CRISPR-Cas9.

 Año 2014 investigadores del MIT demuestran que es posible utilizar la tecnología

CRISPR para revertir síntomas de enfermedad en organismos vivos gracias a un

experimento en la que pudieron curar ratones con desórdenes genéticos del hígado.

 Año 2015 Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna reciben el premio Princesa de

Asturias por sus aportaciones la investigación de la tecnología CRISPR-Cas9.

 Año 2016 Jennifer Doudna propone que se haga una pausa en la utilización de la

tecnología CRISPR en embriones humanos para que la comunidad científica pueda

pensar en las implicaciones de esta tecnología en la modificación del genoma humano.

[ CITATION Fut17 \l 2058 ]

Figura 1:Emmanuelle Charpentier (izquierda) y Jennifer Doudna convirtieron CRISPR/Cas9 en un editor genómico.

Funcionamiento CRISPR

La tecnología CRISPR es fruto del estudio del genoma de las bacterias, del cual sabemos

que está compuesto por una única molécula circular, formada por dos cadenas, constituidas por
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una secuencia de nucleótidos formados por las bases nitrogenadas Adenina, Citosina, Guanina y

Timina.

CRISPR significa: repeticiones palindrómicas (que se lee igual adelante que atrás) cortas

de secuencias de bases nitrogenadas. Tras cada repetición se encuentran segmentos cortos de

ADN espaciador proveniente de exposiciones previas a un virus bacteriófagos. Muy cerca de

estas repeticiones se pueden encontrar los genes cas que codificaban para un tipo de proteínas

nucleasas.

CRISPR se configura como un sistema de defensa en la bacteria para evitar el ataque

de los virus y además como un sistema de almacenamiento de información sobre los

virus para que las futuras generaciones de la bacteria también puedan defenderse de igual forma

de sus atacantes. Para ello cuando el virus inyecta su ARN en la bacteria, las proteínas Cas son

capaces de cortar una pequeña parte del ADN viral, modificarlo e integrarlo dentro de su ADN

en el conjunto de secuencias CRISPR.

Los virus también han sido capaces de desarrollar su propio sistema CRISPR-Cas para

poder atacar a las bacterias, por lo que una vez que se conoce el funcionamiento del sistema en

las bacterias y comienza a utilizarse con aplicaciones terapéuticas, se podría hacer lo mismo

con los virus.

El funcionamiento de CRISPR-Cas9 como herramienta de ingeniería genética se basa en

el apareamiento entre el ADN y el ARN, y gracias a las múltiples estrategias que emplea

proteína Cas9, nos aseguramos de que el corte en el ADN se produce únicamente cuando se

detecta la secuencia objetivo correcta.

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Figura 2:fases del funcionamiento CRISPR
 9

La tecnología CRISPR-Cas9 presenta enormes ventajas sobre otros métodos de edición

del genoma, como son TALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases), la

gametogenesis in vitro y las nucleasas con dedos de zinc (ZFNs). Entre las ventajas encontramos

principalmente su sencillez y su menor coste, gracias a que no es necesario tener que generar

dominios proteicos para interaccionar con el ADN, lo cual facilita enormemente el proceso de

edición genómica. Otra de las ventajas es que permite editar varias regiones del genoma al

mismo tiempo (multiplexing), simplemente utilizando varios sgRNAs que dirijan a la Cas9

nucleasa a distintas partes del ADN.   

La tecnología CRISPR está disponible de manera muy asequible para que cualquier

científico quiera investigar con ella en busca de nuevas aplicaciones, para ello tan sólo tiene que

comprar a través de la web Addgene los plásmidos correspondientes a la función que quiera que

realice la proteína Cas9, todo ello por un precio de tan solo 65 euros, lo cual como podéis

imaginar va a suponer un incentivo para que muchos científicos y biohackers se lancen a

experimentar en el campo de la edición genética.

