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Revisar

Nuevos conocimientos sobre los eventos moleculares de

Fertilización de mamíferos

Yuhkoh Satouh1,* y Masahito Ikawa1,2,*

Actualmente, la infertilidad afecta al 16% de las parejas en todo el mundo. Se informa que las Reflejos
causas involucran factores masculinos y femeninos, incluido el fracaso de la fertilización entre Los descubrimientos recientes de la estructura

del complejo IZUMO1-JUNO sugieren que su

los espermatozoides maduros y los óvulos. Sin embargo, los mecanismos moleculares
puente intermolecular es necesario para la unión
involucrados en cada paso de la fertilización de los mamíferos aún no se han dilucidado por completo.
entre espermatozoides y ovocitos antes de la fusión.

Aunque algunos de estos pasos pueden rescatarse con tecnologías de reproducción asistida, La complementación de Juno en ovocitos
mediada por ARNm proporciona nuevas
es importante aclarar los mecanismos moleculares involucrados para el tratamiento y estrategias para estudiar el origen de los
diagnóstico de parejas infértiles. Esta revisión ilustra hallazgos recientes en la fertilización de mecanismos de fertilización específicos de la especie.

mamíferos, descubiertos mediante la combinación de técnicas de modificación genética con

Los estudios de Gene KO en el ratón han
otros enfoques nuevos, y tiene como objetivo mostrar cómo estos hallazgos guiarán la revelado que PLCz1 es el SOAF largamente
investigación futura en la fertilización de mamíferos. buscado. Se ha dilucidado un mecanismo
independiente de PLCz1 pero

fue ineficaz en la activación de los ovocitos, así

Procesos de fertilización de mamíferos Todas las
como en el establecimiento de bloqueos a la
especies de mamíferos euterios utilizan fertilización interna [1,2]. Esto comprende muchos procesos, incluida poliespermia. Así, PLCz1 asegura la fertilización
la migración de espermatozoides a través del tracto reproductivo femenino, la capacitación de espermatozoides monospérmica en ratones.

y la reacción del acrosoma espermático, la interacción y fusión espermatozoide-óvulo, y el posterior inicio del
Teniendo en cuenta las dificultades para
desarrollo embrionario a través de la activación del óvulo. Más detalladamente, los espermatozoides eyaculados generar gametos humanos completamente
migran desde el útero hacia el istmo del oviducto a través de la unión uterotubárica y fertilizan los óvulos en la funcionales in vitro, las cepas de ratón editadas

ampolla del oviducto. Durante su migración en el aparato reproductor femenino, los espermatozoides modifican con el genoma CRISPR/Cas9 proporcionarán
plataformas esenciales para estudiar los
sus características fisiológicas y morfológicas, como cambios drásticos en su forma de onda flagelar
mecanismos de fertilización y desarrollar
(hiperactivación) y adquieren competencia para la reacción acrosomal. La reacción del acrosoma es un evento tratamientos para la infertilidad humana.
exocitótico de un gran orgánulo que contiene enzimas en la cabeza del espermatozoide y es un requisito previo
para la penetración de las matrices extracelulares del óvulo, la zona pelúcida (ZP), y para la fusión
espermatozoide-óvulo. Por lo tanto, la fertilización de los mamíferos se desarrolla en forma de cascada y los
diversos pasos son inseparables.

La identificación de los factores, genes o proteínas esenciales para los procesos es muy importante, no solo
para comprender los mecanismos subyacentes a los procesos anteriores a nivel molecular, sino también para
el diagnóstico presuntivo y el estudio de tratamientos para la infertilidad humana. Los animales con genes
knockout (KO) han contribuido de manera más efectiva a identificar los factores esenciales en estos procesos
[3,4]. Los enfoques de edición del genoma CRISPR/Cas9 ahora han acelerado la detección in vivo de genes
esenciales para la reproducción [5,6]. Más importante aún, los enfoques de edición del genoma nos permiten
1 Instituto de Investigación de Microbios
diseccionar las regiones importantes de los productos génicos a nivel de aminoácidos. Además, las mutaciones
Enfermedades, Universidad de Osaka, Suita,
derivadas de pacientes humanos también se pueden examinar en modelos animales vivos. Osaka 5650871, Japón 2
El Instituto de Ciencias Médicas, El
Universidad de Tokio, Tokio 1088639,
Esta revisión destaca los dos últimos procesos de fertilización, la fusión del espermatozoide y el óvulo y la
Japón
activación del óvulo (Figura 1, Figura clave). Ahora se han publicado informes sorprendentes sobre estos dos
procesos, combinando efectivamente análisis utilizando modelos animales y otros enfoques. Estos artículos
no solo describen las funciones precisas de los factores esenciales en los pasos de la fertilización, sino que *Correspondencia:
yuhkohs@biken.osaka-u.ac.jp (Y.
también sugieren la participación de nuevos factores y conceptos para comprender la naturaleza de la
Satouh) y ikawa@biken.osaka-u.ac.jp
fertilización de los mamíferos. (M.Ikawa).

