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metabolitos
Artículo
El análisis metabolómico revela el efecto del insecticida clorpirifos
en el metabolismo de las plantas de arroz
Qi'er Mu1,2,3, Mingxia Zhang2,3, Yong Li2,3,*, Fayun Feng2,3, Xiangyangyu2,3y Jinfang Nie1,*
Citación:Mu, Q.; Zhang, M.; Li, Y.; Feng,
F.; Yu, X.; Nie, J. El análisis metabolómico
revela el efecto del insecticida clorpirifos
en el metabolismo de las plantas de
arroz.Metabolitos2022,12, 1289. https://
doi.org/10.3390/ metabo12121289
Editor Académico: Robert D Hall
Recibido: 13 noviembre 2022
Aceptado: 14 diciembre 2022
Publicado: 19 diciembre 2022
Nota del editor:MDPI se mantiene neutral
con respecto a reclamos jurisdiccionales en
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licenses/by/ 4.0/).
Metabolites2022,12, 1289. https://doi.org/10.3390/metabo12121289
1 Facultades y universidades de Guangxi Laboratorio clave de inocuidad y detección de alimentos, Facultad de química y
bioingeniería, Universidad tecnológica de Guilin, Guilin 541004, China
2 Laboratorio clave de Jiangsu para la calidad y la inocuidad de los alimentos - Base de cultivo del laboratorio estatal
clave, Ministerio de Ciencia y Tecnología, Nanjing 210014, China
3 Instituto de Seguridad Alimentaria y Nutrición, Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangsu, 50 Zhongling Street,
Nanjing 210014, China
* Correspondencia: liyong201508@jaas.ac.cn (YL); niejinfang@glut.edu.cn (JN)
Resumen:Los pesticidas como insumos agrícolas importantes juegan un papel vital en la protección de las
plantas de cultivo de enfermedades y plagas; sin embargo, el efecto de los pesticidas sobre la fisiología y el
metabolismo de las plantas de cultivo aún no está definido. En este estudio, se investigó el efecto del insecticida
clorpirifos en tres dosis sobre la fisiología y el metabolismo de la planta de arroz. Nuestros resultados revelaron
que el clorpirifos causa estrés oxidativo en las plantas de arroz e incluso inhibe el crecimiento de las plantas y la
síntesis de proteínas y clorofila en dosis altas. Los resultados metabolómicos sugirieron que el clorpirifos podría
afectar el perfil metabólico de los tejidos del arroz y se encontraron un total de 119 metabolitos con cambios
significativos, incluidos principalmente ácidos orgánicos, aminoácidos, lípidos, polifenoles y flavonoides. En
comparación con el control, el contenido de aminoácidos de la familia del glutamato se vio significativamente
alterado por el clorpirifos, donde la prolina y el glutatión relacionados con la defensa aumentaron
significativamente; sin embargo, el ácido glutámico, el ácido N-acetil-glutámico y el ácido N-metil-glutámico se
redujeron significativamente. Muchos ácidos grasos insaturados, como el ácido linolénico y el ácido linoleico, y
sus derivados, los lisofosfolípidos y los fosfolípidos, se acumularon significativamente en los grupos de
clorpirifos, que podrían actuar como sustancias de osmolalidad para ayudar a las células de arroz a aliviar el
estrés por clorpirifos. Tres ácidos orgánicos, ácido aminobenzoico, ácido quínico y ácido fosfoenolpirúvico,
involucrados en las defensas de las plantas, se acumularon significativamente con un cambio de pliegue que
varió de 1,32 a 2,19. Además, el clorpirifos en dosis medias y altas provocó la regulación a la baja de la mayoría
de los flavonoides.
Palabras clave:clorpirifos; metabolómica; actividad fisiológica; análisis de vías; crecimiento de la planta
1. Introducción
Los pesticidas son insumos agrícolas importantes que son esenciales para proteger las plantas de
cultivo de microorganismos patógenos y plagas de insectos.1]. El clorpirifos, un insecticida
organofosforado, pertenece a los plaguicidas de segunda clase y posee una toxicidad moderada según la
clasificación de la OMS [2]. El clorpirifos podría proteger los cultivos (como hortalizas, árboles frutales,
maíz, algodón y arroz) contra una amplia variedad de plagas agrícolas [3,4]. La conocida toxicidad del
clorpirifos ocurre al inhibir la colinesterasa [5,6]. El amplio uso de clorpirifos ha resultado en que los
problemas ambientales ecológicos se vuelvan cada vez más serios [2,7]. Este insecticida tenía una vida
media que oscilaba entre 10 y 120 días en el medio ambiente [8]. Los residuos de clorpirifos en el medio
ambiente podrían migrar hacia plantas y animales no objetivo, aumentando el riesgo para la seguridad
alimentaria y la salud humana [7]. Se ha informado que el clorpirifos podría afectar la función motora del
cuerpo humano y provocar la acumulación de toxinas en el hígado debido a su toxicidad.2,9]. Además, el
clorpirifos provoca una reducción de las poblaciones de bacterias, hongos y actinomicetos e inhibe la
mineralización de nitrógeno en
https://www.mdpi.com/journal/metabolitos
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tierra [10,11]. Aunque el riesgo del clorpirifos para el medio ambiente y la salud humana,
actualmente no se dispone de información específica sobre el efecto del clorpirifos en la fisiología
y el metabolismo de las plantas.
La metabolómica es un método de alto rendimiento para identificar y cuantificar compuestos orgánicos
con bajo peso molecular (<1200 Da) en organismos, lo que podría proporcionar información crítica para
comprender las relaciones de los metabolitos con otros factores, como fenotipos y genes.12]. Recientemente, la
metabolómica se ha aplicado para investigar el mecanismo molecular de los efectos de los pesticidas en el
metabolismo de las plantas.13]. Huang, et al. informó que los pesticidas de nanocobre podrían causar un
aumento en algunas señales del sistema de defensa, como el ácido benzoico, el ácido gálico ypag-ácido
cumárico [14]. Zhang, et al. informaron que el imidacloprid podría mejorar el metabolismo de los aminoácidos
de las plantas pero inhibió el catabolismo de los sacáridos.15]. Liu et al. reveló que el herbicida butacloro afectó
principalmente las vías del metabolismo de los carbohidratos, y el bactericida triciclazol influyó notablemente en
las vías del metabolismo de los ácidos grasos.dieciséis]. Sin embargo, el efecto de la dosis de los pesticidas
sobre el crecimiento y el metabolismo de las plantas de cultivo no ha sido bien examinado.

