Rompimiento Celular

Separación y Procesos
Biotecnológicos
 

Caldo de Fermentación
Con Células
Proteínas
Intracelular Separación de Células

Rompimiento Celular Sin Células

•Células inmovilizadas
•Células retenidas

Separación Material Intracelular

Sobrenadante
Precipitación Ácidos Nucleicos,
Proteasas

Tratamiento de cuerpos incluidos

Concentración

Purificación Alta
Resolución  
Resolución

Permite
Refinamiento •Altos niveles de pureza
 
Estabilidad del producto

ROMPIMIENTO DE CÉLULAS 
( Cell Disruption) 
¿Cuándo se usa?
Los procesos de bio-separación se inician con una separación de la biomasa
desde el resto del cultivo. En muchos casos los productos se encuentran en
el medio. En estos casos la biomasa se descarta y hasta se puede vender
como sub-producto.

Pero en otros casos el producto de interés se encuentra

en el interior de las células,
células, en particular la mayoría de
las proteínas producidas por manipulación genética de
bacterias
son precipitadas
que no segregan
en el interior
las proteína
de la células
al medio,
en forma
pero que
de
cuerpos incluidos (“inclusion bodies”) .
   Se trata de proteínas intracelulares. 
 

Procesos y Equipos
La liberación de las proteínas intracelulares involucra la ruptura o
permeabilización de la pared celular
celular..
Los equipos involucrados en esta etapa no han sido diseñados
especialmente para el área biotecnológica sino que son prestadas de
otras áreas (área de alimentos, de pinturas y pigmentos).
Este rompimiento o permeabilización se puede llevar a cabo por dos
métodos:
•Métodos No- Mecánicos

•Métodos Mecánicos
 

 
La selección de una u otra técnica dependerá las características del
producto se desea purificar,tales como:
•Resistencia
• Medios a:
alcalinos
• Solventes
• Detergentes
• Enzimas

•• Temperatura
Esfuerzo de corte.
La técnica utilizada determinará el tamaño de los desechos que se
producirán.
 

Métodos Mecánicos
El rompimiento se lleva a cabo por acción mecánica,
pudiendo ser:
• Fricción
• Efecto de la presión

• Colisiones.
Estos métodos incluyen las operaciones unitarias de
ultrasonido, homogenización , molinos de bolas, etc.
Estos métodos resultan ser agresivos con las proteínas de
interés, debido principalmente a la generación de calor.
Adicionalmente, el escalamiento resultan ser un problema
significativo.
 

  Métodos Mecánicos
Técnicas  Principios  Stress  Costos  Ejemplos 

Homogeni- Las células son Moderado Moderado Rompimiento de

zador de rotas en un tejidos y células
cuchillos mezclador animales.
Las células son forzadas a Tratamiento a
Homogeni- Fuerte Moderado
pasar a través de un
zador alta pequeño orificio lo que
gran escala de
presión produce que se rompan suspensión de
por el esfuerzo de corte células. 

Ultrasonifi- Las células son Fuerte Caro Rompimiento de

cación quebradas en una suspensiones de
cavidad células a lo menos
en pequeña escala
ultrasónica
Molienda Las células son Moderado Barato
rotas por medio de
una molienda con
abrasivos
Molinos de Las células son Fuerte Barato Rompimiento a
gran escala para
bolas trituradas con suspensiones de
bodas de acero o células y células de
vidrio plantas
 

Métodos No-Mecánicos
Pueden ser de dos tipos:
•Agente químicos 
químicos 
•Solventes orgánicos
• Detergentes
• Alcalis
• Agua (shock osmótico)

•Enzimáticos se trata de enzimas

enzimas que
que permeabilizan en forma
selectiva las membranas celulares, tales como lisozima,
glucanasas, mananasas, etc.

Los métodos no-mecánicos son fáciles de escalar,

escalar, si uno
necesita tratar 10 veces más materia orgánica basta con
adicionar 10 veces más reactivo químico o enzimático.
 

