Efecto probiótico de HLBAC en larvas de camarón blanco Litopenaeus vannamei.

González José1
Vinsotel S.A., Área de producción y departamento de Microbiología 1

Introducción:

La acuicultura es una actividad mundial y es considerada como la de mayor aporte económico

en el sector de producción de alimentos y una fuente invaluable de proteína para el consumo
humano. De acuerdo con la FAO, El requerimiento de peces, crustáceos y moluscos
provenientes de la acuicultura, han incrementado a partir del 3,9% de la producción total por
peso en 1970 a 27,3% en el 2000, en el 2014 tuvo un crecimiento del 43%, actualmente sigue
creciendo más rápido que cualquier otro sector productor de alimentos a partir de animales
(FAO, 2016). En Europa, está estimada una producción que excede de los 2,5 millones de
toneladas en el 2015 y unos 4 millones de toneladas en el 2030. La producción acuícola está
profundamente dominada en China y otros países desarrollados en la región de Asia, cual
cuenta con el 89% del volumen total.

La intensificación de la acuicultura ha permitido el desarrollo de muchas enfermedades y

problemas relacionadas al biofouling. Lo cual ha llevado a el desarrollo acelerado de productos
para el manejo de enfermedades y prevención de eventos (Lakshmi et al., 2013). Las
enfermedades de origen bacteriano siempre han sido pretexto para el uso desmesurado de los
antibióticos (Ventola, 2015). Como alternativa a ello se han desarrollado los profilácticos o
probióticos que se definen como: microorganismos vivos que administrados en cantidades
adecuadas como alimento o suplemento alimenticio tienen efectos beneficiosos sobre el
equilibrio microbiológico intestinal del hospedero (Kechagia et al., 2013; Shi et al., 2016). Hay
varios estudios que indican que los probióticos, ya sea individualmente o en combinación,
pueden mejorar el sistema inmunológico de los peces convirtiéndose en una alternativa válida
en la larvicultura de invertebrados marinos para reducir su alta mortalidad. Al respecto
Bhandari et al., (2010); Klose et al., (2010) sugieren que el aislamiento de cepas nativas
probióticas específicas de cada especie, favorece su establecimiento en el intestino y las
interacciones con la microbiota residente. En esta microbiota se encuentran microorganismos
que pueden estar cumpliendo importantes funciones para el huésped (Singh et al., 2013).

En el ecuador existe una amplia competencia de productos extranjeros en el mercado acuícola.

La urgente necesidad de encontrar cepas nativas que funcionen mejor que las extranjeras es
crucial para la industria camaronera. Además de la necesidad de optimizar el rendimiento de
probióticos en acuacultura nos ha llevado a la búsqueda intensiva de bacterias con
capacidades eficientes en lo que respecta a la colonización del tracto digestivo, competencia
con patógenos y repelencia de los mismos.

En este estudio se prueba la inocuidad de varias cepas nativas tipo Bacillus sp. en la
alimentación de larvas de camarón por ser las más frágiles del ciclo, mediante una exhaustiva
búsqueda con infección experimental, pruebas de tolerancia, antibiogramas y producción en
masa.
Materiales y Métodos

Obtención de material biológico.

Las muestras de cepas fueron obtenidas del tracto digestivo del camarón blanco silvestre
Litopenaeus vannamei. Los análisis microbiológicos y las pruebas de ensayo fueron realizados
por el departamento de Microbiología de VINSOTEL S.A.

Aislamiento de cepas tipo Bacillus

Se tomaron alrededor de 1gr de muestra de estómago de los crustáceos para la realización de

diluciones en factor 10. Los aislamientos fueron realizados en agar MRS, a diferentes
concentraciones por diluciones seriadas por el esparcimiento en placa y posteriormente
aislado por estriado. Se realizaron las respectivas revisiones de pureza de las cepas mediante
microscopia y tinciones GRAM.

Pruebas de toxicidad de cepas

Se seleccionaron las cepas de Bacillus con efecto probiótico mediante el desafío experimental
con una inoculación de 108 por cada 25 larvas de camarón en 50ml por triplicado. Se contó la
supervivencia, en nivel de color de la hepatopáncreas. El ensayo se llevó a cabo con sus
respectivos controles de melaza esterilizada y controles negativos.

Análisis de antagonismo de las cepas contra cepas patógenas.

Se realizaron pruebas de antagonismo mediante el ensayo de hoyo en placas inoculadas con

seis cepas de Vibrio. Las inoculaciones en el hoyo serán realizadas con concentraciones de:
puro, 100ppt, 10ppt, 1ppt de 10 8 de probiótico en medio de cultivo de melaza con sus
respectivos controles de melaza esterilizada y control negativo.