En el presente estudio, se investigó sistemáticamente el efecto del insecticida clorpirifos en

tres dosis sobre el metabolismo de la planta de arroz. Se analizaron las actividades fisiológicas de
las plantas, incluidas las actividades de malondialdehído (MDA), proteína soluble, clorofila y
peroxidasa (POD) y superóxido dismutasa (SOD), en tejidos de arroz. El perfil metabólico de los
brotes de arroz se detectó mediante LC-QTOF/MS y se analizó mediante el software MS-DIAL. Se
identificaron metabolitos y vías metabólicas con cambios significativos para explicar el mecanismo
de respuesta del arroz al clorpirifos. El objetivo de este estudio fue examinar si el pesticida
clorpirifos afecta la fisiología y el metabolismo de la planta de arroz y cómo lo hace.

2. Materiales y métodos
2.1. quimicos
El acetonitrilo de grado HPLC se obtuvo de Merck (Darmstadt, Alemania). Clorpirifos estándar
de grado analítico (> 99 %), ácido fórmico y acetato de amonio se obtuvieron de Sigma-Aldrich
(Sydney, Australia). Todos los kits de prueba para analizar las actividades de MDA, proteína soluble
y POD y SOD se obtuvieron de Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute Co., Ltd. (Nanjing,
China). Las soluciones estándar madre de clorpirifos se prepararon en acetonitrilo y se
almacenaron en viales de vidrio color ámbar a 4◦C.

2.2. Preparación y tratamiento de plantas

el germinadooriza sativa l.las semillas se transfirieron a macetas de plántulas que contenían
vermiculita y se cultivaron utilizando solución nutritiva Hoagland (Coolaber, Beijing, China). Después de
30 días de cultivo, las plantas de arroz (N = 400) se dividieron en cuatro grupos, que se rociaron con 50
mL de agua pura que contenía clorpirifos en concentraciones de 2,0 mg/L, 5,0 mg/L y 20 mg/L, y agua
pura que contiene 10µL acetonitrilo (como grupo de control) respectivamente. Después de 48 h de
exposición, se detectó el contenido de clorofila utilizando un medidor de clorofila Plus.SPAD-502metro
(Minolta, Osaka, Japón) y se contaron 20 mediciones para el contenido de clorofila en cada grupo. Luego,
los tejidos de los brotes se recolectaron para análisis de actividad fisiológica (1 g) y análisis metabolómico
(3 g). Los tejidos de los brotes para el análisis metabolómico se congelaron rápidamente con nitrógeno
líquido, se liofilizaron, se molieron hasta convertirlos en polvo y se almacenaron a−80◦C. Existían cinco
réplicas biológicas independientes para cada tratamiento. Además, las plantas de arroz restantes (N = 20)
de diferentes tratamientos se cultivaron continuamente durante dos semanas y luego se registraron el
peso húmedo y la altura de cada planta.
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2.3. Actividades fisiológicas