Tendencias en Ciencias Bioquímicas, Mes Año, vol. xx, No. yy https://doi.org/10.1016/j.tibs.2018.08.006 1

© 2018 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
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Figura más importante

Procesos de activación de óvulos y espermatozoides de mamíferos

acrosoma
Reacción del acrosoma Núcleo

IZUMO1

JUNO formación de PN

Reanudación del ciclo celular

Fusión espermatozoide-óvulo

Activación de huevos

PLCÿ1
IP3ÿ Bloqueo a la polispermia

Oscilaciones de Ca2+

0 1 2 3 4 5(h)

zona pelucida

Figura 1. El análisis de eliminación de genes reveló que tanto IZUMO1 en los espermatozoides como JUNO en el óvulo son necesarios para la
fusión espermatozoide-óvulo. PLCz1 es un factor de activación de ovocitos transmitido por espermatozoides que induce oscilaciones de Ca2+ , la
reanudación posterior del ciclo celular y otros procesos posteriores a la fusión, como los bloqueos de la poliespermia. IP3, Inositol 1,4,5-trifosfato;
PN, pronúcleos.

Fusión de esperma-óvulo y conjugación IZUMO1-JUNO Los espermatozoides

euterios eyaculados migran a través del tracto reproductivo femenino y se encuentran con óvulos ovulados en la ampolla
del oviducto [1]. Durante este proceso en el ratón, el número de espermatozoides disminuye drásticamente de 106 a 107
a 10 a 100. Después de llegar a la ampolla, solo los espermatozoides que están completamente capacitados con suficiente
motilidad pueden penetrar el material circundante de los óvulos, la capa de células del cúmulo llena de ácido hialurónico
y la ZP, y finalmente fusionarse con el óvulo (Figura 1). Por lo tanto, la fusión de espermatozoides y óvulos es el objetivo
final del largo viaje del espermatozoide en el tracto reproductivo femenino, y es el proceso que determina qué
espermatozoide contribuye a la próxima generación.

IZUMO1 es la única proteína espermática que se ha demostrado que es esencial para la fusión espermatozoide-óvulo.
IZUMO1 se aisló como el antígeno del anticuerpo antiespermatozoide, OBF13, que inhibe la fusión espermatozoide-óvulo en

2 Tendencias en Ciencias Bioquímicas, Mes Año, vol. xx, No. aa

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ratones. Esta proteína transmembrana de tipo I se expresa de forma específica en los testículos y pertenece
a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Los ratones macho Izumo1 KO son completamente infértiles y sus
espermatozoides se acumulan en el espacio entre la ZP y el óvulo (espacio perivitelino) debido a la penetración
exitosa de la ZP y al fracaso de la fusión espermatozoide-óvulo [7]. Por lo tanto, esta proteína recibió el nombre
de IZUMO en honor al santuario sintoísta japonés dedicado al matrimonio. La observación en intervalos de
tiempo de espermatozoides que llevan IZUMO1 marcado con fluorescencia indicó además que IZUMO1 se
localiza en las membranas acrosómicas interna y externa en espermatozoides frescos y migra hacia la
superficie celular entre las vesículas híbridas de membrana acrosomal-plasmática externa formadas por la
reacción del acrosoma [8] . Esta exposición superficial de IZUMO1 es consistente con el hecho de que solo
los espermatozoides que reaccionan con el acrosoma son capaces de fusionarse con los óvulos [2].

El receptor para IZUMO1 en la membrana plasmática del huevo se identificó mediante la combinación de
IZUMO1 polimerizado y un enfoque de clonación de expresión iterativa utilizando una biblioteca de ADN
complementaria de huevo de ratón [9]. El receptor es una proteína anclada a glicosilfosfatidilinositol,
originalmente conocida como proteína 4 similar al receptor de folato (FOLR4), un marcador de superficie de
las células T reguladoras, pero no se ha informado ninguna función en la fertilización. Debido a que las
hembras KO del gen del receptor muestran infertilidad completa debido a la falla de la fusión espermatozoide-
óvulo, Bianchi et al. renombró el receptor JUNO en honor a la antigua diosa romana (el nombre oficial del
receptor se cambió a IZUMO1R, pero usamos JUNO en este manuscrito para evitar confusiones).
Curiosamente, JUNO desaparece de la membrana plasmática del óvulo dentro de los 40 minutos posteriores
a la fertilización, lo que sugiere su participación en el establecimiento del bloqueo de la poliespermia. Además,
se sugiere que su reconocimiento participe en la determinación de la especificidad de especie de la interacción
de los gametos [9,10].

