Fig. 2.7 Exploración de Todo El Cubreobjetos para Detectar La Presencia de Espermatozoides Móviles

Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.
com
1. Introducción
Capítulo 2: Examen básico
4. El informe debe indicar que se trata de una aproximación y no de un valor exacto.
5. Para los cálculos de probabilidades de presencia de espermatozoides a pesar del escaneo de preparaciones
húmedas, consulteSección 2.5 en la página 64.

examen
2. Básico
Fig. 2.7 Exploración de todo el cubreobjetos para detectar la presencia de espermatozoides móviles
Esto implica evaluar campos microscópicos de alta potencia con un aumento de ×200 para un cubreobjetos de 22 mm × 22 mm.
50 mm / 1000 µm = 50 campos
examen
3. Extendido
24 mm / 1000 µm = 24 campos
examenes
4. Avanzado
1200 campos totales

tecnicas
5. Preparación de esperma
Estimación de la concentración basada en observaciones HPF

Si hay menos de cuatro espermatozoides por ×400 HPF (es decir, aproximadamente
menos de 1 × 106/ml), para hombres con subfertilidad masculina puede ser
suficiente informar que la concentración estimada de espermatozoides es de
aproximadamente 1 × 106/ml, con una nota en el informe que indica claramente
que esta es solo una concentración de esperma estimada muy aproximada y si se
de espermatozoides
6. Criopreservación
observaron espermatozoides móviles. Esta estimación imprecisa solo debe hacerse

cuando el propósito de la evaluación de la concentración de espermatozoides es
para decidir la investigación clínica adicional o para decidir la modalidad óptima de
tecnologías de reproducción asistida (TRA) para la pareja. Esta estimación no debe
usarse para el análisis de semen de rutina, en particular para monitorear los efectos
de los posibles agentes anticonceptivos masculinos y la respuesta a la estimulación
endocrina de la espermatogénesis.Sección 2.4.8.4 en la página 32.
y control de calidad
7. Garantía de calidad
Evaluación de cantidades bajas de espermatozoides en cámaras desechables de gran volumen
El uso de cámaras de gran volumen y 100 µm de profundidad puede aumentar la sensibilidad de la evaluación
de la concentración.(85). La cámara de gran volumen tiene dos cámaras de 100 µm de profundidad, cada una
con capacidad para 25 µl. Para reducir los errores de muestreo, se debe contar una cantidad crítica de
espermatozoides (preferiblemente un total de al menos 400 de recuentos repetidos de aproximadamente 200)

8. Apéndices
(Tabla 2.16 en la página 78).
1. Mezclar bien la muestra de semen.
2. Retire una alícuota de semen, si se espera un bajo número de espermatozoides, entonces la dilución
puede no ser necesaria y permite observar fácilmente los espermatozoides móviles. Si se diluye,
diluir 1+1 (1 : 2) con fijador (Sección 2.4.4.4 en la página 20).
9. Referencias
37
1. Introducción
Manual de laboratorio de la OMS para el examen y procesamiento de semen humano, sexta edición
La dilución 1+1 (1 : 2) para muestras con menos de 2 espermatozoides en la evaluación inicial

(Tabla 2.1 en la página 20) es apropiado para un rango de concentraciones de esperma,
produciendo alrededor de 200 espermatozoides dentro de toda la cámara.
3. Si la fluorescencia está disponible en el microscopio, la tinción de esperma fijado "diluido"

examen
2. Básico
con un tinte apropiado, como DAPI, puede ayudar a su identificación.
Lograr 200 espermatozoides por réplica en una cámara desechable de gran volumen
• Si solo hay un espermatozoide por HPF de 4 nl en la preparación húmeda inicial,
teóricamente hay 0,25 espermatozoides por nl (250/µl o 250 000/ml).
• La cámara de gran volumen contiene 25 µl, por lo que habría 6 250 espermatozoides en su
examen
3. Extendido
interior. Diluir la muestra 1+1 (1 : 2) reduciría el fondo y el número de espermatozoides a 3

125 por cámara, suficiente para un error de muestreo aceptablemente bajo.
• Sin embargo, este valor solo puede ser una estimación aproximada porque se cuentan muy pocos
espermatozoides y los volúmenes pueden ser inexactos.
Procedimiento
examenes
4. Avanzado
1. Tome la muestra correspondiente como se indicó anteriormente (diluida o pura).
2. Llene cada cámara del portaobjetos con 25 µl del líquido.
3. Guarde la cámara en posición horizontal durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente en una cámara
húmeda (p. ej., sobre papel de filtro saturado de agua en una placa de Petri tapada) para evitar que se
seque. (Si usa fluorescencia, el tinte se unirá a las cabezas de los espermatozoides y las células
tecnicas
inmovilizadas sedimentarán en el piso de la cámara durante este tiempo).
4. Examine la diapositiva con un aumento de ×250.
5. Cuente al menos 200 espermatozoides en cada repetición, para lograr un error de muestreo
aceptablemente bajo (Tabla 2.16 en la página 78).
6. Examinar una cámara sistemáticamente campo por campo. Comience en una esquina y escanee a lo
de espermatozoides
largo del eje x hacia el lado opuesto; luego mueva un campo a lo largo del eje y y escanee hacia
atrás a lo largo de todo el ancho. Continúa de esta manera en zig-zag. Siga observando la
diapositiva mientras cambia de campo. Continúe contando hasta que se hayan observado al
menos 200 espermatozoides.
7. Anote el número de campos evaluados para llegar al menos a 200 espermatozoides. El