La muestra de brotes frescos (0,2 g) se mezcló con solución salina normal a una proporción
de 1:9.w/v(peso:volumen), se extrajo a baja temperatura y se centrifugó durante 15 min a 8000
rpm/min y los sobrenadantes se aplicaron para medir las actividades fisiológicas, MDA, proteína
soluble y actividades POD y SOD, mediante kits de prueba de acuerdo con la instrucciones del
fabricante (ref). Existen cinco réplicas biológicas independientes para cada tratamiento.

2.4. Análisis metabolómico

Cada muestra de brotes liofilizados (0,1 g) se pesó en un tubo que contenía 4 ml de
metanol acuoso al 80 % y se agitó durante 20 min. La suspensión se centrifugó durante
10 min a 8000 rpm y se filtró con 0,22µm Filtro de membrana Millipore para análisis de
perfiles metabólicos.
El perfil metabólico de las muestras de arroz se detectó mediante LC-QTOF/MS, Shimadzu LC-20A
HPLC junto con un Sciex TripleTOF 5600+. Se utilizó una fuente de iones Electrospray DuoSpray (ESI). Una
columna Waters HSS T3 (2,1 mm×100 mm, 3,5µm) se utilizó para las separaciones cromatográficas. La
fase móvil A fue agua con ácido fórmico al 0,1% y acetato de amonio 5 mM para modos de ionización
positiva y negativa, respectivamente. La fase móvil B fue acetonitrilo. Se realizó el siguiente programa de
gradiente: 10 % B (los primeros 3,0 min), 10–95 % (3,0–21,0 min) y 10 % B (28,0–34,0 min). El modo de
adquisición dependiente de la información se utilizó para detectar los datos de espectrometría de masas
para cada muestra. Los escaneos masivos oscilaron entre 60 y 1000 m/z. El voltaje de la fuente se fijó en
5500 V y 4500 V para los modos de ionización positiva y negativa, respectivamente. La energía de colisión
(CE) se fijó en 30 V y−30 V para modos de ionización positiva y negativa, respectivamente. El volumen de
cada muestra inyectada fue de 2µL. La muestra de control de calidad que se preparó agrupando
cantidades iguales de cada muestra se detectó cada 5 muestras en las mismas condiciones
experimentales.
Todos los archivos de datos de LC-QTOF/MS se analizaron utilizando un software de código abierto MS-
DIAL. El compuesto se identificó comparando la similitud del número de masa preciso, el espectrograma de
segundo orden y el tiempo de retención en las bases de datos disponibles públicamente con la adquisición de
MS/MS dependiente de los datos, algunos de los cuales se confirmaron aún más utilizando productos químicos
estándar. La matriz del área del pico de MS en modos de ionización positiva o negativa se analizó mediante
análisis de componentes principales (PCA). El metabolito con cambios significativos se evaluó utilizando el
modelo PLS-DA con VIP mayor que 1 yt-pruebas conpagvalores inferiores a 0,05. El análisis de las rutas
metabólicas se analizó utilizando una herramienta basada en la web MetaboAnalyst (módulo de análisis de
rutas) basada en los metabolitos con cambios significativos en el grupo de clorpirifos en comparación con el
control y con referencia a la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto. Se utilizó el análisis
de correlación de Pearson para analizar la relación entre los metabolitos, los índices de crecimiento de las
plantas, las actividades fisiológicas y las dosis de clorpirifos, que se calcularon mediante la función corr() en
MATLAB. Los detalles relacionados con la adquisición y el análisis de datos se realizaron como se describió
anteriormente [17].