Tanto IZUMO1 como JUNO se conservan en mamíferos euterios, incluidos los humanos. A pesar de la
sugerida interacción 1:1 de IZUMO1 y JUNO [9], aún no se han identificado dominios significativos para su
interacción.

Estructuras de IZUMO1 y JUNO

En 2016, se publicaron cinco informes sobre las estructuras cristalinas de IZUMO1 y JUNO [11–15].
Ohto et al. [11] y Aydin et al. [15] aclaró las estructuras terciarias de IZUMO1, JUNO y el complejo IZUMO1-
JUNO humanos a una resolución de nivel atómico (2,0–3,2 Å). Al mismo tiempo, nuestro grupo [13] y Han et
al. [14] resolvió la estructura cristalina del ratón JUNO, y Nishimura et al. informó de la estructura del ratón
IZUMO1 [12]. Aquí, resumimos los resultados diferentes y comunes entre estos estudios y discutimos los
problemas de las interacciones espermatozoide-óvulo que deben resolverse.

En estudios anteriores, se predijo que IZUMO1 sería una proteína en forma de bastón que consiste en hélices
a, un dominio similar a inmunoglobulina (Ig), un dominio transmembrana y una cola citoplasmática corta
(terminales N a C). Se sugirió que el extremo N de la región extracelular, denominado dominio IZUMO, estaba
implicado en la adhesión entre espermatozoides y óvulos mediante un ensayo de competición de péptidos [16,17].
La cristalografía de rayos X de la parte extracelular de IZUMO1 humano fue realizada por dos grupos [11,15].
Descubrieron que el dominio IZUMO consta de un conjunto de cuatro hélices a (a-1–4: denominado dominio
4HB), mientras que el dominio similar a Ig consta de siete láminas b varadas (b-3–9). Encontraron un par de
hojas b antiparalelas (b-1 y -2) que unen los dos dominios anteriores, denominados región bisagra (Figura 2A).

Curiosamente, Aydin et al. [15] informó que IZUMO1 tiene una forma de boomerang doblada cerca de la región
bisagra como monómero, y se observó un cambio conformacional en las regiones 4HB y bisagra cuando se
une a JUNO. La región 4HB se desplaza 20 Å hacia JUNO al unirse,

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(A)

JUNO
L81 K163
GPI
GRAMO

W148
IZUMO1 E71
W62
dominio 4HB H157
E45
R160
Región bisagra

Dominio similar aen

Ig
Huevo

TM membrana de plasma

Esperma
cola citoplasmática membrana de plasma

(B) (C)

IZUMO1 Observaciones
Ohto et al.
E71 (4HB) Puente salino con K163 JUNO
IZUMO1 JUNO
W148 (Bisagra) Conservado en la interfaz con JUNO

+ = H157 (Bisagra) Conservado en la interfaz con JUNO

R160 (Bisagra) Puente salino con E45 JUNO

Vertical Vertical
JUNO Observaciones
Aydin et al.
E45 Puente salino con R160 IZUMO1

+ = W62 Conservado en la interfaz con IZUMO1

L81 Conservado en la interfaz con IZUMO1

Bumerang Vertical K163 Puente salino con E71 IZUMO1

Figura 2. Interacción entre IZUMO1 y JUNO. (A) Estructura cristalina del IZUMO1 humano y el JUNO
El complejo de ectodominio se muestra como un diagrama de cinta (código de banco de datos de proteínas 5F4E [15]). ÿ-Hélices o láminas b en
el dominio HB, la región bisagra y el dominio similar a inmunoglobulina (Ig) de IZUMO1 están coloreados en naranja, verde y azul,
respectivamente. Los residuos que se muestran en (C) están coloreados en rojo. (B) Cambios conformacionales en IZUMO1 tras la interacción con JUNO.
Ohto et al. informó ningún cambio conformacional en IZUMO1 [11]; sin embargo, Aydin et al. informó que IZUMO1 cambia su
estructura de una forma similar a un boomerang a una conformación vertical o en ángulo recto [15]. (C) Residuos significativos en el
superficie interactiva entre IZUMO1 y JUNO sugerida a partir de ensayos de afinidad in vitro utilizando proteínas recombinantes. GPI,
glicosilfosfatidilinositol; TM, dominio transmembrana.

