Exmen del Esputo

PARTE II
Contenido a revisar

Tincin de Gram
Cultivo No BAAR
Baciloscopia
Cultivo BAAR (Lowenstein Jensen, Ogawa Kudoh, Gen Xpert)
Hongos: Pneumocitosis, Histoplasmosis, Coccidiodomicosis,
Criptococosis, Aspergilosis broncopulmonar
Tinciones para hongos
Cultivo para hongos
Parsitos:
Protozoarios: amibiasis
Nematelmintos: scaris, estrongiloidiasis
Platermintos: paragonimiasis, equinococosis
Cuidados en el manejo de las muestras
Tincin de Gram
Fundamentos Tericos

Tincin:
Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a
una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los
microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio
ptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse
claramente sin algn tratamiento previo.
De acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:

a) Tincin simple:
El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa celular.
b) Tincin diferencial:
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias
entre clulas bacterianas o entre partes de una
misma clula. Estas tcnicas utilizan mas de un
colorante o bien ciertos reactivos complementarios
para la tincin.
Ejemplos: Tincin de Gram, Tincin de Ziehl-
Neelsen, etc.
 La pared celular de la mayora de
las bacterias es nica, rgida y
con una capa de peptidoglicanos.

Tincin de Gram: es basada en la

retencin bioqumica del tinte en
el exterior de la capa.

GRAM POSITIVAS: tienen una

gran cantidad de peptidoglicanos.

GRAM NEGATIVAS: tienen

escasa cantidad de
peptidoglicanos.
Coloracin de Zeel Nelsen

Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias

contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena
larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren
la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-
cido, despus de la tincin con colorantes bsicos.
Por esto se denominan cido-alcohol resistentes.
El frotis se tie durante unos 5 min con Fucsina
fenicada aplicando calor suave.
Lavar con agua.
Coloracin de Zeel Nelsen

Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH

concentrado.
Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de
Metileno (color de contraste). Lavar y secar.

Resultados:
Bacterias Acido Resistentes: color rojo
Bacterias No acido resistentes: color azul
Medios de Cultivo
Fundamentos Tericos

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un

medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son:
Temperatura
Grado de humedad
Presin de oxgeno adecuadas
Grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.
Fundamentos Tericos

El agar es un elemento
solidificante muy empleado
para la preparacin de medios
de cultivo.
Se lica completamente a la
temperatura del agua hirviendo
y se solidifica al enfriarse a 40
grados.
Con mnimas excepciones no
tiene efecto sobre el
crecimiento de las bacterias y
no es atacado por aquellas que
crecen en l.
Medios de Cultivo comunes

AGAR NUTRITIVO:
El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente
como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy util porque
permanece solido incluso a relativas altas temperaturas.
Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias
pequeas.
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el lquido, y
aparece como una sustancia espesa, con colonias difcilmente
observables.
Agar Nutritivo
Agar Sangre

Es un medio enriquecido que se utiliza adems para

la investigacin de los diversos tipos de
hemlisis(, gamma ). Se utiliza para el
crecimiento de estreptococos.
Agar Chocolate

Se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla

al medio base. Por esta razn el agar chocolate
contiene hemoglobina, que aporta al medio un
importante elemento para el crecimiento: el factor X
o hemina termoestable.
El agar chocolate es un 15 medio destinado
principalmente al aislamiento de Neisserias
(gonococos y meningococos) y
Haemophilus, pero en l pueden crecer muchos
otros microorganismos exigentes.
Agar C.L.E.D

El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa

Electrlito Deficiente) est
recomendado para el recuento e
identificacin presuntiva de los
microorganismos de las vas urinarias.
Su bajo contenido en electrolitos evita
la invasin de los cultivos por
Proteus.
La presencia de lactosa en su
composicin le confiere el carcter de
medio diferencial, aunque la
interpretacin sea diferente al anterior
medio por la incorporacin de otro
indicador: el azul de bromotimol.
Las colonias lactosa positivas
aparecern de color amarillo y las
lactosa negativas lo harn con un color
verdoso, blanco o azulado.
Agar medio de Kligler

El agar medio de Kligler (TSI, Triple Sugar Iron) es

un medio diferencial que puede ayudarnos a
distinguir entre especies de enterobacterias de
acuerdo a su capacidad (o falta de ella) para:
a. Metabolizar lactosa, sacarosa o ambas
b. Producir acido mediante fermentacin
c. Producir gas durante la fermentacin
d. Generar acido sulfhdrico
Agar Cetrimida. Agar King