3. Resultados

3.1. Crecimiento vegetal y actividades fisiológicas

Las actividades fisiológicas de los brotes de arroz en los tratamientos de clorpirifos a dosis baja,
media y alta (baja, media y alta, respectivamente) y el control (CK) se muestran en la Figura1. Tanto POD
como SOD aumentaron significativamente en los grupos medio y alto, en comparación con el grupo de
control; mientras que no se encontraron diferencias significativas entre los grupos bajo y de control. El
nivel de MDA en los brotes de arroz aumentó significativamente con las dosis de clorpirifos. El contenido
de proteína en los tejidos de arroz se reguló significativamente a la baja en los grupos medio y alto en un
8,06 % y un 14,7 %, respectivamente, en comparación con el grupo de control. El contenido de clorofila
aumentó significativamente en los grupos bajo y medio, pero disminuyó significativamente en la
comparación de Alto/CK. Después de dos semanas de cultivo, el clorpirifos a dosis bajas y medias no tuvo
efecto sobre el crecimiento y el peso de las plantas, pero sí inhibió el crecimiento de las plantas a dosis
altas (Figura1f–g). Estos resultados demostraron que el clorpirifos en dosis bajas podría afectar
levemente la fisiología de la planta pero causa estrés oxidativo.
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en plantas de arroz en dosis medias y altas e inhibió el crecimiento de las plantas y la síntesis
de proteínas y clorofila en dosis altas.

Figura 1.Efecto del clorpirifos sobre el crecimiento y las actividades fisiológicas de las plantas, incluida la POD (a
), CÉSPED (b), MDA (C), proteína (d), clorofila (mi), altura de planta (F) y dispara peso húmedo (gramo). Bajo,
medio y alto indican los grupos de clorpirifos en concentraciones bajas, medias y altas, respectivamente, y CK
indica el grupo de control. Las barras con letras diferentes son significativamente diferentes (pag<0,05), que se
determinó mediante ANOVA de una vía con Tukey post hoc. Cada tratamiento incluyó cinco réplicas biológicas
independientes para análisis de POD, SOD, MDA y proteínas, y 20 réplicas biológicas independientes para
análisis de clorofila, altura de planta y peso de brotes.

3.2. Análisis de perfiles metabólicos

El análisis PCA del perfil metabólico en modos de iones positivos y negativos se muestra en la
Figura2a, donde el primer y segundo componente principal explicaron el 32,44% y el 14,73% de la
varianza total, respectivamente. Se pudo encontrar una distinción clara entre los perfiles
metabólicos de muestras pertenecientes a diferentes grupos en los gráficos de puntuación de PCA.
Con base en el MS-DIAL, se encontraron un total de 119 metabolitos con cambios significativos,
que incluyen principalmente ácidos orgánicos, aminoácidos, lípidos, polifenoles y flavonoides
(Figura2b, Tabla de información de soporte S1). Figura3mostró los metabolitos con cambios
significativos mediante el análisis de mapa de calor. En la comparación de los grupos bajo y de
control (Bajo/CK), 56 metabolitos se regularon significativamente al alza, y el uracilo, la feruloil
agmatina, el ácido 3-aminobenzoico y la arginina mostraron el mayor aumento, con un cambio
mayor a 2,0. Por el contrario, 17 metabolitos se regularon significativamente a la baja y la
espermidina tuvo la mayor disminución con 0,35 veces. Al comparar los grupos medio y de control
(Medio/CK), 74 metabolitos estaban significativamente regulados al alza, la mayoría de los cuales
eran lípidos; 39 metabolitos se regularon significativamente a la baja, y los 10 principales
metabolitos regulados a la baja fueron PE (14: 0/18: 2), ácido N-acetil-DL-glutámico, icariina, N, N-
dimetilarginina, PE (18: 0/18: 2 ), FA 16:0, ácido metilsuccínico, feruloil agmatina, PC 34:2 y ácido
linoleico (que oscila entre 0,105 y 0,693 veces).
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estaban significativamente regulados al alza e incluían principalmente lípidos y flavonoides,

mientras que FA 20:5 tuvo el mayor aumento con 4,50 veces, seguido de PC (36:3), PE (38:9), PI
(17:0/18:2) , ácido 3-aminobenzoico, FA 22:0, PI (18:1/18:2), PG (18:1/18:2), PI (18:2/18:2) y PG (17:0/
18:3); 47 metabolitos se redujeron significativamente y los 10 metabolitos principales fueron
feruloil agmatina, luteolin-7-O-glucósido, N-metil-l-glutamato, ácido metilsuccínico, biuret,
nicotinamida, L-5-oxoprolina, niacinamida, cianidina3-(2G -glucosilrutinósido) y N2,N2-
dimetilguanosina (en un rango de 0,045 a 0,072 veces).

Figura 2.(a) Análisis PCA del perfil metabólico de los brotes de arroz bajo estrés por clorpirifos: bajo,
medio y alto indican los grupos de clorpirifos en concentraciones bajas, medias y altas, respectivamente,
y CK indica el grupo de control. (b) Porcentaje de metabolitos con cambios significativos pertenecientes a
diferentes categorías.