mientras que las regiones bisagra se desplazan 8 Å, lo que da como resultado un cambio de una forma similar a un boomerang a
una conformación en ángulo recto o vertical. Por el contrario, Ohto et al. [11] no informó de conformación
cambio de IZUMO1 sobre la unión de JUNO y la estructura permaneció en posición vertical (Figura 2B). Este
diferencia en la supuesta estructura IZUMO1 libre podría haber sido causada por una diferencia en el pH,
como se observa para otras moléculas [18]. IZUMO1 humano libre con un boomerang

4 Tendencias en Ciencias Bioquímicas, Mes Año, vol. xx, No. aa

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la conformación se cristalizó en condiciones de pH bajo (pH 4,6 [15]), mientras que las moléculas IZUMO1
libres de ratón o humanos con conformaciones más verticales se cristalizaron a pH 5,6–6,6 [11,12]. Esta
flexibilidad de la estructura IZUMO1 podría facilitar la interacción IZUMO1-JUNO y desempeñar un papel
importante durante los eventos de fusión posteriores.

Se informa que la estructura del ectodominio JUNO humano/ratón es globular, sin cambios conformacionales
tras la unión de IZUMO1 [11,13–15]. Dentro de JUNO, se confirmó que la cavidad correspondiente al bolsillo
de unión de folato era más pequeña que para otros receptores de folato, lo que es consistente con un informe
de que JUNO no puede unir folato [9].

Interacciones entre IZUMO1 y JUNO

El análisis estructural del complejo IZUMO1/JUNO proporciona información muy útil en cuanto a su interacción.
Para IZUMO1 y JUNO, se informaron los residuos de aminoácidos que residen en la superficie de interacción
y su conservación entre especies. En IZUMO1, la superficie interactiva abarca las tres regiones (4HB, bisagra
y tipo Ig), y la región bisagra comprende las partes más grandes (Figura 2A). En JUNO, la superficie interactiva
consta de una región relativamente flexible con residuos hidrofóbicos, que difiere del bolsillo de unión de
folato de otros receptores de folato.
También se informó que los residuos de aminoácidos superficiales específicos están involucrados en las
interacciones de van der Waals y los enlaces de hidrógeno entre IZUMO1 y JUNO, y estos resultados fueron
en su mayoría consistentes para los dos informes [11,15].

Los mismos grupos analizaron más los residuos de aminoácidos que afectan la interacción entre estas
moléculas para dilucidar su significado. Estos enfoques son uno de los aspectos más beneficiosos del análisis
estructural. Como resultado de su medición de las afinidades de unión entre IZUMO1 recombinante y JUNO
que portan mutaciones específicas, se demostró que E71, W148, H157 y R160 de IZUMO1 y E45, W62, L81
y K163 de JUNO son importantes para la interacción IZUMO1-JUNO. En particular, se demostró que las
mutaciones en W148 de IZUMO1 o L81 de JUNO interfieren fuertemente en comparación con otras
mutaciones (Figura 2C) [11,15].

Ohto et al. Expresó además varios IZUMO1 mutantes en células Cos-7, los coincubaron con óvulos de ratón
y encontraron que las mutaciones en la región bisagra (incluidas W148A, H157A y R160A) redujeron
significativamente el número de células unidas a los óvulos [11]. Estos ensayos basados en células permiten
evaluar el efecto de las mutaciones en las interacciones célula-célula; sin embargo, estos ensayos son
heterólogos y no se detectó fusión celular. Por el contrario, generamos ratones deficientes en Juno e
inyectamos varios ARNm de JUNO mutantes en los huevos KO para analizar si estos JUNO mutantes
rescatan la capacidad de fusión de los huevos con espermatozoides de ratón de tipo salvaje (WT). Los
mutantes de Juno se diseñaron prediciendo los sitios de unión de IZUMO1, incluido el bolsillo central
correspondiente a los bolsillos de unión de folato de otros receptores de folato. Se reveló con éxito que W62
de JUNO era necesario para la fusión de espermatozoides y óvulos, lo que indica que el bolsillo central no
está incluido en la superficie interactiva de IZUMO1 [13].

