Facultad de Ciencias de la Vida

Departamento de Ciencias Biológicas

BIOL252

Crecimiento bacteriano
Medios de Cultivo
Metabolismos

Dr. Cristóbal Mujica T.

cr.mujica@uandresbello.edu
 Algunas definiciones
ü Crecimiento: Aumento del número de individuos en una población de microorganismos.
ü Medio de cul9vo: Solución acuosa o sólida, que con9enen los nutrientes apropiados para el
crecimiento de microorganismos.
ü Colonia: Población de células que se desarrolla en medio sólido a par9r de una única célula y que es
visible en forma macroscópica.
ü Cul9vo: Grupo de organismos que crece en un medio de laboratorio (medio de cul9vo).
ü Cul9vo puro: Cul9vo que con9ene solo un 9po de microorganismo.
ü Cul9vo mixto: Cul9vo que con9ene más de un 9po de microorganismo.
ü Respiración:
Metabolismo bacteriano
Metabolismo:
“Conjunto de reacciones bioquímicas que se realizan al
interior del organismo”

Sustrato Biodegradación Productos

Reacciones degradativas: Proporcionan energía (Rx. Catabólicas)

Reacciones sintéticas: Proporcionan componentes estructurales

(Rx. Anabólicas)

Macromoléculas y otros
Monómeros Biosíntesis comoponentes celulares
 Metabolismo bacteriano: Enzimas

H2O2 H2O + O2 > años

E
H2O2 H2O + O2 < seg.

Las enzimas son proteínas catalíticas (biocatalizadores) que disminuyen la energía de activación requerida para que
ocurra una reacción química.

Energía de activación: energía necesaria para juntar las moléculas reactantes (sustratos) de la manera adecuada de
modo que alcancen el estado de transición.
Metabolismo bacteriano: Enzimas ➜ Catabolismo ➜ Obtención de Energía
Catabolismo: Obtención de Energía
Reacciones de óxido-reducción

Reacciones que se dan entre un dador de electrones y un aceptor de

electrones.

El dador de electrones se considera una fuente de energía.

¿Por qué?

Además existen transportadores de electrones, por ejemplo NAD+.

¿Dónde parDcipa?

Glicólisis o glucólisis: Ruta de Embden-Meyerhof

Ciclo de Krebs o ácidos tricarboxílicos (ATC)

Sistema de transporte de electrones.

 Por qué los
microorganismo
producen energía?
División Bacteriana: Fisión Binaria

Se requiere coordinación
espacial y temporal
(secuencial) en la síntesis de
macromoléculas:

DNA
Proteínas
Hidratos de Carbono
Lípidos

Reflejado (poblacionalmente)
por un aumento en el número
de organismos presentes

El tiempo requerido para la duplicación bacteriana es variable para cada especie

(Ej: 20 min para Escherichia coli; 24 horas para Mycobacterium tuberculosis)
División Bacteriana: Definiciones

Crecimiento: Aumento del número de individuos (M.O.) en una

población.
Implica un aumento de la biomasa del M.O.

Velocidad de crecimiento: Crecimiento de un M.O. por unidad de

tiempo.
Tiempo de generación (g): Tiempo requerido para que se formen
dos células hijas a partir de una célula parental. Es el tiempo
necesario para que la población bacteriana se duplique.

Implica la duplicación de todos los componente

estructurales de la célula
División Bacteriana: Crecimiento Exponencial
División Bacteriana: Crecimiento Exponencial
Medición de crecimiento bacteriano
Medición de crecimiento bacteriano: Recuento total de células

A) Recuento total de células:

Conteo directo bajo el microscopio usando una muestra

(diluida) de cultivo bacteriano y una cámara de recuento
calibrada (Petroff-Hausser).

Este método no discrimina la viabilidad de las bacterias en la muestra.

Medición de crecimiento bacteriano: Recuento total de células
Medición de crecimiento bacteriano: Recuento total de células
Medición de crecimiento bacteriano: Recuento total de células

Recuento total de células

DESVENTAJAS

ü Las células muertas no se dis9nguen de las células vivas.