 
Métodos No-mecánicos
Técnicas  Principios  Stress  Costos  Ejemplos 

Permeabilización de
Permeabili- la pared celular, lo Suave Caro Tratamiento de
zación cual produce el
 M. lysodeikticus 
Enzimático rompimiento de la con lisozima.
célula

Shock  Ruptura Osmótica Suave Barato Ruptura de

de la membrana Células de
Osmótico Glóbulos Rojos.
Solubiliza- Disolución de la Suave Moderada- Rompimiento
ción membrana celular mente Caro de bacterias con
con detergentes SDS.
Solventes orgánicos
Disolución
de Lípidos
que disuelve la pared Modera Barato Rompimiento
celular y también la do de levaduras
desestabilizan con tolueno.

Tratamien- Solubilización de la Fuerte Barato

membrana por

to con saponificación de los

álcalis lípidos
 

Rompimiento Celular
Métodos Mecánicos

Separación y Procesos
Biotecnológicos
 

MÉTODOS MECÁNICOS
Los métodos mecánicos se pueden dividir en dos tipos :
Métodos a pequeña escala son :
•Ultrasonificación
•Molina con abrasivos
•Homogenizadores

Métodos a gran escala

•Homogenizadores a alta presión
•Molinos de bolas

Ambos son operaciones unitarias típicas de la Ingeniería de

Procesos y de la industria de alimentos.
 

MÉTODOS MECÁNICOS
Pequeña Escala
 

Desintegración completa de una célula

Para determinar el contenido de proteínas total de una célula se debe

realizar la desintegración total de ellas, para ello se utiliza la siguiente
metodología:
1. Se adi
adici
cion
onan
an 1 vol
volum
umen
en de
de bol
bolas
as de
de vid
vidri
rio
o 1-3
4-5
en un ependorf.
2. Se ad
adic
iciiona 1 vol
olu
ume
men lass células a
n de la
desintegrar (en forma de pasta, previamente
separadas del caldo)

3. Se ad
adic
icio
iona
na 0.5 vo
volu
lume
men
n de bubufffe
ferr, se
puede adicionar algún detergente (SDS,
Triton X-100)

4. Se
y 5 ag
agit
itan
an fu
minutosfuer
erte
teme
mentntee en
(controlando en unnovo
un
que vort
sertex
ex,, ent
entre
caliente)re 2

5. Se re
repi
pite
te el pu
punt
nto
o 4 ha
hast
staa ase
asegu
gura
rars
rsee que
que no
se rompen más las células.
6. Se se
sepa
para
ran
n los
los de
dese
sech
chos
os de la so
solución y se
luci
analiza la concentración de proteínas.
nas.   6
100% Rompimiento
 

Ultrasonificación

Se utilizan frecuencias de 20 Khz esto produce vibraciones que provocan el

fenómeno de cavitación.
• Se producen zonas de baja presión en el líquido
• El líquido se transforma en gas formándose pequeñas burbujas
• Las burbujas colapsan debido a los cambios de presión.
• Se producen fuertes esfuerzos de corte en el líquido que rompen las
células.

Ultrasonicador
 

Molina con abrasivos 

Procedimiento:
1. Se ut
util
iliz
izan
an un re
reci
cipi
pien
ente
te do
dond
ndee se
se agr
agreg algún agente abrasivo, como
egaa alg
bolas de vidrio.
2. El sis
siste
temma se ha
hace
ce vi
vibr
brar
ar lo que
que pr
prod
oduc
uce:
e:
• Colisiones de las bolas con la biomasa
• Fuertes esfuerzos de cortes
• Se produce la ruptura de las c élulas.
3. Pos
Poster
terior
iorme
mente
nte,, se sep
separa
aran
n las
las boli
bolitas
tas y desec
desechos
hos cel
celula
ulares
res y se
recupera el sobrenadate.
 

Homogenizadores 
La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la ruptura de
las células. Los altos esfuerzos de corte se pueden obtener por:
1. Embolos
2. Cuchillas
3. Pistones

Émbolos Cuchillas Pistones