3.3. Análisis de rutas metabólicas

Las rutas metabólicas enriquecidas en la comparación de Low/CK, Middle/CK y High/CK se
muestran en la Figura4a–c, respectivamente. Las vías metabólicas, como el metabolismo de la arginina y
la prolina, el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), el metabolismo del ácido linoleico y el metabolismo del
almidón y la sacarosa, se enriquecieron en las tres comparaciones. Además, cada comparación tenía
algunas rutas metabólicas únicas. Por ejemplo, el metabolismo de glicerofosfolípidos, el metabolismo de
tirosina, el metabolismo de histidina y la biosíntesis de alcaloides de isoquinolina se enriquecieron en la
comparación de Middle/CK. Metabolismo de aminoazúcares y nucleótidos de azúcares, metabolismo de
glicerolípidos y metabolismo de galactosa, metabolismo de triptófano se enriquecieron en la
comparación de High/CK.
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Figura 3.Análisis de mapa de calor de los metabolitos identificados en brotes de arroz, donde el
subcuadro con * indica metabolitos con diferencias significativas en comparación con el control. Bajo,
medio y alto indican los grupos de clorpirifos en concentraciones bajas, medias y altas, respectivamente,
y CK indica el grupo de control.
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Figura 4.(a) Análisis de ruta de los metabolitos con diferencias significativas en diferentes comparaciones: (a–C) son
para los tratamientos con exposición baja, media y alta a clorpirifos, respectivamente, en comparación con el control,
donde Número es el número de compuestos que coinciden con nuestros datos ypagvalores espagvalor calculado a
partir del análisis de ruta.

3.4. Análisis de correlación

Las correlaciones entre dosis de clorpirifos, metabolitos con cambios significativos e índices
fisiológicos se determinaron mediante el coeficiente de Pearson. Las dosis de clorpirifos se
correlacionaron positivamente de forma significativa con la MDA (r = 0,916,pag<0,05), POD (r =
0,486,pag<0,05), y SOD (r = 0,988,pag<0,05) y se correlacionó significativamente negativamente
con la clorofila (r =−0.703,pag<0,05), proteína (r =−0.936,pag<0.05), altura del arroz (r =−0.996,pag<
0.05), y peso (r =−0.948,pag<0,05). Además, 68 metabolitos se correlacionaron significativamente
con las dosis de clorpirifos, donde hubo 36 y 32 metabolitos para relaciones positivas y negativas,
respectivamente. En las correlaciones positivas, estos compuestos incluyeron principalmente ácido
quínico, ácido fosfoenolpirúvico, prolina, hidroquinidina y 27 lípidos (Figura4). Los compuestos con
correlaciones negativas incluyeron principalmente 8 flavonoides (homoorientina, isorhamnetina-3-
O-glucósido, cianidina 3-(2G-glucosilrutinósido), isoorientina, corimbósido, biotina, hispidulina 4'-
glucósido y peonidina-3-O-glucósido), 2 nucleósidos (N2,N2-dimetilguanosina y colina), 4
aminoácidos (L-5-oxoprolina y aspartato, ácido glutámico y N,N-dimetilglicina), 3 ácidos fenólicos y
2 vitaminas (Figura5). Además, muchos metabolitos se correlacionaron significativamente con
MDA, POD, SOD, proteína, clorofila, altura y peso del arroz.
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Figura 5.Análisis de correlación de metabolitos con actividades fisiológicas del arroz, altura de la planta (Altura)
y peso del brote (Peso) a través del coeficiente de correlación de Pearson (pag<0,05): los bloques rojo y azul
indican correlaciones positivas y negativas significativas, respectivamente, y el color blanco indica metabolitos
sin correlación significativa.