mismo número de campos se contará desde la otra cámara.
8. Contar el número de espermatozoides y campos con la ayuda de un contador de laboratorio.
9. Cambie a la segunda cámara y realice el recuento de réplicas en el mismo número de

campos (el mismo volumen) que la primera réplica, incluso si esto arroja menos de 200
espermatozoides.
8. Apéndices
10. Calcula la suma y la diferencia de los dos números.
11. Determinar la aceptabilidad de la diferencia deTabla 2.3 en la página 33–la diferencia

máxima entre dos conteos que se espera que ocurra en el 95% de las muestras debido
únicamente al error de muestreo.
9. Referencias
38
1. Introducción
12.Si la diferencia es aceptable, calcule la concentración. Si la diferencia es demasiado

alta, haga dos preparaciones nuevas y repita la evaluación.
13.Reporte la concentración promedio de espermatozoides con dos cifras significativas.

examen
2. Básico
14. Multiplique la concentración de espermatozoides por el volumen de semen (ml) para obtener el número
total de espermatozoides por eyaculado.
Cálculo de bajas concentraciones de esperma por campo examinado

La concentración de espermatozoides en el semen es su número (N), dividido por el volumen
del número total (n) de campos microscópicos examinados (donde el volumen (v) de un campo
se calcula como enSección 2.5.9 en la página 67), multiplicado por la dilución. Es decir, C = (N/
examen
3. Extendido
n) × (1/v) × factor de dilución.
Con un aumento total de ×250, el volumen de campo es de 80 nl (Sección 2.5.9), y para una dilución
1+1 (1 : 2), la concentración es:
C = (N/n) × (1/80) × 2 espermatozoides/nl = (N/n) × (1/40) espermatozoides/nl (millones de

espermatozoides/ml de semen).
examenes
4. Avanzado
Con un aumento total de ×400, el volumen de campo es de 20 nl (Sección 2.5.9), y para una
dilución 1+1 (1 : 2), la concentración es:
C = (N/n) × (1/20) × 2 espermatozoides/nl = (N/n) × (1/10) espermatozoides/nl (millones de

espermatozoides/ml de semen).
tecnicas
Cuando se ha evaluado toda el área de ambas cámaras, se divide el número total de

espermatozoides por el volumen total de ambas cámaras (50 µl), multiplicado por el
factor de dilución (2), para obtener la concentración en espermatozoides/µl (miles/ ml de
semen).
Si la muestra no se ha diluido, el factor de dilución es 1.
Volumen observado por campo de alta potencia en una cámara desechable de gran volumen de 100 µm de
de espermatozoides
profundidad
• El volumen de semen en cada campo microscópico depende del área del campo (πr2,
donde π es aproximadamente 3,142 y r es el radio del campo microscópico) y la
profundidad de la cámara (aquí 100 µm).
• El diámetro del campo microscópico se puede medir con un micrómetro de

platina o se puede estimar dividiendo el diámetro de la apertura de la lente ocular
por el aumento de la lente del objetivo.
• Con un objetivo ×40 y un ocular ×10 de apertura de 20 mm, el campo del microscopio tiene
un diámetro de aproximadamente 500 µm (20 mm/40). En este caso, r = 250 µm, r2= 62 500
micras2, πr2= 196 375 micras2, y el volumen es 19 637 500 µm3o alrededor de 20 nl.
• Con un objetivo ×25 y un ocular ×10 de apertura 25 mm, el campo del microscopio tiene un
8. Apéndices
diámetro de aproximadamente 1000 µm (25 mm/25). En este caso, r = 500 µm, r2= 250 000
9. Referencias
39
1. Introducción
Sensibilidad del método