ü Las células pequeñas son diOciles de ver al microscopio y
algunas de ellas probablemente no se cuenten.
ü Se requiere 9empo y habilidad para conseguir precisión por
este método.
ü Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando la
muestra no está teñida.
ü No es un método recomendable cuando la suspensión de
células está muy diluida.
Medición de crecimiento bacteriano: Recuento células viables.

B) Recuento de células viables (o Recuento viable):

Dilución de la muestra y siembra (“plaqueo”) sobre medio sólido o

siembra de la muestra incluida en el medio sólido.
Medición de crecimiento bacteriano: Colonias bacterianas.

S. aureus

S. aureus

S. aureus

Colonias de
S. aureus

S. aureus
Medición de crecimiento bacteriano: Recuento células viables.
Medición de crecimiento bacteriano: Recuento células viables.

C) Recuento de células viables:

Dilución seriada de la muestra en medio o
buffer estéril y “plaqueo” sobre medio
sólido.
Medición de crecimiento bacteriano: Recuento células viables.

VENTAJAS
ü En condiciones adecuadas, es un método sensible
ü Se pueden contar bacterias específicas gracias a la presencia
de medio que permiten seleccionar ciertas poblaciones y
medios que permiten diferenciar dos poblaciones en base a
una caracterís9ca en par9cular.
DESVENTAJAS
ü El número de colonias no depende sólo del tamaño del
inóculo.
También depende de:
ü El medio de cul9vo
ü Las condiciones de incubación
ü Tiempo de incubación
ü No siempre las colonias son del mismo tamaño: Las colonias
pequeñas pueden ser ignoradas
Medición de crecimiento bacteriano: Espectrofotométrica

D) Medición espectrofotométrica, fotométrica o turbidimétrica

de un cultivo bacteriano líquido.

Este método no discrimina la viabilidad de las bacterias en la

muestra.
División Bacteriana: Crecimiento Exponencial

Etapas de la curva clásica de crecimiento bacteriano:

• Fase lag: Crecimiento lento (etapa de acondicionamiento ambiental)
• Fase exponencial o logarítmica: Crecimiento bacteriano a máxima capacidad
• Fase estacionaria: Detención del crecimiento, no del metabolismo (estrés, hambruna)
• Fase de decaimiento: Muerte celular (agotamiento del cultivo)
Factores que afectan el crecimiento bacteriano

ü Temperatura
ü Salinidad
ü pH o acidez
ü Disponibilidad de oxígeno
 Temperatura
Consecuencias moleculares de la temperatura en el crecimiento
bacteriano

Las reacciones enzimá9cas van Las reacciones enzimá9cas ocurren a

aumentando su velocidad de la máxima velocidad posible.
reacción.

La membrana se congela; el
transporte es tan lento que no Desnaturación de proteínas;
hay crecimiento. colapso de la membrana
citoplasmá9ca; lisis térmica.
 Temperatura

ü Psicrófilos: Temperatura óp9ma baja (<1 a 15ºC)

ü Mesófilos: Temperatura óp9ma en rango medio (25 a 42ºC)
ü Termófilos: Temperatura óp9ma alta (50 a 70ºC)
ü Hiper termófilos: Temperatura óp9ma muy alta (80 a >100ºC)
 Temperatura

ü Psicrótrofos: Son microorganismos mesófilos, que son capaces

de crecer en un rango amplio de temperaturas.

Cuando contaminan algún alimento, pueden crecer a

temperaturas de refrigeración, y luego causar infecciones en
los individuos que consuman dicho alimento.

Ej: Micrococcus, Enterococcus, Listeria, Pseudomonas,

Shewanella.
Salinidad

Ø No halófilos: No toleran ni siquiera concentraciones

moderadas de sal.
Ø Halotolerantes: Toleran concentraciones moderadas
de sal
Ø Halófilos: Leves (1 a 6% NaCl) y Moderados (6 a
15% NaCl).
Ø Halófilos extremos: 15 a 30% NaCl.
Acidez (pH)

Saliva (6,75-7,25)
 Factores que afectan el crecimiento bacteriano: Acidez (pH)