Pruebas en Piscinas camaroneras.

Se analizarán supervivencia, peso y talla final de tratamientos con el probiótico del HLBAC y
controles negativos.

Secuenciamiento de ADN

Las cepas puras de interés fueron enviadas al centro de Investigaciones, Concepto azul S.A.
para la respectiva extracción de ADN, Amplificación del gen 16SrRNA para el envío y
secuenciamiento de la cepa. Para la clasificación taxonómica de la cepa se usó BLASTn de NCBI
de la secuencia obtenida con una base de datos de colección de nucleótidos (nr/nt)

Pruebas de crecimiento en melaza

Para el secuenciamiento masivo se necesitó ver la curva de crecimiento de la cepa en el

sustrato para masificación. Se realizaron conteos bacterianos de UFC/ml mediante el plaqueo
de diluciones seriadas en agar MRS de tres formulaciones de medios: (a) Melaza al 10% Inóculo
al 2%, (a) Melaza al 15% Inóculo al 3%, (a) Melaza al 20% Inóculo al 4%. (Ossa et al., 2010)

Masificación de la cepa

Para la masificación se realizó un Biorreactor de capacidad de 600L hecho artesanalmente con

sello hermético de seguridad, flama de calentado hasta 100°C, termómetro sumergido y
agitador de 100RPM. Previo al inóculo de la cepa se realizaron pruebas de esterilización, los
medios pasteurizados a 100°C fueron sembrados en placas de agar peptona. Los parámetros
de sembrado fueron: inóculo del 2% en melaza al 10%, temperatura de 35°C a 100RPM por
24horas.

Resultados

Aislamiento de cepas tipo Bacillus

Se tomó 1gr de muestrea de un pool de hepatopáncreas de diez individuos de Litopenaeus

vannamei para la dilución en factor 10. Se obtuvo un total de tres cepas de Bacillus y una cepa
de hongo filamentoso. Se obtuvo un mix de lactobacillus de un fermento de avena y suero de
leche que se llamará HLBAC.

Pruebas de supervivencia de Litopenaeus vannamei PL5 frente a las cepas de Bacillus

Se seleccionaron las cepas de Bacillus con efecto probiótico mediante el desafío experimental
con una inoculación de 10 10 por cada 10 larvas de camarón en 50ml por triplicado. Se contó la
supervivencia, tomándose en cuenta el color de la hepatopáncreas como marcador del fitness
del animal.

Ilustración 1 Prueba de desafío bacteriano con inoculaciones de 10 10 de cepas de Bacillus aisladas en agar MRS. Se
observa una sobrevivencia igual al control, por acción de la cepa probiótica (mix de cepas de Bacillus con
sustrato de melaza)
Ilustración 2 Supervivencia larvaria realizado a partir de la inoculación de Probiótico (HLBAC) crecido en melaza,
administrado al 2% y 0,2% en la columna de agua.

Gracias a este ensayo se puede estimar que la concentración de melaza en el medio de

probiótico puede ser perjudicial para animal, por eso el límite máximo diluido en el agua
permisible es de 100ppm de probiótico.

Análisis de antagonismo de las cepas HLBAC contra cepas patógenas.

Se realizaron pruebas de antagonismo contra seis cepas desconocidas de Vibrio entre ellas
colonias verdes y amarillas.
Tabla 1 Efecto antagonista de la cepa HLBAC frente a cepas de Vibrio.

Cepa Probiótica Cepa patógena Inhibición

HLBAC Vibrio C2 Provoca un halo pero luego
crece el patógeno
HLBAC Vibrio C3 +
HLBAC Vibrio C5 -
HLBAC Vibrio C6.2 ++
HLBAC Vibrio C5.2 -
HLBAC Vibrio C10 No crece

Ilustración 3 Análisis de antagonismos de la cepa estudiada frente a patógenos de tipo Vibrio.

Competencia por sustrato contra cepas de vibrio.

El producto en su estado óptimo (antes de la fecha de vencimiento) puede competir por

sustrato en agar peptona contra varias cepas de Vibrio.

Secuenciamiento de ADN

Se secuenció el ADN en la empresa Concepto azul y Macrogen y la secuencia fue alineada por
BLASTn. Dando como resultado a tres cepas entre ellas Bacillus subtilis strain JF38 con el 99%
de identidad.

Entre este mix de probióticos también se encuentra una levadura del género Pichia sp donde
es considerado una especie etanólica que es el que se encarga de adecuar el medio para el
crecimiento de las otras bacterias.
Pruebas de crecimiento en melaza

El ensayo de eficiencia del medio de melaza se evaluó mediante conteo en placa de las
UFC/ml.

Ilustración 4 Ensayo de fermentación de la cepa LBAB preparado con las concentraciones indicadas.