Si hay menos de 200 espermatozoides en cada cámara, el error de muestreo excederá el 5%.
Cuando se encuentren menos de 400 espermatozoides en ambas cámaras, informe el error de
muestreo para el número de células contadas.
examen
2. Básico
Si se cuentan menos de 25 espermatozoides en cada cámara, la concentración será < 2000

espermatozoides/ml, con un error estimado > 14%. Indique el número de espermatozoides
observados con el comentario “Se contaron muy pocos espermatozoides para una
determinación precisa de la concentración (< 2000/ml)”.
Es importante señalar que la ausencia de espermatozoides de la alícuota examinada

no significa necesariamente que estén ausentes del resto de la muestra.
examen
3. Extendido
Ejemplos resueltos
Ejemplo 1
Con una dilución 1+1 (1 : 2), se encuentra que la réplica 1 contiene 210 espermatozoides en 300
campos, mientras que la réplica 2 contiene 300 espermatozoides en 300 campos. La suma de
los valores (210+300) es 510 en 600 campos y la diferencia (300–210) es 90. DeTabla 2.3 en la
examenes
4. Avanzado
página 33se ve que esto excede la diferencia esperada solo por casualidad (44), por lo que los
resultados se descartan y se hacen dos nuevas diluciones repetidas.
Ejemplo 2
campos, mientras que la réplica 2 contiene 230 espermatozoides en 400 campos. La suma de
los valores (200+230) es 430 en 800 campos y la diferencia (230–200) es 30. DeTabla 2.3 en la
tecnicas
página 33se ve que es menor que el encontrado por casualidad (40), por lo que se aceptan los
valores.
La concentración de espermatozoides en la muestra, para una dilución 1+1 (1 : 2) es C = (N/n) ×

(2/v) espermatozoides/nl. Si v = 20 nl (x400 aumentos), C = (430/800) × (2/20) = 0,0538
espermatozoides/nl o 54 000 espermatozoides por ml de semen (a dos cifras significativas).
Ejemplo 3
de espermatozoides
Con una dilución 1+1 (1 : 2), se encuentra que la réplica 1 contiene 50 espermatozoides en toda
la cámara, mientras que la réplica 2 contiene 70 espermatozoides en toda la cámara. La suma
de los valores (50+70) es 120 en las dos cámaras, y la diferencia (70–50) es 20. En la Tabla 2.3 se
ve que esto es menor que el que se encuentra solo por casualidad (21), por lo que los valores
son aceptados.
Cuando se ha evaluado toda el área de ambas cámaras (un total de 50 µl), la concentración de
la muestra, para una dilución 1+1 (1 : 2), es C = (N/50) × 2 espermatozoides por µl = (120/50) × 2
= 4,8 espermatozoides/µl o 4 800 espermatozoides/ml de semen (a dos cifras significativas).
Como se contaron menos de 400 espermatozoides, informe el error de muestreo para 120
espermatozoides dado enTabla 2.3 en la página 33(9,3%).
Ejemplo 4
Con una dilución 1+1 (1 : 2), se encuentra que la réplica 1 contiene 20 espermatozoides en toda la
8. Apéndices
cámara, mientras que la réplica 2 contiene 18 espermatozoides en toda la cámara. Como en cada
cámara se encuentran menos de 25 espermatozoides, la concentración será < 2000 espermatozoides/
ml. Informa que “se observaron 38 espermatozoides en las muestras, muy pocos para una
determinación precisa de la concentración (< 2000/ml)”.
9. Referencias
40
1. Introducción
Ejemplo 5
Con una dilución 1+1 (1 : 2), no se encuentran espermatozoides en ninguna de las réplicas. Como en
cada cámara se encuentran menos de 25 espermatozoides, la concentración será < 2000
espermatozoides/ml. Informe "No se observaron espermatozoides en las réplicas, muy pocos para
una determinación precisa de la concentración (< 2000/ml)".
examen
2. Básico
Cálculo del número total de espermatozoides

Se recomienda calcular e informar el número total de espermatozoides por eyaculado, ya
que este parámetro proporciona una medida de la producción de espermatozoides
testiculares y del número de espermatozoides transferidos a la hembra durante el coito.
Esto se obtiene multiplicando la concentración de esperma por el volumen de toda la
eyaculación.
examen
3. Extendido
Examen de muestras centrifugadas para detectar espermatozoides independientemente de su

motilidad Cuando no se observan espermatozoides en ninguna de las preparaciones húmedas y el
estado de motilidad de los espermatozoides no es importante, la muestra se puede centrifugar para
determinar si hay espermatozoides presentes en una muestra más grande.

examenes
4. Avanzado
2. Extraer una alícuota de 1 ml de semen y centrifugar idealmente a 3000 g durante 15 minutos.
3. Decantar la mayor parte del sobrenadante y resuspender el sedimento de esperma en los
aproximadamente 50 µl restantes de plasma seminal.
4. Realice una o dos preparaciones húmedas de 10 µl (Sección 2.4.3 en la página 18) y evalúe como se
tecnicas
describió anteriormente (Sección 2.4.4 en la página 19).
• La presencia de espermatozoides en la muestra indica:
• paso del testículo(s) a la uretra
• producción de espermatozoides gravemente limitada o transporte de espermatozoides obstaculizado.

de espermatozoides
• La ausencia de espermatozoides sugiere:
• posible ausencia total de espermatozoides (azoospermia), probablemente causada por: producción nula o
extremadamente baja de espermatozoides
no hay paso de los testículos a la uretra.