El ensayo de complementación de ARNm descrito anteriormente también nos permite evaluar si el

reconocimiento erróneo de IZUMO1-JUNO podría contribuir a la infertilidad humana. Como JUNO humano
complementado con Juno KO, los óvulos de ratón podrían ser fertilizados por espermatozoides de ratón [13],
el impacto de 120 mutaciones encontradas en JUNO humano (ExAc; http://exac.broadinstitute.org/) puede
evaluarse en huevos vivos de ratón. De manera similar, los estudios comparativos que usan JUNO de varias
especies, incluido el hámster dorado, cuyos óvulos son capaces de fusionarse con esperma de una variedad
de especies [19], nos permitirían estudiar si la interacción IZUMO1-JUNO es específica de la especie y si el
reconocimiento erróneo podría establecer un aislamiento reproductivo interespecífico.

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Otros factores en la fusión espermatozoide-óvulo Los

mecanismos moleculares subyacentes a la fusión célula-célula en general aún no se han dilucidado por completo; sin embargo, la
fusión de dos membranas celulares independientes está mediada por proteínas llamadas fusógenos que superan una barrera de

energía entre dos bicapas lipídicas opuestas [20]. Los fusógenos funcionan de manera bilateral (p. ej., receptor de proteína de unión
al factor sensible a N-etilmaleimida soluble) o unilateralmente (p. ej., subunidad HA2 de hemaglutinina del virus de la influenza) al
formar complejos de homo o heteroproteína que unen las dos membranas. A pesar de las diferencias en sus funciones, los fusógenos
comparten propiedades fundamentales: (i) sus proteínas centrales poseen una región transmembrana; y (ii) exhiben transiciones
conformacionales entre eventos pre y posfusionales, como la conversión de unión trans a cis, o una proteína que se dobla a 180.
Estas propiedades son presumiblemente necesarias para que se integren en las membranas plasmáticas y generen una fuerza para
tire de dos membranas lo suficientemente cerca para permitir la fusión [20,21].

El complejo IZUMO1-JUNO no parece satisfacer los requisitos fundamentales de los fusógenos. JUNO no es una proteína

transmembrana, y los cambios conformacionales de IZUMO1 al unirse a JUNO (Figura 2B) parecen insuficientes en comparación con
los de los fusógenos conocidos [21]. IZUMO1 es una proteína transmembrana: se propuso la dimerización de IZUMO1 a través de su
cola citoplasmática y se sugirió la participación de dicha dimerización en los cambios conformacionales de IZUMO1 [22]. Sin embargo,
la eliminación de la cola citoplasmática de IZUMO1 mediante la edición del genoma CRISPR/Cas9 reveló que solo el ectodominio de
IZUMO1 es suficiente para la competencia de fusión de espermatozoides [23]. Es importante destacar que las células Cos-7 que
expresan IZUMO1 no se fusionaron con los óvulos [11,17] y los espermatozoides WT no se fusionaron con las células HEK293 que
expresan JUNO [13], lo que sugiere que el complejo IZUMO1-JUNO funciona en la adhesión más que en la fusión per se. Esto es
consistente con la observación de que las moléculas JUNO se dislocan del sitio interactivo de los óvulos y las células que expresan
IZUMO1, mientras que IZUMO1 permaneció en el sitio incluso después del evento de unión [22].

Estos hallazgos plantean preguntas sobre si IZUMO1 participa en un complejo fusogénico y, de ser así, ¿qué fusógenos interactúan
con IZUMO1 en las membranas de espermatozoides/óvulos? Spaca6, otra proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas, se
informó a partir de un cribado de cepas de ratones transgénicos machos infértiles que muestran un fenotipo de falla de fusión [24],
pero no se informaron estudios adicionales. La participación de Spaca6 en la fusión de espermatozoides y óvulos y la relación con

IZUMO1 deben examinarse en un análisis más detallado.

Activación de óvulos y PLCz1 espermático como factor de activación de ovocitos transmitido por
espermatozoides (SOAF)
En la fertilización de mamíferos euterios, la estimulación por un espermatozoide fusionado provoca que el óvulo sufra cambios en las
concentraciones citosólicas de Ca2+ del óvulo con aumentos y disminuciones repetitivas que duran horas, lo que se conoce como
oscilaciones de Ca2+ [25]. Durante estas oscilaciones, el óvulo establece sistemas de bloqueo contra la entrada excesiva de
espermatozoides (bloqueo a la polispermia) y el óvulo comienza a formar los pronúcleos masculino y femenino. Además, comienzan
los cambios en los niveles de iones, la degradación a gran escala de los ARNm y las proteínas maternas, los cambios en la
fosforilación de proteínas y la síntesis de nuevas proteínas [26,27]. Estos procesos se denominan colectivamente activación del huevo
(Figura 1).
Se ha demostrado que el número de picos de Ca2+ afecta la calidad del desarrollo de los embriones, como sugiere la correlación de

la capacidad atenuada del espermatozoide o del óvulo para inducir oscilaciones de Ca2+ y la infertilidad humana [28,29].