Además de Cas9 existen otras muchas proteínas Cas que se podrían utilizar para realizar

edición genética. Es ahora cuando se está empezando a conocer cómo funcionan estas proteínas

en relación con esta tecnología y por lo tanto en los próximos años vamos a ver como aumenta

significativamente las posibilidades de uso de los sistemas CRISPR.[ CITATION Fut17 \l 2058 ]

Figura 3:CRISPR editor genómico

 10

Aplicaciones de la tecnología CRISPR-Cas9

Las aplicaciones de los sistemas CRISPR-Cas han tenido inicialmente como objeto las bacterias

ya que es donde se han descubierto. En este ámbito se pueden utilizar para la identificación de cepas o

tipado. Ya que distintas cepas dentro de distintas especies pueden contener distintas características dentro

de su sistema CRISPR, en base a los virus a los que se han tenido que enfrentar, de esta forma se pueden

identificar con mayor precisión de dónde pueden proceder los brotes de infecciones producidos por

bacterias. Gracias a esto encontraremos aplicaciones por ejemplo en ámbitos como la medicina, la

fabricación de alimentos y la mejora de la agricultura.

En Medicina gracias a la tecnología CRISPR se podrá desarrollar la terapia génica en la que

además de identificar los genes responsables de alteraciones genéticas, estos genes podrán ser

reemplazados, corregidos y eliminados en el paciente, permitiendo el tratamiento y prevención de

enfermedades hereditarias. Algo que ya se está haciendo a nivel de ensayos en animales de laboratorio y

células humanas, pero que en pocos años podrá aplicarse directamente sobre las propias personas. Las

primeras aplicaciones de esta tecnología en los seres humanos se se realizarán en las células de la sangre
 11

donde es relativamente más fácil transferir información dentro de las células, en comparación con los

tejidos sólidos, aunque posteriormente se podrá aplicar a cualquier tipo de célula. Una aplicación concreta

la encontramos en el estudio de procesos cancerígenos, ya que el sistema permite identificar, mejor que

con ninguna otra herramienta disponible actualmente, los genes implicados en este tipo de procesos

genéticos complejos. Del mismo modo en las enfermedades neurológicas, como algunos casos de

párkinson o alzhéimer, cuando sean debidas a trastornos genéticos o a la producción de alguna proteína

tóxica, se puede llegar a conseguir su eliminación. De esta forma toda alteración que tenga un

componente genético se puede abordar con la tecnología CRISPR para buscar una solución. En este

sentido compartimos aquí algunas de las investigaciones que se están llevando a cabo para la utilización

de esta tecnología en terapia génica, como son el tratamiento de enfermedades heredadas como la fibrosis

quística y la anemia que son causadas por mutaciones de un sólo par de bases; reemplazar células

sanguíneas defectuosas llamados hemocitoblastos de la médula ósea; encontrar soluciones a la

enfermedad de Huntington; y crear versiones sanas de células madre de pacientes con beta-talasemia.

A continuación puedes conocer otras aplicaciones interesantes de la tecnología CRISPR en el

ámbito de la salud:

Científicos de la Universidad de California en Irvine presentaron en noviembre de

2016 mosquitos modificados genéticamente para que no puedan transmitir la malaria. El objetivo es

poder liberar este tipo de mosquitos modificados genéticamente en regiones donde la malaria es

endémica, para que se puedan aparear con mosquitos silvestres y transmitir el gen de resistencia a la

infección a las generaciones siguientes, con lo que se puede llegar a conseguir que los casos de malaria se

reduzcan enormemente.

Investigadores de la Escuela de Medicina de  la Universidad de Harvard han

logrado eliminar genes dañinos de cerdos, con el objetivo de trasplantar los órganos de los animales a

personas. Para ello es necesario eliminar las marcas genéticas del animal que causarían rechazo en los

receptores humanos. Uno de los logros conseguidos es limpiar el genoma del animal de enterovirus
 12

porcino, presente en todas sus células y que, aunque inocuo para el animal, infectaría las células humanas

en el momento en que se trasplantase material genético del cerdo a una persona.

Ingenieros del MIT trabajan en un método convertir a las superbacterias o bacterias

resistentes a los antibióticos en armas contra sí mismas. La mayoría de los antibióticos actúan al

interferir con las funciones esenciales de la bacteria, como la división celular o la síntesis de proteínas,

pero algunas bacterias, como MRSA (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina) y organismos

CRE (enterobacterias resistentes a carbapenem), han evolucionado hasta convertirse en prácticamente

intratables con los medicamentos existentes. Gracias a CRISPR es posible controlar los genes específicos

que permiten a las bacterias sobrevivir al tratamiento con antibióticos.

Investigadores de la Rockefeller University están trabajando en un antibiótico más inteligente.