2.4.9 Morfología espermática
El valor de la evaluación de la morfología del esperma humano no es solo el valor pronóstico

limitado con respecto a los embarazos espontáneos o el resultado de TRA, sino aún más la
información diagnóstica sobre el estado funcional de los órganos reproductores masculinos,
principalmente los testículos y los epidídimos. Para la evaluación de los órganos reproductores
masculinos, no es suficiente determinar únicamente la proporción de espermatozoides
8. Apéndices
“normales”. Es importante evaluar la morfología específica de cabeza, cuello/pieza intermedia y

cola, y la posible presencia de residuos citoplasmáticos anormales.
Todos los eyaculados humanos contienen espermatozoides con una amplia gama de apariencias morfológicas
diferentes. Las definiciones anteriores de la morfología de los espermatozoides se basaban principalmente en
las experiencias de la medicina veterinaria y las investigaciones microscópicas.

9. Referencias
41
1. Introducción
Los criterios presentados aquí se desarrollaron a partir de investigaciones de la morfología de

los espermatozoides capaces de penetrar el moco cervical y unirse a la zona pelúcida.
El término espermatozoide “normal” es en cierto modo ambiguo, lo que provoca malentendidos

e incluso conflictos académicos. Un significado general de "normal" es una cualidad que es
examen
2. Básico
común, por ejemplo, en una población. Esto no es cierto para la "morfología espermática
normal" en humanos. Otro significado es que indica que la célula o individuo no está afectado
por enfermedad, pero una morfología normal no significa que el espermatozoide no pueda
portar otra causa de patología (ej. cola inmóvil o ADN dañado).
La morfología variable de los espermatozoides humanos dificulta la evaluación, pero las

observaciones de los espermatozoides recuperados del aparato reproductor femenino,
examen
3. Extendido
especialmente en el moco endocervical poscoital(94, 95)y también de la superficie de la zona

pelúcida(96, 97)(Figura 2.8 en la página 43), han ayudado a definir la apariencia de los
espermatozoides potencialmente fecundantes (morfológicamente normales o, mejor, “ideales”
o “típicos”). Mediante la aplicación estricta de ciertos criterios de morfología de los
espermatozoides, se han establecido relaciones entre el porcentaje de formas "normales" y
varios criterios de valoración de la fertilidad (tiempo hasta el embarazo, tasas de embarazo in
vivo e in vitro). (58, 96, 98-103), que puede ser útil para el pronóstico de la fertilidad.
examenes
4. Avanzado
La filosofía subyacente del sistema de clasificación descrito aquí es limitar lo que se identifica
como típico de la subpoblación de espermatozoides potencialmente fertilizantes que prevalece
en el moco endocervical. Es probable que el rango de porcentaje de formas normales para
hombres fértiles e infértiles esté muy por debajo del 30 %(104). Esto producirá inevitablemente
umbrales bajos que discriminen entre poblaciones fértiles e infértiles; de hecho, se han
encontrado límites de referencia y umbrales de 3 a 5% de formas normales en estudios de
tecnicas
fertilización in vitro (FIV)(99), inseminación intrauterina (IIU)(101)y fertilidad in vivo(105).

Además, se debe enfatizar que las diferencias observadas en los promedios grupales entre
hombres infértiles y subfértiles no significan automáticamente que los "límites" calculados
puedan usarse para la interpretación de los resultados de hombres individuales. Para obtener
tales límites útiles, se deben determinar los valores predictivos positivo y negativo. Esto es
difícil, por ejemplo, cuando se trata de la proporción de espermatozoides “normales” (o
“ideales” o “típicos”). Para distinguir estadísticamente entre, por ejemplo, 3% y 5% de formas
"normales" para hombres individuales, 1500 espermatozoides deben ser evaluados por
de espermatozoides
personal altamente capacitado.
Los espermatozoides unidos a la zona pelúcida humana también exhiben una subpoblación de
espermatozoides morfológicamente similares.(103).
Para una mejor comprensión de la morfología de los espermatozoides humanos a nivel microscópico de luz,
una revisión exhaustiva de la ultraestructura y la función de los espermatozoides puede ser valiosa.(106).
La evaluación práctica de la morfología del esperma humano comprende los siguientes pasos:
• preparar un frotis de eyaculado en un portaobjetos (Sección 2.4.9.1);
• secado al aire, fijación y tinción del portaobjetos (Sección 2.4.9.2 en la página 46);
8. Apéndices
• montar el portaobjetos con un cubreobjetos si el portaobjetos se va a guardar durante mucho tiempo (
Sección 2.4.9.5 en la página 48);
• examinando el portaobjetos con óptica de campo claro con un aumento de ×1000 con inmersión en aceite (
Sección 2.4.9.6 en la página 48); y