La activación exitosa de los óvulos por la cabeza del espermatozoide después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides
(ICSI) y la falla de las oscilaciones de Ca2+ por parte de los inhibidores de los canales del receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3)
implicaron que un SOAF en la cabeza del espermatozoide induce las oscilaciones de Ca2+ por

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aumentando los niveles de IP3 . Aunque se han propuesto varios candidatos SOAF, no se demostró que fueran
responsables de las oscilaciones [30–32]. Sin embargo, se sugirió la fosfolipasa C zeta 1 (PLCz1) debido al hallazgo
de que la inyección de ARNm de Plcz1 inducía oscilaciones de Ca2+ equivalentes a las causadas por la entrada del
esperma [33]. Las enzimas PLC digieren el fosfatidil-inositol-4,5-bisfosfato en IP3 y diacilglicerol, pero PLCz1 es el
único que exhibe actividad bajo una concentración de Ca2+ tan baja como la que se encuentra en el citosol del
huevo (100 nM) [34]. Además, PLCz1 es una proteína específica de los testículos que se localiza en el citoplasma
de la cabeza del espermatozoide, donde un candidato SOAF ideal podría difundirse en el ooplasma después de la
fusión del espermatozoide y el óvulo. Los informes de mutaciones de PLCZ1 en pacientes infértiles con falla en la
activación del óvulo respaldan su importancia en la activación del óvulo en mamíferos [35,36].

El ratón Plcz1 KO se describió por primera vez como exhibiendo una falla en la espermatogénesis en un informe
preliminar en una conferencia. Por el contrario, dos grupos, incluido el nuestro, lograron generar ratones mutantes o
deficientes en Plcz1 utilizando el sistema CRISPR/Cas9 sin afectar la espermatogénesis.
Hachem et al. introdujo pequeños indeles productores de desplazamiento de marco en los exones de Plcz1 [37],
mientras que todos los exones que codifican Plcz1 se eliminaron en nuestro estudio [38]. Los fenotipos comunes
entre las dos líneas incluyen lo siguiente: (i) la morfología testicular, la espermatogénesis, la motilidad de los
espermatozoides, la reacción del acrosoma y la capacidad de fusión de los espermatozoides son similares a las de
los ratones WT; (ii) los espermatozoides deficientes en Plcz1 no logran inducir oscilaciones de Ca2+ después de
ICSI; pero, sorprendentemente, (iii) son capaces de activar los óvulos después de la fertilización in vivo o la
fertilización in vitro (FIV), pero con una alta incidencia de poliespermia y falla de activación, lo que da como resultado subfertilidad, no infertilidad.

La discrepancia entre el fenotipo común [enumerado como (i) arriba] y el informe preliminar anterior probablemente
se deba a artefactos como la expresión del gen PLCz1 truncado y/o el silenciamiento de genes vecinos en el estudio
inicial. Los genes Plcz1 en el genoma de los mamíferos comparten un promotor bidireccional con el gen alfa 3
(Capza3) del músculo que recubre el filamento de actina que se requiere para la espermatogénesis [39], y se informó
que las mutaciones puntuales en su región promotora causan fallas en la expresión de ambos genes [ 39]. 40]. El
sistema CRISPR/Cas9 aplicado en estudios recientes nos permitió introducir mutaciones precisas y/o grandes
deleciones para sortear estos problemas. Es importante destacar que el fenotipo común [enumerado como (ii) arriba]
revela que PLCz1 es la SOAF buscada desde hace mucho tiempo responsable de inducir las oscilaciones de Ca2+
y la activación del huevo después de la ICSI. Sin embargo, el fenotipo común [enumerado como (iii) arriba] indica
claramente que PLCz1 no es la única molécula que puede activar los óvulos de los mamíferos (Figura 3).