Medio de cultivo
selectivo para el
aislamiento de
Pseudomonas
aeruginosa a partir de
diversas muestras.
 Agar Schaedler

Es un medio con sangre

y vitamina K muy
adaptado para el cultivo
de anaerobios.
 Baciloscopia
Es el exmen directo de cualquier material
orgnico en busca de micobacterias (Bacilos
acidoalcohol resistentes.
Soporte de la tcnica

Elalto contenido de lpidos de la pared

celular de las Micobacterias hacen que
resistan a la decoloracin por solucin de
alcohol cido despus de la tincin.
Generalidades

Tcnica de eleccin en el diagnstico de la TB, en pases con

escasos y medianos recursos econmicos.
Ventajas:
Accesible (entrenamiento sencillo, equipo e instrumentos comunes y
medidas de bioseguridad)
Econmica (insumos de bajo costo)
Rpida (preparacin: 20 minutos. Lectura: 15 A 20 minutos)
Reproducible
Desventajas: Sensibilidad, Especificidad.
Usos: Diagnstico e implementacin del tratamiento, seguimiento
de casos y orienta la efectividad del Tx.

Limitante tcnica: expectoracin de 5,000 10,000 bac/mL

La viabilidad de los bacilos de una muestra bien
recogida y transportada, es de 48 horas.
No distingue microorganismos viables de no viables.
Todas las micobacterias se ven igual (necesario
cultivar para Dx. de certeza)
No diferencia M. Tb farmacosensibles de resistentes
Sensibilidad de la pruba

Relativamente baja: un resultado negativo no descarta la enfermedad.

(Existencia de FN).

Factores que influyen en la sensibilidad.

1) Avance de la enfermedad (S elevada 80-90% cuando existen
patrones cavitarios y decrece 50-80% en Tb que solo tienen
infiltrados en la radiografa de trax.

2) Calidad de la muestra y la tcnica

3) Tiempo dedicado a la microscopia de la lmina. (100 campos = 1%

del extendido, 200 campos = 2% y el observa 300 campos puede
suponer de 15 20 minutos. Las negativas son el mayor nmero
de lminas y mnimas las francas positivas).
 INFORME DE RESULTADOS.

NMERO DE BACILOS CAMPOS DE REPORTE

ENCONTRADOS INMERSIN
OBSERVADOS
No se observan BAAR 100 campos Negativo
en

De 1 a 9 BAAR en 100 Campos Nmero exacto

de bacilos
observados en
los 100 campos *
DE 0 -1 BAAR por 100 campos
campo en +

DE 1 10 BAAR por 50 campos ++

campo en
Ms de10 BAAR por 20 campos +++
campo en
Medios de Cultivo BAAR
Generalidades

Cultivos Lquidos a base de Huevo

Mayor sensibilidad
Menor tiempo para el diagnstico
Cultivo Ogawa Kudoh

Composicin del medio de cultivo OGAWA-KUDOH

x 1000 ml
Solucin de Sales 500 ml
Homogenizado de huevo 1000 ml
Verde de malaquita al 2% 20 ml
pH final 6.
Metodologa

El mtodo de Kudoh consiste en impregnar un

escobilln estril con la partcula til de la muestra
de esputo, introducir en un tubo con hidrxido de
sodio al 4%, durante dos minutos exactos e inocular
por presin y rotacin del escobilln en el medio de
Ogawa. E
Cultivo Lowenstein Jensen

La formulacin de este medio es

relativamente simple, requiere de
suplementos para el soporte de
crecimiento de micobacterias.
La mezcla de glicerol y huevo son
adicionados para espesar el medio.
Estas sustancias proporcionan
protenas y cidos grasos necesarios
para el metabolismo de las
micobacterias. La coagulacin de la
albmina del huevo durante el proceso
de esterilizacin proporciona un medio
slido para la inoculacin de muestras.
El verde de malaquita inhibe
parcialmente el desarrollo bacteriano.
Cultivo : informe de resultados
Informe del Resultado
Contaminado Todos los tubos inoculados con la
muestra se han contaminado
Negativo Sin desarrollo luego de la inspeccin de
la octava semana de inoculacin

Numero de Colonias Entre 1 y 19 colonias en el total de

exacto medios sembrados

+ 20 a 100 colonias
++ Mas de 100 colonias (Colonias
separadas)
+++ Colonias incontables (Colonias
confluentes)
Gen Xpert
Generalidades

Prueba molecular automtica para identificar MTB y

resistencia a R

Usa un ensayo de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

En tiempo real anidado para amplificar una secuencia especifica
del gen rpoB del MTB.