9. Referencias
42
1. Introducción
• evaluando aproximadamente 200 espermatozoides (Sección 2.4.9.6).
• Para solucionar problemas de evaluaciones de morfología, consulteSección 7.10.2 en la página 207.

examen
2. Básico
Fig. 2.8 Espermatozoides morfológicamente "ideales"
(a, b) Espermatozoides teñidos con Shorr recuperados de la zona pelúcida in vitro. (c)
Espermatozoides teñidos con Papanicolaou recuperados del moco endocervical después del
coito. Se observan muy pocos defectos en la cabeza del espermatozoide, pieza intermedia o
pieza principal. Las colas pueden ser curvas pero no muy anguladas. (a, b)
examen
3. Extendido
(a) (C)
examenes
4. Avanzado
(b)
tecnicas
Reproducido de Liu et al. (2003) con permiso de la Sociedad Europea de

Reproducción Humana y Embriología. (c) Reproducido de Menkveld & Kruger (1990)
con autorización.
de espermatozoides
2.4.9.1 Preparación de frotis de eyaculado
La adición rápida de fijador al eyaculado no permite una visualización adecuada de los

espermatozoides, ya que están oscurecidos por las proteínas seminales desnaturalizadas. Para
el análisis morfológico, se acostumbra preparar frotis de eyaculado que se secan al aire antes
de fijarlos y teñirlos. Sin embargo, tal proceso conduce a artefactos morfológicos, ya que el
secado al aire de frotis de semen está asociado con:
• cambios en las dimensiones de los espermatozoides: los espermatozoides secos, fijados y teñidos son más
pequeños que los espermatozoides vivos visualizados en el semen(107);
• expansión de cabezas de espermatozoides inmaduros (Soler et al., 2000); y
• pérdida de gotitas citoplasmáticas osmóticamente sensibles(108, 109), aunque se retienen

8. Apéndices
grandes cantidades de exceso de citoplasma residual.
Se deben hacer dos o más frotis de la muestra de semen fresco en caso de que haya problemas
con la tinción o se rompa un portaobjetos.

9. Referencias
43
1. Introducción
2. Extraiga una alícuota inmediatamente, sin dejar tiempo para que los espermatozoides se asienten fuera de
la suspensión.
3. Vuelva a mezclar la muestra de semen antes de retirar las alícuotas duplicadas (el segundo frotis se
usa como reserva en caso de que haya problemas con la tinción).
examen
2. Básico
Eyacula con características normales

En este procedimiento se unta una alícuota de semen sobre toda la superficie del portaobjetos
mediante la técnica de emplumado (Fig. 2.9).
1. Limpie ambas superficies de los portaobjetos esmerilados frotando enérgicamente con papel
de seda sin pelusa o limpiando con etanol.
examen
3. Extendido
2. Etiquete la porción helada con información de identificación con dos identificadores

únicos; asegurarse de que la marca no puede volverse ilegible por la fijación, tinción o
montaje.
3. Aplique una alícuota de 5–10 µl de semen, según la concentración de espermatozoides, al final del
portaobjetos. Use un segundo portaobjetos para jalar la gota de semen a lo largo de la superficie del
examenes
4. Avanzado
portaobjetos (Fig. 2.9). Si el portaobjetos de arrastre no está esmerilado, los bordes de ambos extremos del
portaobjetos se pueden utilizar para hacer cuatro frotis diferentes.
4. Deje que los portaobjetos se sequen al aire y tiñe como se describe enSección 2.4.9.2 en la página 46.
La calidad del frotis (superposición mínima de espermatozoides en el portaobjetos) depende de:

tecnicas
• el volumen de semen y la concentración de espermatozoides: cuantos menos espermatozoides,

menos probable es que se superpongan entre sí;
• el ángulo de la diapositiva de arrastre: cuanto menor sea el ángulo, más delgado será el frotis; y
• la velocidad de manchado: cuanto más rápido es el movimiento, más delgado es el frotis.
Comience con un volumen de 10 µl, un ángulo de 45° y un frotis de aproximadamente 1 segundo. Estos
de espermatozoides
parámetros se pueden variar, si es necesario, para reducir la superposición de los espermatozoides en el
portaobjetos.(95). El emplumado funciona bien cuando la viscosidad del semen es baja, pero a menudo no es
adecuado para semen extremadamente viscoso (Fig. 2.9).
Fig. 2.9 Preparación de un frotis de semen normal

Para familiarizarse con el movimiento, coloque la corredera de arrastre en un ángulo de 45° y muévala hasta que entre en contacto con la alícuota de semen.(a),
que corre a lo largo del borde del tobogán(b). Lleve el portaobjetos de arrastre lentamente hacia atrás (durante aproximadamente 1 segundo) a lo largo del
portaobjetos para producir el frotis (c).