Activación independiente de PLCz1 Usando

un sistema de imágenes poco invasivo para embriones de mamíferos [41], visualizamos la correlación de las
oscilaciones de Ca2+ con el número de espermatozoides fusionados para cada uno de los óvulos fertilizados por
espermatozoides deficientes en PLCz1. Se observaron oscilaciones atípicas de Ca2+ con inicio tardío y disminución
del número de espigas para todos los óvulos fertilizados, y se encontró una relación incremental entre el número de
espermatozoides fusionados y el de espigas de Ca2+ , con 2,75 ± 0,64 para un espermatozoide versus 5,00 ± 2,94
para dos espermatozoides [38 ]. También se descubrió una diferencia significativa entre el número de picos de Ca2+
en los huevos que no lograron formar pronúcleos y los de los huevos con pronúcleos (2,30 ± 0,48 frente a 2,96 ±
0,56), lo que implica que el huevo de ratón requiere más de tres picos para activarse [38] . Sin embargo, Hachem et
al. informó que ninguno de los óvulos sometidos a FIV con espermatozoides mutantes Plcz1 mostró oscilaciones de
Ca2+ , mientras que 1/40 óvulos mostró un único transitorio de Ca2+ [37]. Esta aparente discrepancia entre los dos
estudios podría explicarse por el uso de diferentes técnicas de imagen, así como por el hecho de que se usaron
espermatozoides congelados y óvulos de ratón de la cepa B6 para el análisis de FIV. Se ha sugerido que los óvulos
de ratón B6 exhiben una activación espontánea a una frecuencia más alta [42] y la congelación de los espermatozoides
podría causar la pérdida de la capacidad de activación del óvulo independiente de PLCz1.

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En presencia de PLCÿ1
(espermatozoides WT)

2PN

En ausencia de PLCÿ1
(espermatozoides deficientes en PLCÿ1)
Activación fracaso del
falla desarrollo

2PN

> 3 PN fracaso del

(polispermia) desarrollo

Figura 3. Mecanismos de activación de huevos con o sin fosfolipasa C Zeta 1 (PLCz1). Sin PLCz1 transmitido por espermatozoides (inferior),
los óvulos exhiben oscilaciones de Ca2+ atípicas (inicio tardío y baja frecuencia de picos de Ca2+ ) que conducen a una mayor incidencia de
poliespermia y fallas en la activación en comparación con la activación de óvulos robusta y dependiente de PLCz1 (superior). La activación del
óvulo independiente de PLCz1 se observa solo después de la fertilización natural (in vivo o in vitro) durante las interacciones espermatozoide-
óvulo, pero no después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides. KO, nocaut; WT, tipo salvaje.

El mecanismo de activación del óvulo independiente de PLCz1 recién descubierto parece requerir la interacción
espermatozoide-óvulo. Nos recuerda las múltiples hipótesis para la activación de huevos de mamíferos propuestas
antes de la teoría SOAF [43]. En la hipótesis de la bomba de Ca2+ , los espermatozoides aportan una alta
concentración de Ca2+ para provocar la liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ en el óvulo. En el modelo de conducto
de Ca2+ , los canales iónicos en la membrana del espermatozoide facilitan la captación extracelular de Ca2+
después de la integración de las membranas plasmáticas del espermatozoide y el óvulo. En la hipótesis del receptor
del esperma, la unión de las moléculas de la superficie del esperma a los receptores específicos del óvulo activa la
PLC del óvulo unida a la membrana para producir IP3 [44]. Las diferencias específicas entre especies deben
considerarse cuidadosamente al aplicar los hallazgos sobre la deficiencia de PLCz1 a otros mamíferos, especialmente
a la infertilidad humana. Sin embargo, de manera interesante, recientemente se identificó un canal de potencial-3 de
receptor transitorio de esperma como importante para el modelo de conducto de Ca2+ de esperma en Caenorhabditis
elegans [45], y también se informó un modelo de receptor de esperma que actúa a través de la actividad Src en la
activación de óvulos de Xenopus [46 ,47]. Los ortólogos de ratón de estos genes y su participación en la activación
de huevos independiente de PLCz1 ahora se pueden examinar utilizando ratones Plcz1 KO. El aumento en la
eficiencia de activación proporcionado por el número de espermatozoides fusionados también recuerda la polispermia fisiológica que se encuentra en