Estos antimicrobianos selectivos están programados para dirigirse selectivamente a las bacterias malas,

concretamente a aquellas que albergan genes de resistencia a antibióticos, mientras que dejan sin aniquilar

a los microbios inocentes que además pueden resultar beneficiosos para nuestra salud. (Bayer

Hispania,S.L. Spain., 2019)

En Agricultura, al igual que ocurre en el ámbito de la medicina, son muchas las aplicaciones que

se están pensando para la tecnología CRISPR, ya que del mismo modo se puede utilizar para luchar

contra las enfermedades que atacan a las plantas y los animales de los que nos alimentamos, e incluso

mejorarlos para que su consumo pueda resultar más beneficioso para nosotros. A todo esto hay que añadir

las ventajas que tiene la mejora genética de plantas y animales, en lo que se refiere a la posibilidad

de reducir el uso de productos químicos como los fertilizantes y fitosanitarios usados en agricultura,

además de evitar el uso de medicamentos para tratar las enfermedades del ganado, que de esta forma se

podrían eliminar con las ventajas que ello conlleva para el medio ambiente y para nuestra salud, al

eliminar sustancias que puedan resultar tóxicas para las personas. Ejemplo de ello es el trabajo que

realiza investigador chino Gao Caixia al aplicar esta tecnología para la creación de una cepa de trigo que

es resistente a la enfermedad del oídio. A esta cepa le faltan genes que producen proteínas que reprimen

las defensas en contra del oídio, para ello se borraron todas las copias de los genes del genoma hexaploide
 13

del trigo. Gracias a esta nueva cepa de trigo se espera reducir o eliminar el gran uso que se suele hacer

de fungicidas para controlar la enfermedad. Para conseguirlo se han utilizado los sistemas de edición

génica TALENs y CRISPR. Otra aplicación de esta tecnología en agricultura la encontramos en el trabajo

que realiza el un científico Yinong Yang que ha utilizado la técnica de edición genética CRISPR para

cortar varias letras de ADN del genoma del champiñón Agaricus bisporus, de forma que se ha podido

eliminar una encima que los vuelve de color marrón en lugar del color blanco que lo caracteriza.

En Alimentación gracias a la tecnología CRISPR se están creando factorías microbianas, para

producir alimentos, que no se vean afectadas por los ataques víricos, al estar vacunadas contras los

virus. Streptococcus thermophilus es una bacteria que ha sido domesticada por el hombre y que ha sido

utilizada desde principios del siglo XX en la elaboración de quesos y yogur. Estas bacterias son atacadas

con frecuencia por virus bateriófagos que pueden arruinar por completo la producción de estos alimentos.

Precisamente los investigadores de la empresa de alimentación Danisco han jugado un papel fundamental

en el desarrollo de la tecnología CRISPR, encontrando a su vez una solución a los propios problemas a

los que se enfrentaba esta industria. Igualmente esta tecnología resultará de gran utilidad para solucionar

otras problemáticas a las que se enfrenta la industria alimentaria, ya sea a nivel de mejorar genéticamente

las plantas o animales que producen las materias primas con las que se elaboran los alimentos, o a la hora

de luchar contras las plagas y enfermedades que tienen estas plantas y animales.[ CITATION Fut17 \l

2058 ]

“Imaginemos un mundo futuro en que podamos clonar al perro que se nos ha muerto, a la

vez que instalar mutaciones de ADN que confieran hipermusculatura; o cultivar supercepas de

tomates que siguen maduros mucho después de haberse recolectado, champiñones que no se

vuelven marrones después de un almacenamiento prolongado y vides inmunes a las plagas de

hongos. En el campo, en los pastos de los agricultores hay nuevas razas de ganado lechero que

conservan la misma valiosa genética resultado de cientos de años de cría selectiva, pero que,
 14

gracias a CRISPR, ya no tienen cuernos. Los cerdos que pastan cerca tienen mutaciones

especiales que los hacen resistentes a los virus y les permiten desarrollar músculos con menor

contenido en grasa. En el hospital de la ciudad más cercana, otros cerdos contienen genomas

«humanizados» manipulados selectivamente de manera que los animales puedan ser un día

donantes para seres humanos. Por increíble que parezca, todos estos inventos en apariencia

ficticios ya se han logrado con la ayuda de tecnología CRISPR, y la lista es mucho más larga”

(Doudna y Sternberg, 2017).