8. Apéndices
(a) (b) (C)

9. Referencias
Fotografías cortesía de C. Brasil.
44
1. Introducción
Eyacula con características anormales

Con bajas concentraciones de espermatozoides (menos de 2×106/ml), muestras viscosas o cargadas de
desechos, es posible que se necesiten diferentes enfoques.
Eyacula con baja concentración de espermatozoides

examen
2. Básico
Si la concentración de espermatozoides es baja (por ejemplo, menos de 2×106/ml), concentrar la muestra de la
siguiente manera.
1. Centrifugar la muestra a 600 g durante 10 minutos.
2. Retire la mayor parte del sobrenadante.

examen
3. Extendido
3. Vuelva a suspender el sedimento en el resto del sobrenadante pipeteando suavemente.
4. Obtener la mayor concentración de espermatozoides posible, no superando aproximadamente

50×106/ml.
5. Tratar como una muestra normal (Sección 2.4.9.2 en la página 46).

examenes
4. Avanzado
Nota:Esta manipulación puede afectar la morfología espermática, y su uso debe quedar

registrado en el informe final.
Eyaculaciones viscosas
A veces es difícil preparar buenos frotis porque el plasma seminal es muy viscoso, lo que da
como resultado frotis de grosor irregular. Las muestras viscosas se pueden tratar de la misma
manera que las muestras mal licuadas (Sección 2.5.2 en la página 64) o por lavado.
tecnicas
Nota:Estas manipulaciones pueden afectar la morfología de los espermatozoides y su

uso debe registrarse.
Eyaculaciones viscosas o cargadas de desechos
Los desechos y una gran cantidad de material particulado (como en muestras viscosas) pueden hacer
que los espermatozoides se acuesten con la cabeza de lado, lo que dificulta su categorización. Estas
muestras se pueden lavar de la siguiente manera.
de espermatozoides
1. Diluya una alícuota de eyaculado bien mezclado (0,2–0,5 ml, según la concentración de
espermatozoides) con una solución salina 170 mM para reducir los cambios osmóticos en los
espermatozoides. Dependiendo de cuánto tiempo después de la preparación de la eyaculación, la
osmolalidad de la eyaculación puede haber aumentado a 350–400 mOsm/kg. Un medio isotónico a
la osmolalidad general del cuerpo (290 mOsm/kg) inducirá un choque hipotónico a los
espermatozoides adaptados a la mayor osmolalidad del eyaculado licuado.(17, 18).
2. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos.
3. Decantar la mayor parte del sobrenadante.
4. Vuelva a suspender el precipitado en el sobrenadante restante (típicamente 20–40 µl) pipeteando

8. Apéndices
suavemente.
5. Haga un frotis de la suspensión esparciendo de 5 a 10 µl de suspensión de esperma en un

portaobjetos de microscopio con una pipeta Pasteur (Fig. 2.9b).
6. Escanee el portaobjetos con óptica de contraste de fase con un aumento de ×400 para asegurarse de que el frotis se
distribuya uniformemente.
9. Referencias
45
1. Introducción
7. Verifique que haya al menos 40 espermatozoides por campo de ×400 sin aglomeraciones ni
superposiciones.
8. Permita que los portaobjetos se sequen al aire y tiñe como se describe en la Sección 2.4.9.2.
examen
2. Básico
• Si hay demasiados espermatozoides superpuestos en el portaobjetos, haga otro frotis con una
alícuota más pequeña de eyaculado.
• Si los espermatozoides son demasiado escasos en el portaobjetos, haga otro frotis con una alícuota más
grande de eyaculado.
• Estas manipulaciones pueden afectar la morfología de los espermatozoides y su uso debe

examen
3. Extendido
registrarse.
2.4.9.2 Fijación y tinción
Una vez que los frotis de eyaculado se han secado al aire, deben fijarse y teñirse para
resaltar los detalles de los espermatozoides. Se recomienda el uso de la tinción de
examenes
4. Avanzado
Papanicolaou, ya que se han realizado validaciones y evaluaciones exhaustivas para los

criterios estrictos de Tygerberg utilizando este tipo de tinción, que brinda la mejor
visibilidad general de todas las regiones del espermatozoide humano.(95, 110-113). El uso
de otras tinciones debe validarse en comparación con la tinción de Papanicolaou descrita
adaptada para espermatozoides humanos.
Con el método de tinción recomendado en óptica de campo claro (iluminación de Köhler), la