Se realiza en una plataforma que integra el procesamiento

de las muestras y el PCR al interior de un cartucho plstico
conteniendo todos los reactivos necesarios para realizar la lisis
Bacteriana a extraccin de cido nuclico, amplificacin y
deteccin del amplicon.
Xpert MTB/RIF
Ventajas

Tiempo de entrega de resultados: 2 horas

Deteccin de Resistencia a la Rifampicina
Mayor sensibilidad que la baciloscopia
Descentralizacin de la prueba (siempre que se garantice temperatura y
electricidad)
No genera aerosoles ( no se necesitan reas especiales)
Bioseguridad = baciloscopa

Desventajas
Costos
Xpert MTB/RIF (Cepheid
Sunnyvale, CA)

Sensibilidad
91% a partir de un cultivo
99 % muestra positiva
72 % muestra negativa
95% resistencia a R

Especificidad
99% para TB
98.4% para resistencia a R
 Neumocistosis

La neumocistosis es una infeccin causada por el hongo

oportunista pneumocystis jirovecii. Es una enfermedad
cosmopolita y afecta principalmente a pacientes
inmunocomprometidos, sobre todo a aquellos
infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH). Aunque usualmente el hongo se encuentra
restringido a los pulmones, se ha demostrado su
presencia en rganos como ganglios linfticos, bazo,
hgado, mdula sea y corazn.
Etiologa

Pneumocystis jirovecii es un hongo unicelular,

extracelular, que difcilmente se desarrolla en
cultivos celulares y no es cultivable en medios
sintticos.
Una caracterstica estructural de inters y que lo
diferencia del resto de los hongos, es la presencia de
colesterol en la membrana celular. La ausencia de
ergosterol explica su resistencia natural a la
anfotericina B y a los azlicos.
Diagnstico Microbiolgico

P. jirovecii no es cultivable in vitro.

La base para el diagnstico de la neumocistosis
es la visualizacin de las formas trficas y
qusticas de este patgeno en las muestras
obtenidas de los pacientes.
Los productos tiles son lquido de lavado
broncoalveolar (LBA), esputo espontneo o inducido y la
biopsia pulmonar o de otro tejido en caso de sospecha
de una infeccin extra-pulmonar.
Frotis e Histopatologa

Las preparaciones fijas de extendidos (frotes), las

citologas o los cortes histolgicos, deben ser teidos
con tinciones como
Azul de toluidina (muestra afinidad por los componentes de
la pared de las formas qusticas, colorendolas de violeta rojizo),
Giemsa (identifica tanto formas trficas como qusticas,
coloreando los ncleos de rosado los ncleos contrastando con
el azul que adquiere el citoplasma) o
Gomori-Grocott (que tie de color marrn oscuro la pared de
ambas morfologas) y es una tcnica considerada de referencia
para la identificacin de P. jirovecii en los lquidos
broncoalveolares
 HISTOPLASMOSIS

Histoplasma capsulatum, hongo dimrfico, es el

agente etiolgico de histoplasmosis, una micosis
sistmica endmica en zonas tropicales,
subtropicales y templadas. El hongo se desarrolla en
suelos con abundante materia orgnica - excremento
de aves (entre estas pollos, gansos, pavos, algunas
aves migratorias) y guano de murcilagos en
ambientes cerrados, tales como minas, cuevas,
cavernas, tneles, criptas de iglesias y casas
abandonadas, o en espacios abiertos, entre ellos
parques y paseos pblicos.
Morfologa

Histoplasma capsulatum es un hongo dimfico termodependiente:

crece en forma filamentosa a 25C y en forma de levadura a 37C, por lo
que las caractersticas morfolgicas varan segn la temperatura en la
que se desarrolle el hongo:
A 25C y en agar dextrosa Sabouraud, las colonias crecen
lentamente y van de una apariencia granular a algodonosa.
El color es blanco inicialmente (colonias tipo A) y por lo general se
transforman en marrn claro con la edad (colonias tipo B);
En el reverso la colonia puede presentar un color que va del amarillo al
anaranjado.
El hongo es resistente a la cicloheximida, por lo que los medios de
cultivo podrn contener ese antimicrobiano.
El desarrollo de H. capsulatum se ve favorecido en agar
infusin cerebro-corazn
 COCCIDIOIDOMICOSIS