Mina de cobre de Chuquicamata,

Acidotiobacillus ferrooxidans Región de Antofagasta, Chile
En medio altamente ácido (en H2SO4 concentrado,
pH » 1) es capaz de oxidar minerales de cobre
insolubles como CuFeS2 (calcopirita), Cu2S
(chalcocita), CuS (covelita) y Cu5FeS4 (bornita),
produciendo CuSO4 (soluble)
 Organismos según su requerimiento de oxígeno

Grupo Relación con el O2 Metabolismo

Aerobios
Estrictos Requerido Respiración aeróbica
Facultativos No requerido (Mejor con O2) Respiración, fermentación
Microaerofílicos Requerido (Bajos niveles) Respiración aeróbica

Anaerobios
Aerotolerantes No requerido (No mejora con O2 ) Fermentación
Estrictos Dañina o Letal Respiración, fermentación
 Organismos según su requerimiento de oxígeno

Resazurina
(Indicador de presencia de oxígeno)

(a) Aeróbica
(b) Anaeróbica
(c) Faculta<va
(d) Microaero>lica
(e) Anaerobio aerotolerante

Tioglicolato (reacciona con el oxigeno del aire y lo

reduce a H2O)

Medio de cul9vo con un poco de agar (semisólido), resazurina y

9oglicolato
 Anaerobiosis

Jarra Anaeróbica (GasPack)

Diseñada para el crecimiento de bacterias anaerobias.
Mecanismo hermético, que posee un catalizador químico que
consume todo el oxígeno presente dentro del recipiente.
 Anaerobiosis
Capnofilia
Cámara Anaeróbica
Por qué el oxígeno es tan importante para
las bacterias?

O2
O2
O2
Cadena transportadora de electrones: Fosforilación oxidativa

1 Glucosa = 32 ATP
Respiración: Aeróbica y Anaeróbica

Respiración aeróbica Respiración anaeróbica

E. coli es capaz de realizar ambos tipos de respiración, dependiendo si esta

creciendo en presencia o ausencia de oxígeno.
Respiración: Formas tóxicas del oxígeno

Ø Estas moléculas tóxicas se generan durante el metabolismo normal

de las bacterias (Respiración aeróbica).

Ø Los radicales superóxido (O2-) e hidroxilo (HO•) reaccionan

rápidamente oxidando diversas macromoléculas orgánicas como
lípidos, proteínas y ácidos nucleicos

Ø Esta oxidación provoca la destrucción de estructuras biológicas,

como membranas, complejos multiproteicos, DNA, etc.
Enzimas que degradan las formas tóxicas del oxígeno
Catalasa
La presencia de enzimas
Peroxidasa capaces de degradar los
derivados tóxicos del O2 le

Superoxido dismutasa (SOD)

permite a un determinado
microorganismo utilizar esta
molécula como aceptor final de
Combinación superoxido dismutasa/catalasa
electrones durante el proceso de

Superoxido reductasa
la respiración aeróbica

Catalasa (-) Catalasa (+) Prueba de la presencia de catalasa:

Colonia suspendida en agua
oxigenada (30%)
( 2H2O2 ® 2H2O + O2 )
 Clasificación bacteriana según tolerancia al oxígeno

Anaerobias estrictas: Carecen de SOD, catalasa y peroxidasa por lo que el O2 es muy tóxico

para ellas. No soportan presiones de O2 > al 0,5%.

Ej. Clostridium haemolyticum

Anaerobias moderadas: Soportan presiones de O2 de 2 - 8%. Pueden estar expuestas al aire

por 60-90 minutos sin perder viabilidad.

Ej. Bacteroides fragilis

Anaerobias aerotolerantes: Poseen algún nivel de enzimas detoxificantes.

Ej. Lactobacillus spp., Leuconostoc spp.

 Clasificación bacteriana según tolerancia al oxígeno

Microaerófilas: Sobreviven a presiones de O2 menores a la atmosférica (<21%). Son

capnofílicas (requieren CO2).

Ej. Campylobacter spp.

Anaerobias facultativas: Pueden realizar metabolismo anaerobio o aerobio dependiendo del

ambiente.

Ej. Escherichia coli y otras enterobacterias.

Aerobias estrictas: Sólo crecen en presencia de O2.

Ej. Pseudomonas sp.

