“Año del Fortalecimiento de la Soberanía Nacional”

LABORATORIO DE ENZIMOLOGÍA 2022-I

Tema:
Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de tripsina

Profesora de práctica: Ana Kitazono Sugahara

Número de mesa: 1

Integrantes:

1. Rivadeneyra Cardenas, Ector Adrian (20180120) - 33.33%

2. Gutiérrez Rojas, Johnny Omar (20181008) - 33.33%,
3. Quispe Huaman, Miguel Angel (20200145) - 33.33%

“Todo el mundo tiene metas o aspiraciones y todos hemos pasado por ese momento de la vida
en el que nadie creía en nosotros”
(Eminem. 2018)
Introducción:

Existen dos factores, que son en esencia, los más comunes a evaluar en un estudio
biotecnológico, la temperatura y el pH. Para poder medir el efecto de estos, es muy importante
mantener todos los otros factores en un estado constante y se evalúan por separado, es decir,
primero la temperatura con todo el resto estable y de la misma forma para el pH. El objetivo
de nuestro estudio es generar una gráfica tanto para la temperatura, como para el potencial de
hidrógeno, ambas con respecto a la actividad enzimática y con ambas representaciones, obtener
el valor para el cuál la velocidad de reacción es la mayor posible. Los datos que cumplan con
estas condiciones serán conocidos como temperatura y pH óptimo. Para nuestra investigación,
determinaremos estos valores para la enzima tripsina; sin embargo, la temperatura y pH óptimo
de una enzima, no necesariamente es el mismo para las demás (Cooper, T. 1977).

Materiales:

Equipo de laboratorio:

- Espectrofotómetro
- Baño María
- Vortex
- Pipetas
- Tubos de ensayo
- Gradillas

Reactivos:

- Buffer triz 50 mM, pH 8.2

- Solución Stock de tripsina
- BAPNA
- Ácido acético 50 mM, pH 5
- Buffer acetato 50 mM, pH 7
- Buffer Bicarbonato 50 mM, pH 10
- Buffer fosfato 50 mM, pH 12

Metodología

Rotulamos los tubos de ensayo poniendo B, M, RM.

a) Primero para la solución de BAPNA se pre solubiliza, pesamos 40 mg y agregamos 1

ml de DMSO (dimetil sulfóxido) una vez disuelto se enrasa a 50 ml con agua
destilada.
b) Preparamos una solución stock de Tripsina con 10 mg disueltos en 50 ml de HCl 1 mM
(previamente hecha) y de 2 ml de la stock enrasamos a 25 ml con agua destilada.
c) Preparar dichas soluciones, se deben añadir los siguientes reactivos que se presentan
en la tabla, en la cual se debe respetar las indicaciones y el orden establecido:

Tabla Nº1: Preparación de las soluciones B-M-RM

Reactivos B M RM
 1 ml Sol. BAPNA ✅ ✅ ✅

1 ml Agua destilada ✅ ✅ ✅

Incubar a 37ºC por 5 minutos

0.25 ml Sol. trabajo Tripsina ❌ ✅ ✅

Incubar a 37ºC por 10 minutos

Ácido Acético 35% ✅ ✅ ✅

0.25 ml Sol. trabajo Tripsina ✅ ❌ ❌

Fuente: Elaboración propia

Resultados:

Tabla Nº2: Resultados obtenidos de las mesas del Laboratorio de Química Q4 de la UNALM
Condición de Abs. M Abs. RM
ensayo

1 Agua destilada 0.014 0.013

2 Buffer Acetato 0.005 0.005

pH=5

3 Buffer Tris pH=8 0.243 0.234

4 Buffer carbonato 0.230 0.239

pH=10

5 Buffer fosfato -0.031 -0.022

pH=12

6 Buffer fosfato 0.136 0.131

pH=7
Fuente: Elaboración propia

Se conoce que la medida del paso óptico es de 1 cm y que el coeficiente de extinción molar del
nitroanilida, el cual es 7760 M-1 cm-1
Al valor negativo, se le tomará valor absoluto con el fin de facilitar los cálculos.

Tabla Nº3: Actividad enzimática de la tripsina a diferentes pH

Actividad enzimática de la la tripsina a diferentes pH
Número de mesa Condición de (U/mL)
ensayo
M RM

M1 Agua destilada 1.8041x10-7 1.6753x10-7

 pH=7

M2 Buffer Acetato 6.4433x10-8 6.4433x10-8

pH=5

M3 Buffer Tris pH=8 3.1314x10-6 3.0155x10-6

M4 Buffer carbonato 2.9639x10-6 3.0799x10-6

pH=10

M5 Buffer fosfato 3.9948x10-7 2.835x10-7

pH=12

M6 Buffer fosfato 1.7526x10-6 1.6881x10-6

pH=7
Fuente: Elaboración propia

Gráfica Nº1: Relación de la actividad enzimática de la tripsina a diferentes pH para M

Fuente: elaboración propia

Gráfica Nº2: Relación de la actividad enzimática de la tripsina a diferentes pH para RM

 Fuente: elaboración propia

Discusión:
Las enzimas presentan condiciones de actividad en determinados intervalos de pH, presentando
un valor de pH para el cual estas presentan una actividad enzimática máxima u óptima. Estos
intervalos de pH son propios de cada enzima, así como su valor de pH óptimo. Por debajo del
mínimo de pH o por encima del pH máximo, es de esperar que la enzima llegué a
desnaturalizarse provocando su inactivación. En la gran mayoría de enzimas el pH óptimo es
cercano al valor neutral de pH 7, aunque existen varias excepciones. (Cruz, 2013)
La temperatura es otro factor importante a considerar en cuanto a la medición de la actividad
enzimática. Se han encontrado diferentes rangos de pH y pH óptimo para las tripsinas
provenientes de diferentes organismos para diferentes rangos de temperatura; por ejemplo, para
la tripsina extraída de páncreas de bovino se halló un rango de pH óptimo de 8.5 a 9.5 a un
rango de temperatura de 33 a 38 °C (Quinchuela, 2013).
Para la M y RM se obtuvieron valores de actividad enzimática variables dependiendo del pH
del buffer trabajado. Siendo el menor valor de actividad enzimática y el de mayor actividad
enzimática los valores de pH 5 y 12, respectivamente. Se observa un comportamiento en forma
de campana (Graf. 1 y 2) donde se puede apreciar valores de pH de 8 a 10 donde se presenta
una mayor actividad enzimática para la temperatura de 37 °C, temperatura en la cual se debe
trabajar desde antes de agregar la tripsina hasta el final de los pasos de la práctica. Los valores
medidos y graficados se acercan a los citados por Quinchuela (2013) en el párrafo anterior. Los
valores medios entre la M y RM no se diferenciaron significativamente, por lo que se puede
decir que el trabajo no presentó muchas complicaciones en el protocolo seguido para esta
práctica.

Referencias bibliográficas:

- Cooper, T. (1977) The Tools of Biochemistry. Willey-interscience publication

- Cruz, J. (2013). Determinación de la actividad enzimática de dos enzimas comerciales
a diferentes pH, temperatura y concentración de sustrato.
- Quinchuela, L. (2013). Inmovilización covalente de la tripsina en Sepharosa
(Bachelor´s Thesis, Quito/EPN/2013).