 15

Capítulo 2

Aplicaciones de CRISPR/Cas en biotecnología vegetal

Las potencialidades del sistema CRISPR/Cas para la biología y el mejoramiento genético

de plantas fueron comprendidas rápidamente por los investigadores y en 2013 aparecieron las

primeras publicaciones al respecto (Li et al., 2013; Nekrasov et al., 2013; Shan et al., 2013).

Particularidades del sistema CRISPR/Cas en plantas.

A diferencia de las células animales, en las plantas la pared celular constituye un

obstáculo físico entre la secuencia blanco y los componentes del sistema CRISPR, la proteína

Cas, el gARN y ADN donante para la recombinación homóloga, por lo que el sistema empleado

de entrega de estos componentes determina la eficiencia del proceso. Así, existen varios sistemas

de entrega que permiten la expresión transitoria del gen cas9 y los sgARN, la co-transformación

estable de cas9 y los sgARN o variantes combinadas de las anteriores.

La transformación genética con un vector que contiene el gARN y el gen cas9 permite la

obtención de plantas que expresan de forma estable o transitoria estos genes. El empleo de la

transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens se ha logrado en múltiples

especies de plantas, y posee como ventajas fundamentales la incorporación de un número bajo de

copias del gen de interés y ser de aplicación fácil y poco costosa, por lo que constituye el método

más utilizado.

El empleo de la microinyección, bombardeo de partículas y transformación de

protoplastos mediante polietilenglicol (PEG) se utilizan en especies donde la transformación con

A. tumefaciens no es posible.

El uso exitoso del CRISPR/Cas en plantas requiere además de la optimización de codones

y el uso de promotores adecuados para Cas, así como del sgARN, y de la adición de una señal de
 16

localización nuclear. Generalmente, la expresión de sgARN es regulada por promotores de la

ARN polimerasa III como AtU6, TaU6, responsables de la expresión de ARN de pequeño

tamaño. Igualmente, el gen cas9 se sitúa bajo la acción de promotores de ARN polimerasa II que

guían la expresión de ARN de mayor tamaño, como 35S y ubiquitina.

Dado su origen bacteriano, la expresión de la proteína Cas en el tejido vegetal no es

siempre eficiente, de ahí que se han generado múltiples versiones con optimización del uso

codones para varias especies, tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas. La mayoría de los

trabajos utilizan versiones de SpCas9 con codones optimizados para humanos (Li et al., 2013;

Miao et al., 2013) o plantas (Feng et al., 2013; Nekrasov et al., 2013; Xie y Yang, 2013).

Adicionalmente, el sistema de expresión, los sitios de restricción disponibles y los

objetivos de la investigación determinan el tipo de vector a utilizar. Así, diferentes plásmidos

pueden ser estudiados en el sitio https:// www.addgene.org/crispr/plant/. Esto se ve favorecido

con la creciente disponibilidad de vectores que contienen el sistema con diversas posibilidades

para su clonaje como los sistemas Gateway y ensamblaje de Gibson.

Los vectores virales se han empleado con éxito para la transferencia de ADN a células

animales y vegetales. Sin embargo, su uso con los componentes del sistema CRIPR/Cas9 está

limitado por el gran tamaño de la proteína Cas9, lo que dificulta su empaquetado. Una de las

aplicaciones más atractivas de los vectores virales es la entrega del ADN molde para la

reparación por RH, debido a que garantiza altas concentraciones del mismo (Wang et al., 2017).

El uso de complejos ribonucleoproteicos (RNP) Cas9-sgRNA pre-ensamblados in vitro

constituye una alternativa a esta situación y posee como ventaja que no involucra la integración

de un transgén o la inserción de fragmentos de ADN en los nuevos mutantes. En este sentido,

Woo et al. (2015) lograron la mutagénesis dirigida mediante transfección de protoplastos de

 17

Arabidopsis thaliana (L.( Heynl, Nicotiana tabacum L., Lactuca sativa L., y Oryza sativa L. con

RNP Cas9-sgRNA y el uso de PEG. Posteriormente, Svitashev et al. (2016) obtuvieron plantas

de maíz (Zea mays L.) con alelos mutados a través del bombardeo de embriones inmaduros con

RNP. Otro grupo (Liang et al., 2017) utilizó una estrategia idéntica para editar embriones

inmaduros de trigo (Triticum aestivum L.). En ambos trabajos se mostró la reducción de los

efectos off-target en comparación con células transfectadas con ADN, posiblemente debido a la

disminución del tiempo de acción del RNP, que es degradado rápidamente en la célula vegetal.