tecnicas
cabeza se tiñe de azul pálido en la región acrosomal y de azul oscuro en la región

postacrosomal. Tiñe las regiones acrosomales y post-acrosómicas de la cabeza, el exceso de
citoplasma residual, la pieza intermedia y la pieza principal. La pieza intermedia puede mostrar
algunas manchas rojas y la cola está teñida de azul o rojizo. El exceso de citoplasma residual,
por lo general ubicado detrás de la cabeza y alrededor de la pieza intermedia, suele teñirse de
verde; si es de color rojizo, puede indicar otras anomalías.
La tinción de Papanicolaou también da una buena tinción de otras células. La técnica de tinción
de espermatozoides
descrita aquí a veces es útil para distinguir entre células germinales inmaduras y células no
espermáticas (Figura 2.15 en la página 62yFigura 2.16 en la página 63). Los procedimientos de
rutina se han modificado para trabajar sin éter (como fijador) o xileno (para montaje)(114)) (Sección
2.4.9.3). Los portaobjetos teñidos con el procedimiento de Papanicolaou se pueden montar y
almacenar de forma permanente para su uso futuro en programas de formación y control de calidad
interno. Si se almacenan en la oscuridad, deberían ser estables durante meses o años.
Hay algunas otras técnicas comunes descritas en la última parte de este capítulo: Tinción
corta y rápida. La razón de recomendar la tinción de Papanicolaou es que sigue siendo la
técnica mejor evaluada. Para un uso global, es fundamental que las técnicas y los criterios
de evaluación estén estandarizados. Se pueden usar otras técnicas, pero con una
evaluación y validación adecuadas con técnicas estándar, especialmente si se usan para
estudios científicos.
8. Apéndices
9. Referencias
46
1. Introducción
2.4.9.3 Fijación y Papanicolaou1pasos de tinción

Esto implica los siguientes pasos.
Tabla 2.5 Pasos de fijación y tinción de Papanicolaou

examen
2. Básico
FIJACIÓN
Etanol 95% (v/v) al menos 15 minutos arreglar las celdas; tambien los deshidrata
TINCIÓN
rehidratar gradualmente los frotis fijados para

1 Etanol graduado 80% (v/v)2 30 segundos
permitir la tinción con hematoxilina soluble en agua
examen
3. Extendido
2 Etanol graduado 50% (v/v) 30 segundos
para rehidratar frotis secos para

3 Agua purificada 30 segundos
permitir la tinción soluble en agua
4 Hematoxilina de Harris 4 minutos teñir el núcleo de azul
5 Agua purificada 30 segundos para eliminar la hematoxilina nuclear no unida

examenes
4. Avanzado
para eliminar el tinte no unido

6 etanol ácido3 4–8 inmersiones4,5
específicamente del citoplasma (destinción)
7 Agua purificada 30 segundos para reducir la acidez y devolver el color azul al

núcleo; La solución de Scott se puede utilizar si el
8 Agua corriente fría del grifo 5 minutos agua del grifo es insuficiente
9 Etanol 50% (v/v) 30 segundos

tecnicas
para deshidratar frotis para permitir la tinción

con Orange G/EA–50 soluble en etanol
11 Etanol 95% (v/v) al menos 15 minutos
12 G-6 tinción naranja 1 minuto teñir el citoplasma de rosa

de espermatozoides
dieciséis EA-50 mancha verde 1 minuto para teñir el citoplasma y los nucléolos de rosa
19 100%
Etanol 15 segundos deshidratar gradualmente los frotis teñidos para permitir el
20 Etanol 100% 15 segundos uso de medios de preparación solubles en etanol
21 xileno para permitir el uso de medios de montaje insolubles en etanol

8. Apéndices
1 Tinciones constituyentes de Papanicolaou: comercialmente disponibles o verSección 8.4.11 en la página 229.

