Diagnóstico de

laboratorio de las
enfermedades víricas
JUSTIFICACIÓN DEL DIAGNÓSTICO
ETIOLOGICO DE LAS INFECCIONES
VIRALES
• ENFERMEDADES GRAVES POR VIRUS
- terapias agresivas (cáncer ..)
- transplantes
- SIDA

• DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

- más asequibles
- técnicas moleculares

• EXISTENCIA DE TRATAMIENTOS EFICACES

 Diagnóstico de laboratorio de las
infecciones virales

• Confirmar el diagnóstico clínico

• Seleccionar un tratamiento adecuado
• Monitorizar la evolución de la enfermedad
• Hacer un seguimiento epidemiológico de la
enfermedad
Los métodos nos permiten:

 Descripción de efectos citopatológicos

(ECP)
 Detección de partículas víricas
 Aislamiento y crecimiento del virus
 Detección y análisis de componentes víricos
(p ej. Proteínas (antígenos), enzimas,
genomas)
 Evaluación de la respuesta inmunitaria del
paciente frente al virus (serología)
DIAGNÓSTICO DE LAS
INFECCIONES VIRALES

 Directo:
Demostración de la presencia del
virus en la muestra clínica

 Indirecto:
Demostración de la presencia de
anticuerpos específicos en el suero
 DIAGNÓSTICO INDIRECTO DE LAS
INFECCIONES VIRALES:

Demostración de la presencia de anticuerpos

específicos en el suero

• Infecciones agudas:
IgM, seroconversión, serorefuerzo

• Infecciones crónicas:
IgG, avidez

Seroconversión: aparición de ab contra la enfermedad infecciosa.

Sero refuerzo: re aparición de ab.
 DIAGNOSTICO DIRECTO DE LAS
INFECCIONES VIRALES:

Demostración de la presencia del virus

en la muestra clínica
• Inoculación en animales de experimentación
• Inoculación en huevo embrionado
• Inoculación en cultivos celulares:
- primarios, diploides, líneas contínuas
• Detección del virus en la muestra:
- visualización partícula viral (M/E)
- detección de componente estructural
(Ag, ac. nucleico)
DIAGNÓSTICO DE VIRUS:

Toma de muestras
Muestras clínicas
para el aislamiento
de virus
CONSIDERACIONES A LA TOMA DE MUESTRAS
PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA INFECCION VIRAL

• Precoz
• Adecuada (raspados, lavados ..) ➔ ¡células!
• Localización 1ria de la infección y otras posibles
• Transporte y conservación
• Decontaminación
• Infección  enfermedad (viremia)
DIAGNÓSTICO DIRECTO DE VIRUS:

Microscopía
óptica
Fibroblastos infectados por CMV
Célula epitelial Células sanguíneas Células de mucosa respiratoria
infectada por HSV infectadas por CMV infectadas por HSV
(antigenemia pp65)

Varicela-zoster, influenza, parainfluenza, adenovirus …

CMV: citomegalovirus
Examen citológico
Examen citológico
DIAGNÓSTICO DIRECTO DE VIRUS:

Inmunocromatografía
DETECCIÓN DE ANTÍGENO
(Inmunocromatografía)
FUNDAMENTO DE INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA
DETECCIÓN DE ANTÍGENOS
Anticuerpos de detección
marcados con
Oro Coloidal

Antígeno en muestra

TIRA NITROCELULOSA
Anticuerpo de Captura Anticuerpo de Captura
contra anticuerpo contra antígeno
de detección específico

C T S
TÉCNICA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA:
DETECCIÓN DEL VIRUS INFLUENZA
• Rotavirus
• Virus Respiratorio Sincitial
• Influenza A, B
• …………
CULTIVO DE VIRUS:

Cultivos celulares
Cultivos primarios
• Fibroblastos
• Células epiteliales
Líneas celulares
• Tumorales
• Inmortalizadas
fibroblastos
CULTIVOS CELULARES:
• Primarios
• Diploides
• Línea continua
 CMV: Citomegalovirus
VVZ: V. Varicela Zoster
VHS: V. Herpes Simple
VSR: V. sincitial respiratorio
ADN: adenovirus
PAR: parvovirus
INF: Influenzavirus
RINO: rinovirus
CB: Coxsackie B
CA: Coxsackie A
ECHO : Echovirus
POL: Poliovirus