De donde obtienen energía las bacterias?
Obtención de Energía: Catabolismo Glucólisis

Glucosa

Piruvato

2 ATP

2 NADH = 6 ATP

8 ATP Vías de
Fermentación
Glicólisis: Fermentación del Ácido Pirúvico (Piruvato)

Glicólisis Ácido Pirúvico

Glucosa (piruvato)

Fermentación Respiración
anaeróbica aeróbica

Ciclo de Krebs

F. Láctica F. Alcohólica
Piruvato Fosforilación
Piruvato oxidativa
piruvato
lactato descarboxilasa
deshidrogenasa
Acetaldehido CO2 + H2O
Lactato Alcohol
deshidrogenasa

Etanol
Glicólisis: Fermentación del Ácido Pirúvico (Piruvato)

Ácido Pirúvico
Glucosa
Glicólisis (piruvato)

Fermentación Respiración
anaeróbica aeróbica

Ciclo de Krebs

F. Láctica F. Alcohólica
Piruvato Piruvato Fosforilación
oxidativa
lactato piruvato
deshidrogenasa descarboxilasa

Acetaldehido CO2 + H2O

Lactato Alcohol
deshidrogenasa

Etanol
Respiración aeróbica: Glicólisis

Respiración
aeróbica

Piruvato Acetil- CoA

2 NADH = 5 ATP

2 GTP = 2 ATP
6 NADH = 15 ATP
2 FADH2 = 3 ATP

25 ATP
Glicólisis: Fermentación del Ácido Pirúvico (Piruvato)

Glicólisis Ácido Pirúvico

Glucosa (piruvato)

Fermentación Respiración
anaeróbica aeróbica

Ciclo de Krebs

F. Láctica F. Alcohólica
Piruvato Fosforilación
Piruvato oxidativa
piruvato
lactato descarboxilasa
deshidrogenasa
Acetaldehido
Lactato
CO2 + H2O
Alcohol
deshidrogenasa

Etanol
 Glicólisis: Fermentación del Ácido Pirúvico (Piruvato)

Fermentación Alcohólica

Alcohol
deshidrogenasa

2 Etanol

Fermentación
anaeróbica

La fermentación alcohólica es ampliamente usada en la fabricación de alimentos como vino, cerveza, pan
 Glicólisis: Fermentación del Ácido Pirúvico (Piruvato)

Fermentación Fermentación Láctica

anaeróbica

Ocurre en ausencia de oxígeno

Fermentación usada por los lactobacilos

(Lactobacillus lactis ): utilizan la lactosa (azúcar de
la leche).

Lactato
El lactato acumulado baja el pH, lo que hace que las deshidrogenasa
proteínas de la leche
2 Lactato
precipiten en el proceso de fabricación del queso
Clasificación bacteriana según fuente de energía

Quimiotróficas o Fototróficas o Fotosintéticas:

Quimiosintéticas: “Son aquellas que obtienen su
“Son aquellas que obtienen su energía captándola de la luz
energía a partir de reacciones solar”
químicas”

E. coli (Enterobacteria) Ocillatoria (Cianobacteria)

Clasificación bacteriana según fuente de energía

Quimiotróficas o Quimiosintéticas:
a) Quimioorganotróficas

Quimioorgano...Sustancia química orgánica

(trophos: alimento)
“Obtienen su energía a través de la utilización
de sustancias químicas orgánicas”
Clasificación bacteriana según fuente de energía

Quimiotróficas o Quimiosintéticas:
b) Quimiolitotróficas

Quimiolito...Sustancia química inorgánica

(lithos: piedra; trophos: alimento)
“Obtienen su energía a través de la utilización
de sustancias químicas inorgánicas”
Metabolismo Quimiolitotrófico

Oxidación del Fe2+ por el acidófilo Acidothiobacillus ferrooxidans

Metabolismo Fotosintético o Fototrófico

Membrana plasmática de una cianobacteria fotosintética

La luz solar aporta la energía requerida para el proceso de transferencia de
electrones en la membrana, generándose un gradiente de protones que se
acopla a la síntesis de ATP
Resumen Catabolismo

Obtención de
Energía

Glicólisis Fermentaciones:
Ciclo de Krebs Láctica
Sistema de transporte de electrones Alcohólica