4. Discusión
Como insumos agrícolas importantes, los pesticidas juegan un papel vital en la protección de las
plantas de cultivo contra enfermedades y plagas; sin embargo, el efecto de los pesticidas en la fisiología y
el metabolismo de las plantas de cultivo sigue sin estar definido [18]. En el presente estudio, se investigó
el efecto de la dosis del insecticida clorpirifos en la fisiología y el metabolismo de la planta de arroz.
Nuestros datos revelaron que el clorpirifos podría inhibir el crecimiento del arroz en altas
concentraciones, de acuerdo con estudios previos que mostraron que tres pesticidas, benzoato de
emamectina, alfa-cipermetrina e imidacloprid, podrían afectar el crecimiento del tomate.19]. El nivel de
especies reactivas de oxígeno (ROS) mejoró cuando las plantas fueron desafiadas por varios factores
estresantes, y estas especies reactivas de oxígeno podrían causar daño a los componentes celulares.20].
Las plantas en respuesta al estallido de ROS podrían regular los sistemas de defensa antioxidantes para
producir enzimas antioxidantes, como SOD y POD, para eliminar los efectos tóxicos de ROS.17]. En
nuestros datos, las actividades enzimáticas de POD y SOD en los tejidos de arroz aumentaron con dosis
crecientes de clorpirifos, lo que indica que el clorpirifos podría causar estrés oxidativo en las plantas de
arroz. La MDA como producto final de la peroxidación lipídica de la membrana podría reflejar el grado
actual de peroxidación lipídica.21]. El contenido de MDA en los tejidos de arroz aumentó con dosis
crecientes de clorpirifos, lo que indica un aumento en la peroxidación lipídica de la membrana. Este
resultado está en línea con estudios previos que muestran que las altas concentraciones de
hidrocarburos aromáticos policíclicos llevaron a un aumento significativo en la producción de MDA, lo
que resultó en daños a las membranas celulares.22]. Tanto la proteína como la clorofila juegan un papel
importante en el desarrollo de las plantas.23]. El nivel de proteína disminuyó en los grupos medio y alto,
en comparación con el control, lo que indica que las altas concentraciones de clorpirifos ejercieron un
efecto negativo sobre la síntesis de proteínas. Los niveles de clorofila aumentaron en Low/CK y Middle/CK
pero disminuyeron en High/CK. Esto sugiere que la fotosíntesis se mejoró a bajas concentraciones de
clorpirifos y se inhibió a concentraciones más altas, lo que se denomina hormesis.24]. Nuestro resultado
está en línea con la investigación de Sáenz et al. [25], donde la fotosíntesis de las algas verdes se estimuló
en un 50% en respuesta a una baja concentración del plaguicida ciflutrina.
El análisis PCA mostró que el perfil metabólico de los tejidos de arroz se vio claramente alterado
bajo estrés por clorpirifos. Las muestras de los grupos medio y alto estaban relativamente cerca en
distancia, lo que indica que el perfil metabólico de los dos grupos era similar. Los aminoácidos juegan
muchos papeles importantes en el crecimiento y desarrollo de las plantas.26,27]. En nuestros datos,
varios aminoácidos de la familia del glutamato (glutamato, prolina, glutatión y arginina) se vieron
significativamente afectados bajo estrés por clorpirifos. Tanto la prolina como el glutatión son
importantes antioxidantes en las plantas, ya que previenen el daño celular causado por las ROS.28]. El
glutatión aumentó significativamente en respuesta al clorpirifos en tres concentraciones en comparación
con el control. Sin embargo, la prolina solo se reguló positivamente en la comparación Medio/CK y Alto/
CK. La acumulación de prolina y glutatión puede ayudar a estabilizar las enzimas y las estructuras de la
membrana bajo estrés por clorpirifos.19,29]. El ácido glutámico es
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involucrado en la asimilación de amonio de la planta [30]. Además, el ácido glutámico, un aminoácido