MRC-5: Human lung fibroblast

VERO: Cels, epiteliales de riñon
de mono verde
HEP-2: Células epiteliales de
carcinoma humano
MDCK: Madub-Darby canine kidney
LLC-MK2: Kidney form rehsus
monkey
A-549: Adenocarcinoma de
pulmón humano
BGM: Riñón de mono verde
africano
293: Riñón embrionario de
humano
RD: Riñon embrionario humano
DETECCION DE LA PRESENCIA DE LOS VIRUS
EN LOS CULTIVOS CELULARES

• EFECTO CITOPÁTICO
- alteraciones morfológicas
- inclusiones citoplásmicas
- lisis (generalizadas, focales)
- fusiones (sincitios)

• OTROS: hemaglutinación, hemadsorción …

EFECTO CITOPÁTICO:

Lisis de la monocapa
EFECTO CITOPÁTICO (parcial)
EFECTO CITOPÁTICO (completo)
INCLUSIONES VIRALES EN LOS CULTIVOS CELULARES
CUERPOS DE INCLUSIÓN
HEMADSORCIÓN
 IDENTIFICACION DE LOS VIRUS EN LOS
CULTIVOS CELULARES

• Neutralización del efecto observado

(citopático, hemaglutinación ..)

• Detección antígeno con Ac. específicos marcados

(IF, EIA, RIA)

• Detección ac. nucleico

(hibridación, amplificación)
SHELL VIAL
SHELL VIAL
Hemaglutinación y
Neutralización
Aglutinación en látex

Se basa en las interacciones Ag-Ac,

donde la cantidad y especificidad de
la reacción se evalúa por los cambios
físicos inducidos tras la unión del
anticuerpo específico con su antígeno
correspondiente para formar
inmunocomplejos
 Limitaciones de los métodos
serológicos
 La presencia de Ab nos indica de una infección, pero NO
nos dice cuando se produjo.
 Hay producción de falsos positivos y falsos negativos
 Hay formación de inmunocomplejos que impiden la
detección del anticuerpo (p ej. Hepatitis B)
 Hay reacciones cruzadas impidiendo la detección.
 Existen anticuerpos muy específicos que impiden la
detección de diferentes cepas del mismo virus.

UNA BUENA COMPRENSIÓN DE LA SINTOMATOLOGÍA CLÍNICA Y EL

CONOCIMIENTOS DE LAS LIMINTACIONES FACILITA EL PROCESO DE
ELABORACIÓN DEL DIAGNÓSTICO
DIAGNÓSTICO DIRECTO DE VIRUS:

Técnicas moleculares
 DIAGNÓSTICO DE LAS VIRIASIS
RESPIRATORIAS

 Clínica
 Imagen Diagnóstico inespecífico
 Epidemiología

 Aislamiento en cultivo Diagnóstico tardío

 Serológico

 Detección de Ag Diagnóstico específico, rápido

 Amplificación genética
 PCR

Ciclos de:
➢ Desnaturalización
➢ Anillamiento
➢ Elongación

Termociclador
 La amplificación de ac. nucleicos en el
diagnóstico de las enfermedades virales

 Diagnóstico (sensibilidad, único método)

 Cuantificación (carga viral)
 Epidemiología molecular (genotipado)
 Detección de la resistencia al tratamiento. (VIH,VHB…)
 Identificación de nuevos patógenos (VHC, HHP-8 …)
CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS EN
SANGRE
(plasma, suero)
VIREMIA → nº de copias o UI / ml

• DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDAD (CMV)

• PROGRESIÓN DE LA INFECCIÓN (VIH)

• RIESGO DE TRANSMISIÓN VERTICAL (MADRE-HIJO)

• EFICACIA DE LA TERAPIA ANTIVIRAL

 PCR CUANTITATIVA: Carga Viral
(sangre total, plasma, suero)

 VIH → copias / ml [20-10.000.000]

 VHC → UI / ml [15 - 69.000.000]

 VHB → UI / ml [20 - 170.000.000]

 CMV, Epstein-Barr, HHV6, virus JC/BK ....

 Western Blot (WB)
 Las proteínas se transfieren a un soporte sólido (papel de
nitrocelulosa, nylon), lo cual da una copia exacta del patrón del gel
en la matriz.
 La identificación de las proteínas a estudiar se realiza usando un ELISA
indirecto. Las reacciones se leen como positivas cuando una línea de
precipitación o color se forma en el peso molecular correcto para una
proteína particular.
FISH