Esto último, sin embargo, resulta una limitante del empleo de RNP cuando se requiere la

expresión estable o alta de los componentes del sistema CRISPR.

Por otra parte, el diseño del gARN es crítico al afectar la eficiencia y la especificidad del

sistema CRISPR/Cas. Varios softwares está disponibles para el diseño de gARN, que utilizan

información de los genomas publicados por especies para la predicción de off-targets de cada

gRNA. Así mismo debe considerarse la presencia de sitios de reconocimiento de enzimas de

restricción en la secuencia a modificar que facilite el análisis de los resultados de la edición.

Aunque el empleo de un único sgARN permite la obtención de modificaciones, se ha propuesto

que la eficiencia de edición aumenta al emplear un mayor número de secuencias guía.[ CITATION

Mai18 \l 2058 ]

Métodos de detección de las modificaciones producidas por el sistema CRISPR/Cas

Las mutaciones generadas por el sistema CRISPR/Cas9 pueden ser de varios tipos:

heterocigóticas, homocigóticas o bialélicas (mutaciones alélicas diferentes). Los métodos para su

detección son numerosos y han sido considerados anteriormente por Zischewski et al. (2017).

Entre los más empleados se encuentra el método de PCR suprimido por digestión con enzima de

restricción (RE-PCR, del inglés: restriction enzyme digestion suppressed PCR), que identifica las
 18

mutaciones introducidas por NHEJ (Xie y Yang, 2013). Otros métodos hacen uso de nucleasas

que identifican la presencia de desapareamientos en la molécula de ADN debido a inserciones/

deleciones o sustituciones de bases nitrogenadas, como T4E7 y T7E1 de origen viral. Las

variantes de origen vegetal de estas enzimas son conocidas como ‘surveyor’, y producen un corte

con alta especificidad en el extremo 3´ del sitio de desapareamiento (Vouillot et al., 2015). Los

métodos anteriores permiten la detección de mutaciones mediante electroforesis en gel de

agarosa. Otra alternativa para la detección de mutantes es la secuenciación por el método de

Sanger de un fragmento de PCR que incluya las regiones que se deseaban modificar. La

secuenciación total del genoma mediante técnicas de próxima generación (Next generation

sequencing) permite además detectar la ocurrencia de off-targets.[ CITATION Mai18 \l 2058 ]

Mejoramiento genético

La edición de genoma por CRISPR/Cas se ha utilizado en plantas para aumentar el

rendimiento, la resistencia a microorganismos patógenos, el valor nutricional y la tolerancia a

estrés abiótico.[ CITATION Mai18 \l 2058 ]

Mejoramiento a estrés biótico y abiótico

El número de plantas resistentes obtenidas con la tecnología CRISPR/Cas aumenta cada

año (Tabla 1). La mutación de genes de susceptibilidad, que facilitan la compatibilidad

plantapatógeno, podría proveer una resistencia más duradera y de amplio espectro que la

conferida por genes de resistencia (van Schie y Takken, 2014). Ejemplo de esto lo constituye el

empleo de mutantes del gen de susceptibilidad mlo en cebada por más de 50 años en campo y

con resistencia al oídio (Blumeria graminis f. sp. hordei) (Freisleben et al., 1942). Estos genes

muestran un papel en la susceptibilidad a microorganismos patógenos que se conserva tanto en

plantas dicotiledóneas como monocotiledóneas. Así, Nekrasov et al. (2017) editaron el gen
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SlMlo1 de tomate mediante el uso de dos sgARN. Las plantas modificadas de la generación T0

mostraron deleciones de 48 pb mientras que su progenie mostró resistencia a Oidium

neolycopersici sin afectaciones en la morfología de la planta y rendimiento del fruto.

Por otro lado, Wang et al. (2014) lograron la modificación simultánea de tres alelos

homólogos del gen TaMlo-A1 de trigo. Este trabajo demostró, además, la factibilidad del uso del

sistema CRISPR en especies poliploides como es el caso del trigo hexaploide.

El gen OsERF922 es un regulador negativo de la inmunidad de O. sativa frente

Magnaporthe oryzae (Liu et al., 2012). Wang et al. (2016) utilizaron un sgARN para obtener

mutantes con cambios en el marco de lectura de este gen.