Tolerancia al O2
Anaerobios estrictas
Anaerobios moderadas
Fuente de Energía
Anaerobios aerotolerantes Quimiotróficos
Microaerófilos Fototróficos
Anaerobios facultativas
Aerobios estrictas

Quimiotróficos:
Quimioorganotróficos
Quimiolitotróficos
Metabolismo: Anabolismo

Anabolismo: Síntesis de componentes estructurales

Según su fuente de carbono, las bacterias se clasifican en:

Heterótrofas:
Obtienen el carbono a partir de moléculas
más complejas. Ej.: hidratos de carbono,
aminoácidos, lípidos

Autótrofas:
Obtienen el carbono a partir de moléculas
simples. Ej.: CO2 y CH4

La gran mayoría de las bacterias de interés clínico son heterótrofas

Metabolismo: Anabolismo Biosíntesis de Macromoléculas

Los microorganismos son la base de todas las cadenas alimenticias

Anabolismo. Biosíntesis de macromoléculas
 Anabolismo. Fijación de CO2
Ciclo de Calvin: Es realizado
por todas las bacterias
fototróficas.

Ciclo de Calvin: Es realizado por

todas las bacterias fototróficas.
Conversión del CO2 en moléculas más
complejas
Metabolismo: Anabolismo Fijación de moléculas simples

Fijación de Fósforo (P)

Fotofosforilación: Formación de ATP desde ADP y Pi durante la
fotosíntesis.

Fosforilación Oxidativa: Formación de ATP desde ADP y Pi

durante la cadena transportadora de electrones.

Fosforilación a Nivel de Sustrato: Ej. Durante la glicólisis

Gliceraldehido-3-P + Pi + NAD+ 1,3-Bisfosfoglicerato + NADH + H+
Metabolismo: Anabolismo Fijación de moléculas simples

Fijación de Azufre (S)

ATP Acido Sulfhídrico en solución acuosa
SO42- H2S

H2S + Serina Cisteína + H2O

 Metabolismo: Anabolismo Fijación de moléculas simples

Fijación de Nitrógeno (N)

NO3- + H+ + NADH NO2- + NAD+ + H2O NO2-: Nitritos

NO3-: Nitrato
NO2- NH3
NH3: amoniaco
N2 NH3 N2: nitrogeno gaseoso

NH3 + ác. glutámico

ATP

Glutamina
 Clasificación de los medios de culFvo
1.- Según su estado Osico

Medio sólido Medio líquido Medio semi sólido

(agar 1,5%) (agar 0,8%)
 Clasificación de los medios de culFvo
3.- Según su contenido de nutrientes

ü Medios químicamente definidos:

Con9enen can9dades precisas y bien formuladas de diversos
componentes inorgánicos y orgánicos.

ü Medios complejos (indefinidos):

No poseen una formulación precisa. Se preparan en base a
infusiones de digeridos proteicos (carne, soya, caseína, extracto de
levadura). La mayoría de estos medios se venden deshidratados, lo
que facilita su preparación.
 Clasificación de los medios de culFvo
4.- Según su u9lidad.
1.- Corriente (básicos):
Contienen sólo los elementos nutritivos esenciales y permiten el
crecimiento de microorganismos que no tienen requerimientos
nutricionales especiales (microorganismos no exigentes).

Ej.: Caldo (agar) Luria y caldo (agar) nutritivo (medio sólido).

 Clasificación de los medios de culFvo
4.- Según su u9lidad.
2.- Especiales:
Mejorados o enriquecidos: Son medios corrientes adicionados de
sustancias de alto valor nutriSvo (sangre, suero, vitaminas, extractos de
levaduras), que permiten el desarrollo de bacterias más exigentes. Ej.:
Agar sangre, agar chocolate.

Medios selecSvos: ConSenen sustancias inhibidoras para determinadas

bacterias, permiSendo el desarrollo (o selección) de un Spo o especie
parScular. Ej.: Agar SS para Salmonella y Shigella, Agar Thayer MarSn
para N. gonorrhoeae y Agar MacConkey para Gram (-).