La coccidioidomicosis o fiebre del valle de san

joaqun es una micosis sistmica causada por los
hongos dimorfos coccidioides immitis o C.
Posadasii. Se adquiere por inhalacin de
artroconidios y es una infeccin usualmente
benigna, pero en aquellos pacientes cuya inmunidad
est comprometida, es severa y fatal. Adems de
enfermedad pulmonar, la coccidioidomicosis puede
diseminarse y causar infecciones en prcticamente
cualquier rgano, pero con mayor frecuencia invade
sistema nervioso central (SNC), huesos (en especial
articulaciones), tejido subcutneo y piel.
Morfologa

Es un hongo dimrfico.
La fase micelial con produccin de artroconidios son
las estructuras que se encuentran en la naturaleza
(forma infectante), en los cultivos de laboratorio e
infrecuentemente en tejidos del hospedero infectado.
Exmen Microbiolgico

Examen directo en fresco.

Puede efectuarse aclarando el esputo con KOH al 15% durante 10 min
u observando directamente productos como lquido de lavado
bronquial, lquido cefalorraqudeo o lquido purulento producto de la
fistulizacin de ndulos subcutneos.
La observacin al microscopio de esfrulas con endosporas
en su interior, es confirmatoria de la micosis.
Cultivo : agar dextrosa Sabouraud con cicloheximida,
incubndose a 25-30C y en siete das podrn observarse las
siguientes caractersticas:

Macroscopa. Al tercer da la colonia es glabra, despus vellosa y

luego francamente algodonosa, de color blanco grisceo o amarillento.
 CRIPTOCOCOSIS

La criptococosis es una micosis sistmica aguda,

subaguda o crnica, inicialmente pulmonar causada
principalmente porcryptococcus
neoformans (vars. Neoformans y grubii)
y cryptococcus gattii. La forma pulmonar es
generalmente transitoria, leve y no reconocida.
Estado anamorfo
Estado Teleomorfo
(asexual)
Diagnstico Microbiolgico

Examen directo en fresco con tinta china o

nigrosina.
Revela una clara aureola, imagen debida a la cpsula, en
torno a las clulas de Cryptococcus. Muy
ocasionalmente pueden observarse seudomicelios.
El esputo y el pus, pueden mezclarse con una solucin al
10% de hidrxido de sodio antes del examen. En un
espcimen apropiadamente preparado, las clulas del
pus y desechos celulares digeridos delinean la cpsula,
la cual es resistente al hidrxido.
Cultivo. Cryptococcus
neoformans/C. gattii son fciles
de cultivar en los medios
convencionales (Sabouraud
dextrosa, malta dextrosa,
papa dextrosa), adicionados
con cloranfenicol y sin
cicloheximida.
Los cultivos se mantienen a
30C y a 37C, al menos
durante una semana.
El cultivo levaduriforme es
inicialmente blanco, pero
posteriormente se torna beige y
marrn-amarillo.
Aspergilosis Pulmonar
Diagnstico Microbiolgico
Si hay exudados se debe hacer examen directo, frotis y
cultivo.
El examen directo aclarado con hidrxido de potasio o
teido con un colorante simple, en ocasiones permite
visualizar las hifas hialinas y septadas y las cabezas
aspergilares.
Tincin para Hongos
 Cultivo para hongos

Los medios de cultivo ms empleados en

micologa pueden agruparse en dos categoras
en funcin de su utilidad:
Aislamiento e Identificacin.
Aislamiento

la utilizacin de 3-4 medios prcticamente cubre

todas las necesidades:
-AGS con/sin antimicrobianos;
- Un medio con cicloheximida
- Agar infusin cerebro corazn, para las micosis
sistmicas endmicas.
Identificacin

Puede ser necesario un nmero mayor de medios

que depender del nmero de muestras, las
etiologas ms probables en la zona geogrfica, las
posibilidades del laboratorio y el nivel diagnstico
esperable segn el tipo de centro.
IMPORTANTE

El cultivo se tarda en dar resultados en 3-4 semanas.