central, se convierte en otros aminoácidos a través de reacciones bioquímicas.31]. El ácido glutámico y
sus derivados, como el ácido N-acetil-DL-glutámico y el ácido N-metil-L-glutámico, disminuyeron
significativamente bajo estrés por clorpirifos en las tres concentraciones en comparación con el control.
La reducción del ácido glutámico y sus derivados puede indicar una disminución de la capacidad de
asimilación de nitrógeno a través de la vía de la glutamato sintasa.32]. La arginina sirve no solo como un
componente almacenado de nitrógeno en las células vegetales y el reciclaje, sino también como un
precursor de la biosíntesis de poliaminas y óxido nítrico.33]. La arginina aumentó significativamente bajo
estrés por clorpirifos en las tres concentraciones en comparación con el control, lo que puede mejorar la
resistencia de las plantas al estrés ambiental [34]. Además, los aminoácidos aromáticos (como la tirosina,
el triptófano y la fenilalanina) se encuentran entre los precursores importantes para sintetizar
metabolitos secundarios como los flavonoides y las fitohormonas.35]. El contenido de tirosina se
acumuló significativamente en Medio/CK, pero el contenido de triptófano se acumuló significativamente
en Alto/CK, lo que sugiere que la vía de síntesis de metabolitos secundarios puede verse afectada por el
clorpirifos.
Los ácidos orgánicos, los productos de la oxidación incompleta de los asimilados fotosintéticos, son
fundamentales para el metabolismo celular y juegan un papel importante en la resistencia de las plantas
al estrés.36]. Existieron diez ácidos orgánicos con aumento o disminución significativa en el grupo CP, en
comparación con el control. El ácido málico, el ácido cítrico y el ácido succínico están involucrados en el
ciclo TCA, que proporciona la energía que permite varias funciones celulares.37]. Sin embargo, estos tres
ácidos orgánicos exhibieron tendencias diferenciales. El ácido cítrico aumentó significativamente en Low/
CK y disminuyó en Middle/CK. El ácido málico aumentó significativamente en la comparación Medio/CK y
Alto/CK. El ácido succínico y su derivado, el ácido metilsuccínico, solo se redujeron en el grupo Medio/CK.
Estos hallazgos revelan que los intermediarios del ciclo TCA deberían estar asociados con el estrés
oxidativo.38]. Además, estos intermediarios del ciclo TCA están relacionados con el metabolismo del
carbono vegetal.39]. Por ejemplo, el ácido málico podría participar en la biosíntesis de aminoácidos. La
mayoría de los aminoácidos se redujeron en High/CK, lo que puede conducir a la acumulación de su
sustancia precursora, el ácido málico. Nuestro resultado está en línea con la investigación de Che-
Othman, et al. [40], donde el tratamiento con sal afecta la actividad del ciclo TCA en hojas de trigo.
Además, tanto el ácido aminobenzoico como el ácido quínico aumentaron significativamente en
respuesta al clorpirifos en las tres concentraciones en comparación con el control, y el ácido
fosfoenolpirúvico se acumuló significativamente en los grupos Medio/CK y Alto/CK. Los tres ácidos
orgánicos están relacionados con las defensas de las plantas [41]. El ácido aminobenzoico, un precursor
del ácido fólico y la coenzima Q, está involucrado en varios procesos fisiológicos desde la regulación de la
resistencia a enfermedades y la tolerancia al estrés en las plantas.42,43]. El ácido quínico, uno de los
principales intermediarios en la ruta biosintética de la mayoría de los compuestos aromáticos de las
plantas, se considera un antioxidante que elimina el estrés oxidativo.44]. El ácido fosfoenolpirúvico, un
metabolito de la glucólisis con un grupo fosfato de alta energía, ejerce efectos citoprotectores y tiene
potencial antioxidante.45].
Los lípidos como componentes importantes de las biomembranas podrían proteger a las células y sus
orgánulos de varios factores estresantes.46,47]. Los ácidos grasos son componentes básicos para la mayoría de
los lípidos celulares. [48]. En nuestro estudio, la mayoría de los ácidos grasos aumentaron significativamente
bajo estrés por clorpirifos, muchos de los cuales eran ácidos grasos insaturados. Se ha informado que el
aumento de ácidos grasos insaturados, especialmente para el ácido linolénico y el ácido linoleico, está asociado
con estrés tanto abiótico como biótico.49]. El ácido linolénico se metaboliza gradualmente a ácido jasmónico,
que podría regular el crecimiento y la resistencia de las plantas.50,51]. bronceado, et al. informaron que el Pb
podría causar estrés oxidativo en las plantas de arroz y mejoró el aumento de los ácidos grasos insaturados, lo
cual es consistente con nuestros resultados [52]. Además,
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Se identificaron muchos otros lípidos con un aumento significativo, principalmente lisofosfolípidos (LPG,
LPE y LPC) y fosfolípidos (PC, PE, PG y PI) [53]. Los lisofosfolípidos se derivan de los glicerofosfolípidos a
través de la acción de la fosfolipasa As.54]. Muchos lisofosfolípidos y glicerofosfolípidos con un aumento
significativo eran derivados del ácido linolénico y del ácido linoleico. Tanto los lisofosfolípidos como los
glicerofosfolípidos están involucrados en múltiples procesos regulatorios, como la señalización celular, el
tráfico intracelular y la captación de oxígeno activo.55]. Liu et al. informaron que los hidrocarburos
aromáticos policíclicos podrían causar un aumento en los fosfolípidos (PC y PE), lo cual es consistente con
nuestros resultados [22]. El bactericida triciclazol podría afectar notablemente las vías del metabolismo
de los ácidos grasos.dieciséis]. Por lo tanto, los datos anteriores revelan que la acumulación de ácidos
grasos, lisofosfolípidos y glicerofosfolípidos podría ser beneficiosa para las plantas de arroz para aliviar el
estrés por clorpirifos.
Los azúcares no solo proporcionan fuentes de carbono y energía para el metabolismo de las plantas, sino
que también actúan como moléculas de señalización para regular el crecimiento de las plantas.56]. En nuestros
hallazgos, se observaron tres azúcares con cambios significativos, que incluyen sacarosa, melecitosa y D-
glucosa 6-fosfato. Todos ellos aumentaron bajo estrés por clorpirifos, aunque tanto la sacarosa como la
melecitosa cambiaron en la comparación Alto/CK. El aumento de estos tres azúcares puede proporcionar
energía para resistir el estrés del clorpirifos. Además, la acumulación de estos azúcares ayudó a mantener el
equilibrio de la presión osmótica de las células vegetales bajo estrés por pesticidas [57]. Nuestro resultado está
en línea con estudios previos que muestran que tanto el mancozeb como el imidacloprid provocan un aumento
en el contenido de azúcar en los brotes de las plantas.58,59].
Los flavonoides se encuentran entre los metabolitos secundarios importantes en las plantas y
tienen muchas funciones, como regular el crecimiento celular y atraer insectos polinizadores.60]. En
nuestro estudio, se encontraron 23 flavonoides, y la mayoría de los flavonoides estaban regulados a la
baja en la comparación de los grupos Medio/CK y Alto/CK. Esto sugirió que el clorpirifos en niveles altos
puede inhibir la vía de síntesis de flavonoides en las plantas de arroz. Zhang et al. informaron que el
contenido de flavonoides en la lechuga disminuyó significativamente bajo estrés con imidacloprid y
fenvalerato, de acuerdo con los resultados de nuestro estudio [15].