Medios diferenciales: Permiten establecer si una bacteria desarrolla una

determinada función metabólica que la diferencia de otras bacterias. Ej.:
Citrato de Simmons, TSI, MIO, LIA, Caldo urea.
 Medios de culFvo
Selec9vo y diferencial. Agar MacConkey

E. coli S. Typhimurium S. aureus

Gram (-), lac+ Gram (-), lac- Gram (+)

Selec9vo: “Selecciona” lo que crece, en éste caso sólo Gram (-)

debido a la presencia de cristal violeta y sales biliares.
Diferencial: Dentro de lo que crece, marca diferencias. En este caso
los que u9lizan lactosa como fuente de carbono (lac+) de los que no
(lac-)
 Medios de culFvo
Selec9vo y diferencial. Agar Manitol Salado

A. Staphylococcus aureus, B. Staphylococcus epidermidis, C. Escherichia coli.

Selec9vo: “Selecciona” lo que crece, en éste caso bacterias

halotolerantes, debido a su contenido de NaCl.
Diferencial: Aquellos que fermentan el manitol, presentan un halo
amarillo.
 Medios de culFvo

Condiciones de los medios de cul9vo

ü Esterilidad

ü Tener todos los nutrientes esenciales (agua, fuente de

nitrógeno, fuente de carbono, sales minerales,
micronutrientes, vitaminas, etc.)

ü Cumplir con requisitos físicos: temperatura (37ºC), pH

neutro (7.0 - 7.2 ), condición atmosférica (10% CO2)

ü Estar protegidos del medio ambiente (Evitar su

contaminación con microbiota ambiental y/o comensal)
 Esterilización

Autoclave
 Esterilización

Filtración

Radiación
 Medios de culFvo
¿Cuál es la utilidad de los medios de cultivo?

ü Aislamiento de bacterias a par9r de una muestra (agua,

secreciones, aire, alimentos, muestras clínicas).

ü Obtención de cul9vos puros, para el estudio de propiedades

fisiológicas e iden9ficación.

ü Conservación de cepas.

ü Evaluación de an9bió9cos.

ü Pruebas de esterilidad.

ü Fabricación de sueros, vacunas, etc.

 Medios de culFvo

¿Cómo se observa desarrollo bacteriano en los medios de cul9vo?

En medio líquido.
ü Enturbiamiento
ü Aparición de grumos
ü Formación de un velo o película en la superficie
En medio sólido.
ü Formación de colonias
ü Formación de un césped (crecimiento
confluente)
 Tipos de culFvo. CulFvo en “batch”
1) Cul9vo Batch o de medio no renovado: Cul9vo en Tubos.
Cambios notables en el medio de cul9vo, sobretodo en estadíos
tardíos del crecimiento
Morfología Macroscópica:

Siembra y Aislamiento

Tubos Medio líquido y sólido: Placas Medio Sólido:

Sólo siembra Siembra y aislamiento
Morfología Macroscópica:

Observación Macroscópica

Colonias: Agrupación
bacteriana producida por la
división sucesiva de una
bacteria original. La colonia se
observa a simple vista.

Observación Microscópica

Bacterias teñidas con Tinción

Gram. Se observan
microscópicamente.
Morfología Macroscópica:

Bacterias

colonia

colonia

Las colonias sólo pueden ser observadas en medio sólido. En medio

líquido, las bacterias se encuentran en suspensión.
Morfología Macroscópica:

Siembra y aislamiento en placa https://youtu.be/6NckVGCobwY

Colonia
aislada
Morfología Macroscópica: Colonias
Identificación Bacteriana:

Cultivo puro

Morfología de colonia y de tinción de Gram

Propiedades Propiedades Características

Bioquímicas Antigénicas de crecimiento

Fermentación de glucosa Reacciones serológicas Temperatura

Utilización de citrato Anticuerpos específicos Aerobiosis
Producción de H2S Anaerobiosis
etc. etc.
Identificación Bacteriana:

Propiedades Propiedades Características

Bioquímicas Antigénicas de crecimiento

Características genéticas o moleculares

Porcentaje Homología en la
de G+C secuencia del genoma

Codones utilizados para codificar

Principalmente aquellos que codifican
los distintos aminoácidos.
para RNA ribosomales
TTA, TTG, CTT, CTC, CTA y CTG
Leucina