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reptiles, urodelos, anuros, monotremas y marsupiales [48]. Este mecanismo puede estar enmascarado por la Preguntas pendientes
presencia de PLCz1 en ratones, pero es consistente con los aspectos evolutivos de los mecanismos de activación ¿Los componentes fusogénicos involucrados
en la fusión espermatozoide-óvulo son
del óvulo y el establecimiento del bloqueo de la poliespermia.
específicos para los gametos o se usan de
manera ubicua en otras funciones celulares?
Otra causa importante de subfertilidad de ratones macho deficientes en PLCz1 es la poliespermia. Por lo tanto, se
analizaron los dos principales mecanismos de bloqueo de la polispermia, el bloqueo de la zona pelúcida de la ¿Cómo se reclutan o regulan los componentes
polispermia (ZPBP) y el bloqueo de la polispermia de la membrana plasmática (PMBP). Después del establecimiento fusogénicos en el sitio de fusión espermatozoide-
óvulo en las células de los gametos?
de estos sistemas de bloqueo, la ZP o la membrana plasmática pierde la capacidad de unirse y/o fusionarse con los
espermatozoides. Ambos mecanismos necesitan Ca2+; se sabe que la ZPBP en particular se establece mediante
¿Es posible distinguir IZUMO/
la digestión de la proteína ZP por metaloendopeptidasa de tipo astacina (Astl). La liberación de la proteína ASTL ha Uniones intercelulares dependientes de JUNO
sido provocada por solo unos pocos picos de Ca2+ [41,49], pero la molécula de otros enlaces (no específicos), incluso en la
No se han dilucidado los mecanismos para el establecimiento del PMBP. Los comienzos de ambos condición en la que
los espermatozoides son moviles?
ZPBP y PMBP se retrasaron en óvulos fertilizados con espermatozoides deficientes en PLCz1 [38], y los ensayos
con óvulos Astl KO, que pierden completamente su ZPBP [49], mostraron claramente que la pérdida de este
En la fertilización independiente de PLCz1,
mecanismo no causa polispermia durante la fertilización in vivo en ratones [38]. Estos resultados indican que la aunque tanto PMBP como ZPBP se retrasan,
principal causa de polispermia en espermatozoides Plcz1 KO es el retraso en el establecimiento de la PMBP. así como el inicio del pico de Ca2+ , ¿el pico

Simultáneamente, este estudio mostró un descubrimiento fundamental de que la PMBP, en lugar de la ZPBP, juega retrasado de Ca2+ desencadena directamente
ambos sistemas de bloqueo?
un papel crítico en la fertilización monospérmica in vivo [38]. La importancia de ZPBP en la FIV se demostró
claramente mediante el análisis de genes KO [49], pero este es el primer estudio de la importancia de estos dos
mecanismos para la fertilización in vivo. Dado que se sabe que PMBP no se establece

en el óvulo fertilizado por ICSI, y ZPBP se

establece, el factor esencial para el
Observaciones finales Como
establecimiento de PMBP parece
se describe en esta revisión, el uso combinado de imágenes en vivo con animales manipulados genéticamente ha
ser activado o introducido a través de la fusión
proporcionado un enfoque sólido para resolver preguntas sin respuesta en el campo de la fertilización (ver también membranosa espermatozoide-óvulo, pero
Preguntas pendientes). El comportamiento de IZUMO1 marcado con mCherry durante la reacción del acrosoma se ¿participa este factor en la activación del óvulo
independiente de PLCz1?
pudo observar en espermatozoides de ratón transgénicos [8], y los desarrollos de sistemas de imágenes poco
invasivos recientes no solo permitieron la visualización de respuestas fisiológicas normales de óvulos activados [38]
sino que también permitieron nos permitió obtener crías sanas después de estas observaciones [41]. Además,
aunque durante mucho tiempo se ha propuesto que los espermatozoides experimentan la reacción del acrosoma
cuando interactúan con la ZP, las imágenes de los espermatozoides en proceso de fecundación con piezas
intermedias fluorescentes y acrosomas [50] mostraron que la mayoría de los espermatozoides en proceso de
fecundación experimentan la reacción del acrosoma antes de esto [51]. Los desarrollos recientes en las técnicas de
tomografía de coherencia óptica también nos han permitido visualizar el comportamiento de los espermatozoides
en el oviducto del ratón sin introducir ningún transgén [52].

El desarrollo de herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9 ha ampliado las vías para la investigación de la
fertilización [53]. Uno puede generar fácilmente decenas de líneas de ratones KO para detectar genes esenciales
involucrados en la fertilización [5]. Además, la mutagénesis dirigida también se puede lograr de manera eficiente
mediante la introducción de CRISPR/Cas9, así como de ADN molde en cigotos (p. ej., gen reportero knockin para
imágenes, sustitución de nucleótidos para evaluar mutaciones humanas e inserción de secuencias de etiquetas
para el ensayo de extracción de proteínas). Estos animales con genoma editado permitirán obtener información
mecanicista sobre cómo los diversos factores juegan un papel en la fertilización y nos proporcionarán modelos
animales para la infertilidad humana. Debido a que el sistema CRISPR/Cas9 se puede aplicar a una amplia variedad
de especies, esto abre el camino para investigar los mecanismos de fertilización específicos de cada especie.

Agradecimientos Este trabajo

fue apoyado por los números de subvención KAKENHI JP17K15126, Kanzawa Medical Research Foundation (a YS),

JP17H01394, JP 25112007, AMED JP18gm5010001, Takeda Science Foundation, subvención NIH P01HD087157,

R01HD088412 y Fundación Gates (a MI).

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