Es destacable que el silenciamiento de este gen incrementó la resistencia a M. oryzae

(Wang et al., 2016). Las líneas mutadas libres del transgén pertenecientes a las generaciones T1

y T2 mostraron una disminución de la incidencia de la enfermedad y sus características

agronómicas no resultaron afectadas. Estas líneas fueron seleccionadas mediante segregación.

Figura 4:sustitución genética

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Tabla 1:. Algunos cultivos mejorados mediante CRISPR/Cas para resistencia a microorganismos patógenos.

Fuente:. Biología Vegetal(2018).

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de Toledo et al. (2016) generaron plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) que presentaban

mutaciones que afectaban el sitio activo de la enzima SlDMR6. Una de las líneas obtenidas

mostró resistencia parcial y de amplio espectro frente a tres bacterias diferentes (Xanthomonas

gardneri Xg153, Xanthomonas perforans Xp4b, Pseudomonas syringae DC3000) y el oomicete

Phytophthora capsici LT1534.

El factor de iniciación eIF4E participa en la traducción del ARNm en eucariontes y a la

vez está relacionado con la resistencia recesiva a virus. Recientemente, Chandrasekaran et al.

(2016) utilizaron CRISPR/ Cas9 para mutar dicho gen y aumentar la resistencia a los virus

Cucumber vein yellowing virus (Ipomovirus) y los potivirus Zucchini yellow mosaic virus y

Papaya ring spot mosaic virus-W, en plantas de pepino (Cucumis sativus L.). Debido a la

naturaleza recesiva de este tipo de resistencia solo los mutantes homocigóticos mostraron un

aumento en la resistencia.

Por otro lado, Peng et al. (2017) modificaron el promotor del gen de susceptibilidad

CsLOB1 y aumentaron la resistencia a Xanthomonas citri subsp. citri. En este estudio el 42% de

las plantas mutantes tenían las modificaciones deseadas y de estas, el 23.5% mostró resistencia a

la enfermedad.

La productividad de los cultivos a nivel mundial está limitada por la existencia de

condiciones ambientales adversas como déficit hídrico, altas temperaturas, elevada salinidad y

baja calidad nutricional de los suelos. Sin embargo, el uso de CRISPR/Cas en la obtención de

variedades tolerantes a estrés biótico tiene potencialidades aun no explotadas por los

mejoradores.

Osakabe y Osakabe (2017) mostraron la mutación del gen de respuesta a estrés abiótico

OST2/AHA1 mediante el uso de gARN truncados (tru-gRNA) y Cas9 guiada por el promotor
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específico de tejido AtEF1 en A. thaliana. Los mutantes homocigóticos obtenidos mostraron un

aumento en la respuesta estomática y menor pérdida de agua que las plantas no mutadas.

[ CITATION Mai18 \l 2058 ]

Ingeniería Metabólica

Otro campo de múltiples posibilidades de aplicación de CRISPR/Cas es la ingeniería

metabólica en plantas. Al permitir la manipulación de varios genes a la vez, la edición por

CRISPR/Cas es ideal para intervenir rutas metabólicas compuestas en su mayoría por un número

elevado de productos génicos.

Por ejemplo, Alagoz et al. (2016) manipularon la vía de biosíntesis de alcaloides

bencilisoquinolínicos en Papaver somniferum L. mediante la edición del gen 4´OMT2, lo que

provocó cambios en el perfil de alcaloides derivados de esta ruta metabólica. En otro estudio, Li

et al. (2017) modificaron el gen de la diterpeno sintasa (SmCPS1) que participa en la biosíntesis

de tanshinone en Salvia miltiorrhiza Bunge, una planta medicinal. Los mutantes homocigóticos

se obtuvieron mediante transformación con Rhizobium rhizogenes y no mostraron acumulación

de tanshinone.

Recientemete , Tang et al. (2017) desarrollaron líneas de arroz con knock-out del gen

OsNramp5 que codifica para un transportador de metales. Estas líneas mostraron una baja

acumulación de cadmio en los granos sin afectaciones en su rendimiento. Este trabajo muestra

una aplicación práctica de la tecnología para la producción de alimentos con menor riesgo de

contaminación.[ CITATION Mai18 \l 2058 ]

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Perspectivas, limitaciones y cuestiones éticas

La tecnología CRISPR/Cas avanza rápidamente, y entre las principales líneas de

investigación se encuentra el aumento de la eficiencia y la disminución de los efectos off-target.