Ilustración 5 Curva de crecimiento bacteriano a las 96 horas de inoculación.

Infección experimental:

Ilustración 6 Se probó la eficiencia de HLBAC frente al EMS en comparación con un ácido orgánico (BIOkill) (SM)
significa sin melaza.

Se evaluó por tres días la supervivencia de PL10 frente a varias condiciones de alimentación
versus la cepa virulenta C2 de Vibrio. Los resultados indican que, bajo condiciones de infección
usando probióticos con base de melaza puede aumentar el riesgo de infección. Por otro lado,
al agregar la cepa de probiótico pura sin medio el resultado es diferente.

Masificación de la cepa

Se realizó microbiología del medio pasteurizado en el tanque de acero, no se encontró

crecimiento bacteriano ni fúngico en las primeras 24h a una incubación a 35°C

Ilustración 7 Prueba de efectividad del pasteurizado. Placa de agar peptona inoculada con medio pasteurizado en el
biorreactor a las 24 horas.
Curva de crecimiento.

Se evaluó diariamente la dinámica de Lactobacillus en el Biorreactor de 600L bajo una constate

agitación de 100RPM con una temperatura de 35°C el día uno, 32°C el día dos y 29°C el día
tres.

Se realizó una tinción GRAM de una muestra fijada del producto. Se observaron isoformas de
bacterias tipo Bacillus mas otros aerobios tipo cocos.
Ilustración 8 Bacterias del producto HLBAC con tinción GRAM.

Se llegaron a masificar 400L con una producción total de 22 canecas de 5,5Gl de probióticos
tipo Bacillus a 108 para uso en piscina.

Conclusiones:

El producto HLBAC tiene un fuerte espectro bactericida contra la cepa de Vibrio C6.2 y efecto
bacteriostático contra dos cepas más. Fue evidenciado que la cepa más el medio no afecta la
sobrevivencia del animal a concentraciones hasta 200ppm en la columna de agua.

El producto aplicado directamente a algunas cepas del genero Vibrio provoca halos de
inhibición. En otras provoca un anillo de repercusión y por último crecen sobre las patógenas.

El producto aplicado a altas dosis (2%, 2ppt), puede aumentar el riesgo de proliferación de
otras cepas de bacterias patógenas debido a la biodisponibilidad de melaza como fuente de
carbono. el límite óptimo de aplicación vía alimento es de 10ppt.

Bibliografía:

Bhandari, S.K., Opapeju, F.O., Krause, D.O., Nyachoti, C.M., 2010. Dietary protein level and
probiotic supplementation effects on piglet response to Escherichia coli K88 challenge:
Performance and gut microbial population. Livest. Sci., 11th International Symposium
 on Digestive Physiology of Pigs, Part 1 133, 185–188.
https://doi.org/10.1016/j.livsci.2010.06.060
FAO (Ed.), 2016. Contributing to food security and nutrition for all, The state of world fisheries
and aquaculture. Rome.
Kechagia, M., Basoulis, D., Konstantopoulou, S., Dimitriadi, D., Gyftopoulou, K., Skarmoutsou,
N., Fakiri, E.M., 2013. Health Benefits of Probiotics: A Review. ISRN Nutr. 2013.
https://doi.org/10.5402/2013/481651
Klose, V., Bayer, K., Bruckbeck, R., Schatzmayr, G., Loibner, A.P., 2010. In vitro antagonistic
activities of animal intestinal strains against swine-associated pathogens. Vet.
Microbiol. 144, 515–521. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2010.02.025
Lakshmi, B., Viswanath, B., Gopal, S., R, D.V., 2013. Probiotics as Antiviral Agents in Shrimp
Aquaculture. J. Pathog. https://doi.org/10.1155/2013/424123
Ossa, J.A., Vanegas, M.C., Badillo, Á.M., 2010. EVALUATION OF CANE MOLASSES AS SUBSTRATE
FOR Lactobacillus plantarum GROWTH. Rev. UDCA Actual. Divulg. Científica 13, 97–
104.
Shi, L.H., Balakrishnan, K., Thiagarajah, K., Mohd Ismail, N.I., Yin, O.S., 2016. Beneficial
Properties of Probiotics. Trop. Life Sci. Res. 27, 73–90.
https://doi.org/10.21315/tlsr2016.27.2.6
Singh, Y., Ahmad, J., Musarrat, J., Ehtesham, N.Z., Hasnain, S.E., 2013. Emerging importance of
holobionts in evolution and in probiotics. Gut Pathog. 5, 12.
https://doi.org/10.1186/1757-4749-5-12
Ventola, C.L., 2015. The Antibiotic Resistance Crisis. Pharm. Ther. 40, 277–283.