En promedio las colonias pueden verse alrededor de
los 7 das.
En ocasiones es necesario cultivar ms de una
muestra debido a que puede ser contaminada,
incluso con especies de Candida.
Medios de Cultivo

Agar Czapek
Se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos,
especialmente Aspergillus spp. y Pe-nicillium spp. Es el
medio de referencia para la identificacin de

Dox Aspergillus spp.

Agar de papa
Se utiliza para la estimulacin de la formacin de
produccin de pigmentos: rojo en Trichosporum
rubrum, rosa salmn en Microsporum audouinii y

dextrosa amarillo en Microsporum canis.

Agar Dixon
Utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puede
modificarse aadiendo clo-ranfenicol o bien
cloranfenicol y cicloheximida.

modificado
Agar Sabouraud + Es el medio estndar para el aislamiento,
esporulacin y conservacin de muchos hongos.
Glucosa modificado
por Emmons:

Puede utilizarse como medio enriquecido para facilitar

Agar infusin de el crecimiento de C. neoformans a partir de
muestras.
cerebro corazn En general, est indicado para el aislamiento de una
gran variedad de patgenos, incluyendo levaduras,
mohos y bacterias como Nocardia.

Se utiliza en el aislamiento de hongos sensibles a la

Agar inhibidor de cicloheximida ( Cryptococcus, zigo-micetos, etc.)
a partir de muestras contaminadas.
mohos Permite el desarrollo de la mayora de los mohos y de
las levaduras
 Agar Sabouraud Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de
hongos patgenos a partir de muestras muy

con cicloheximida contaminadas con hongos saprofitos y bacterias.

Inhibe algunas especies de hongos de inters mdico

y cloranfenicol: ( Candida no albicans, Aspergillus, zigomicetos, C. neofor-

mans, etc.).

Se utiliza en la identificacin de algunos dermatofitos,

Agar urea de especialmente y de algunas levaduras ( C. neoformansTri-
chophyton rubrum de Trichophyton

Christensen mentagrophytes).

Medios Cromocandida contienen diversos sustratos enzimticos que

estn unidos a compuestos cromognicos. Muy til para el

cromognicos estudio de levaduras.

para levaduras
 Medio utilizado para el aislamiento de
Dermatophyte dermatofitos en muestras muy
contaminadas, proporcionando una
test medium identificacin presuntiva.

Agar harina de Se utiliza en el cultivo y diferenciacin de

especies de Candida basndose en las
maz con/sin caractersticas miceliales.
Tween 80:
Medio conteniendo leche, harina de trigo, y
miel. Adems contiene inhibidores lo que
Agar Lactrimel impide el desarrollo de Bacterias :(E.Coli y
cocceas : S.aureus)
Parsitos
Identificacin directa del microorganismo

Ameba Ascaris Estrongiloides

Lumbricoides
Identificacin Directa del Microorganismo

Paragonimus Equinocococis
 CUIDADOS EN EL MANEJO DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO.

Lavado de dientes y Una muestra representativa

enjuague de la boca y la contiene <10 clulas
orofaringe. epiteliales y >25 PMN.

Recoger solo el material que La presencia de flora mixta

provenga de las vas areas abundante sugiere
inferiores. contaminacin.

Inicialmente la muestra debe

La ausencia de neutrfilos y
de observarse con tincin de
bacterias de una muestra
Wright, para establecer si se
representativa, sugiere
trata de una muestra
adecuada.
infeccin no bacteriana.
 CUIDADOS EN EL MANEJO DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO.

La forma de recoger el Conviene que antes la

esputo depende de la persona realice en
finalidad perseguida. cepillado de la cavidad de
los dientes y el lavado de
Para la investigacin la boca.
microbiolgica debe de
ser recogido en un frasco Este requisito es
de boca ancha, estril, indispensable si se
provisto de tapa investigan espirilos y
esmerilada. hongos.
 CUIDADOS EN EL MANEJO DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO.

El material deber ser

Para la investigacin de
enviado lo ms pronto
clulas neoplsicas por el
posible. mtodo de inclusin del
esputo, la tcnica es la
En nios es necesario siguiente:
recurrir a maniobras Lavado y cepillado de la boca.
especiales. Recolectar de 60-100 cm en
un frasco de boca ancha.
El frasco debe contener 96 de
alcohol.
Deben desecharse los primeros
esputos de la maana.
GRACIAS!!!!!!!!!!!!!!!