5. Conclusiones
Nuestros resultados revelaron que una dosis baja de clorpirifos podría alterar ligeramente la
fisiología de la planta y que una dosis alta de clorpirifos podría causar estrés oxidativo en las plantas de
arroz e inhibir la síntesis de proteínas y clorofila. Muchas sustancias de osmolalidad aumentaron
significativamente, como la prolina y el glutatión, los ácidos grasos insaturados (ácido linolénico y ácido
linoleico) y sus derivados, los lisofosfolípidos y los glicerofosfolípidos, que podrían ayudar a las células de
arroz a aliviar el daño de la membrana del clorpirifos. La asimilación de nitrógeno a través de la vía de la
glutamato sintasa se vio significativamente afectada, y el ácido glutámico y sus derivados (ácido N-acetil-
DL-glutámico y ácido N-metil-L-glutámico) se redujeron significativamente. El clorpirifos en
concentraciones moderadas y altas podría causar la regulación a la baja de los flavonoides, que puede
usarse para eliminar especies reactivas de oxígeno producidas por el estrés del clorpirifos. Además, el
ácido aminobenzoico, el ácido quínico y el ácido fosfoenolpirúvico aumentaron significativamente, lo que
puede actuar como biomarcadores para las plantas de arroz estresadas por clorpirifos. El modelo
conceptual del efecto del clorpirifos en la fisiología del arroz y el perfil metabólico se resumió en la Figura
6. Una limitación de este estudio es explicar el efecto del clorpirifos en el metabolismo del arroz solo
utilizando datos metabolómicos. El trabajo de seguimiento analizará más a fondo el mecanismo de
regulación de los plaguicidas en el metabolismo de las plantas utilizando multiómicas, como la
transcriptómica, la proteómica y la metabolómica.
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Figura 6.Modelo conceptual del efecto del clorpirifos en la fisiología del arroz y el perfil metabólico, donde la flecha roja
hacia arriba y la flecha azul hacia abajo indican regulación hacia arriba y hacia abajo, respectivamente.

Materiales complementarios:La siguiente información de apoyo se puede descargar en:https://

www.mdpi.com/article/10.3390/metabo12121289/s1, Tabla S1: Información de los picos de MS identificados.

Contribuciones de autor:Conceptualización, YL, XY y JN; análisis formal, QM; adquisición de

fondos, YL y XY; investigación, QM y MZ; metodología, YL; administración de proyectos, QM;
recursos, QM y MZ; supervisión, FF y YL; validación, JN; redacción—preparación del borrador
original, QM; redacción: revisión y edición, QM, MZ, YL, FF, XY y JN Todos los autores han leído y
aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 32272600,
32272583, 21874032 y 21765007), y el Proyecto de Investigación Clave de Guangxi (No. GuikeAB17129003), el Fondo de
Ciencias de Guangxi para Jóvenes Académicos Distinguidos (No. 2018GXNSFFA281002) y el Gobierno Central. -Proyecto
de Desarrollo Científico y Tecnológico Local Guiado (Nº GuikeZY20198006).

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:No aplica.

Declaración de consentimiento informado:No aplica.

Declaración de disponibilidad de datos:Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el

artículo; más consultas pueden dirigirse a los autores correspondientes.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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