Las principales estrategias para la reducción de off-targets incluyen modificaciones en el tamaño

del sgARN, el empleo de RNP y la modificación de la proteína Cas (mutaciones puntuales,

nicasas apareadas y nicasas dimerizadas) y de su concentración (Hsu et al., 2013). Por otro lado,

la mayoría de las investigaciones emplean el silenciamiento de genes mediante la reparación por

NHEJ, mientras que la mutagénesis dirigida a través de RH resulta un desafío por su baja

probabilidad de ocurrencia en plantas y las dificultades para la transferencia de sus componentes

al núcleo de la célula vegetal (Steinert et al., 2016). Sin embargo, se han comenzado a dar

algunos pasos de avance en este sentido. Gil Humanes et al. (2017) describieron el uso de una

versión deconstruida del Virus del enanismo del trigo para la mutación simultánea de tres

homoalelos del gen de ubiquitina, con una frecuencia aproximada del 1%.

Otra línea de avance vertiginoso de las investigaciones en CRISPR/Cas es el empleo de

variantes modificadas de la proteína Cas9 como dCas9, y proteínas de fusión a Cas9. dCas9

puede utilizarse como represor de la transcripción, sin embargo, puede fusionarse a otros

represores y activadores con diferencias en su actividad (Piatek et al., 2015). La fusión de Cas9

con acetiltransferasas o metilasas de histonas ha permitido la activación y represión,

respectivamente, de la transcripción de los genes blancos (Hilton et al., 2015; Choudhury et al.,

2016). Otra variante atractiva es el uso de sondas fluorescentes con dCas9 para el marcaje in situ

de ADN y las fusiones con proteínas fluorescentes para el estudio in vivo de la dinámica de los

cromosomas (Chen et al., 2013). Sin embargo, estas variantes no han sido desarrolladas

completamente en plantas.
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En 2016 el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos no reguló el cultivo y

comercialización del champiñón (Agaricus bisporus) modificado por CRISPR/Cas9 para evitar

su fenolización (Waltz, 2016). Este pronunciamiento de una agencia reguladora permite

disminuir considerablemente el tiempo y los costos asociados a la salida al mercado de los

productos generados por CRISPR/Cas. Las posibilidades que esta tecnología brinda para la

generación de conocimientos y productos de interés agrícola, reclaman la atención de la

comunidad científica, las compañías productoras de alimentos y los organismos creadores de

políticas. El sistema CRISPR/Cas resulta especialmente significativo para los países en vías de

desarrollo, como un útil instrumento en la búsqueda de soluciones a las crisis alimentarias, los

efectos del cambio climático y la dependencia tecnológica de estas naciones. [ CITATION Mai18 \l

2058 ]
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Capítulo 4

Conclusiones

 El sistema CRISPR/Cas ha revolucionado en pocos años la biología molecular, la

medicina y la biotecnología. Este constituye además una valiosa herramienta para el

mejoramiento genético de plantas frente a microorganismos patógenos, si se considera la

dinámica de las interacciones y las dificultades de los mejoradores de plantas en la

obtención de información relevante sobre los mecanismos moleculares involucrados en la

resistencia y susceptibilidad y la modificación de genes en un tiempo breve.

 La identificación y descripción de sistemas CRISPR aun desconocidos advierte el

descubrimiento de nucleasas con diferentes especificidades, y de nuevos conocimientos

sobre la inmunidad en microorganismos. CRISPR/Cas ha abierto el camino para una

nueva era en la agricultura, donde los debates sobre la ética y las regulaciones sobre el

uso de esta tecnología determinarán su alcance en los años que están por venir.
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Bibliografía

Concepción-Hernández, M. (2018). CRISPR/Cas: aplicaciones y perspectivas para el

mejoramiento. Instituto de Biotecnología de las Plantas.

Dciencia. (2007). Qué es la tecnología CRISPR/Cas9 y cómo nos cambiará la vida. Obtenido de
https://www.dciencia.es/que-es-la-tecnologia-crispr-cas9/

Futurizable. (2017). Qué es CRISPR y por qué es tan importante para nuestro futuro. Obtenido
de https://futurizable.com/crispr/

Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M (2014). Structural basis of PAM-dependenttarg et

DNA recognitionbythe Cas9 endonuclease. Nature 513(7519): 569; doi:
10.1038/nature13579

Bayer Hispania,S.L. Spain. (2019). ¿Qué es la tecnología CRISPR?.

Obtenido de https://blog.bayer.es/que-es-la-tecnologia-crispr/