2 La fijación de etanol provoca la deshidratación de las células. Por lo tanto, los frotis tomados directamente del paso de fijación
en etanol al 95 % para la tinción puede necesitar solo 10 segundos en el etanol al 80 %, mientras que los frotis que se secaron al
aire después de la fijación deben permanecer más tiempo (2 a 3 minutos) en el etanol al 50 %.
3 Etanol ácido: añadir 1,0 ml de ácido clorhídrico concentrado a 200 ml de etanol al 70% (v/v).
4Una inmersión corresponde a una inmersión de aproximadamente 1 segundo.
5 Comience con cuatro inmersiones; continuar hasta que los resultados sean satisfactorios. Este es un paso crítico, ya que la duración de la
la tinción altera dramáticamente la intensidad final de la tinción. Si se omite este paso, los espermatozoides y el fondo quedarán
9. Referencias
oscuros. Aumentar el número de inmersiones hará que los espermatozoides y el fondo sean más débiles.
47
1. Introducción
Los portaobjetos se pueden ver sin montar o montados (sin o con un cubreobjetos adjunto). El
montaje de los portaobjetos permite el almacenamiento a largo plazo, de modo que puedan volver a
evaluarse si es necesario y utilizarse en un programa de control de calidad interno (IQC). El índice de
refracción (IR) de los medios de montaje después del secado (1,498–1,55) es similar al del vidrio (1,50–
1,58), y la mejor calidad óptica se logra con el uso de aceite de inmersión, que tiene un IR similar
examen
2. Básico
(1,515).
2.4.9.4 Tratamiento del frotis de eyaculado teñido antes del montaje
Hay dos tipos de fluidos para montar la preparación: medios de montaje solubles en
etanol e insolubles en etanol.
examen
3. Extendido
• Utilice medios de montaje solubles en etanol directamente sobre frotis aún húmedos con etanol.
• Si utiliza medios de montaje insolubles en etanol, tome los portaobjetos directamente desde el paso
19 anterior hasta los siguientes pasos (a realizar en una vitrina de gases):
• sustituto de xileno:6etanol, 1+1 (1 : 2) 1 minuto

examenes
4. Avanzado
• 100% sustituto de xileno 1 minuto
• Retire un portaobjetos a la vez del recipiente de tinción con sustituto de xileno y deje que se
escurra durante solo 1 o 2 segundos, ya que el portaobjetos debe estar bastante húmedo con
xileno durante el montaje.
tecnicas
2.4.9.5 Montaje de frotis de eyaculado teñidos
Al montar los frotis teñidos, no hay riesgo de contaminación de los objetivos del
microscopio.
1. Coloque el cubreobjetos (24 mm × 50 mm o 24 mm × 60 mm) sobre una toalla de papel doblada.

de espermatozoides
2. Coloque el soporte en forma de mancuerna sobre el cubreobjetos.
3. Luego coloque el portaobjetos, con el frotis hacia abajo, sobre el cubreobjetos.
4. Presione el portaobjetos para esparcir el medio de montaje.

5. Deje que el frotis montado se seque horizontalmente, con el cubreobjetos hacia arriba, en una gradilla de secado de
portaobjetos o sobre papel absorbente durante la noche en una vitrina de gases.
2.4.9.6 Examen de la preparación teñida
Clasificación de la morfología de los espermatozoides
Para una evaluación útil de la morfología de los espermatozoides, es esencial que sea realizada
8. Apéndices
por personal de laboratorio capacitado que realiza IQC regularmente. Para realizar
comparaciones entre laboratorios e implementar técnicas y límites de decisión desarrollados en
otros centros, es fundamental participar también en evaluaciones externas de calidad (EQA)
adecuadas. La clasificación recomendada aquí es la de los espermatozoides como ideal
6 El xileno es un peligro para la salud y no debe usarse. Ahora hay sustitutos, como NeoClear.
9. Referencias
48
1. Introducción
("típico de los espermatozoides capaces de llegar al sitio de la fertilización") o anormal, basado

en el reconocimiento de anomalías en todas las ubicaciones del espermatozoide. Para realizar
una evaluación morfológica adecuada, el individuo debe estar familiarizado con todos los
criterios, lo que significa que incluso si el laboratorio elige informar solo la proporción de
espermatozoides ideales o anormales, IQC y EQA deben evaluar la capacidad de reconocer
examen
2. Básico
correctamente las anomalías en todas las ubicaciones. Los siguientes criterios deben aplicarse
al evaluar la normalidad morfológica del espermatozoide(95, 99, 115).
Los espermatozoides están formados por una cabeza y una cola. La parte de la cola que está
conectada a la cabeza y la parte más gruesa que contiene las mitocondrias se llama pieza
intermedia. El resto de la cola consta de la pieza principal (un axonema o estructura ciliar
rodeada de fibras densas externas) y una vaina fibrosa con columnas longitudinales.(116)y una
examen
3. Extendido
pieza final. Como la pieza final es difícil de ver con un microscopio óptico, se puede considerar
que la célula comprende una cabeza (y cuello) y una cola (pieza intermedia y pieza principal).
Para que un espermatozoide se considere sin anomalías, la cabeza, la pieza intermedia, la cola y
el residuo citoplasmático deben considerarse normales. Todas las formas limítrofes deben
considerarse anormales.
En general, la forma de la cabeza parece ser más importante que el tamaño exacto (Sección 2.5.16 en la
examenes
4. Avanzado
página 80). Cabe señalar que las cabezas anormalmente grandes no son normales: los espermatozoides
diploides existen con un área lateral plana de la cabeza ~1,6 veces el tamaño de una cabeza de
espermatozoide ideal. La evaluación de la morfología normal de los espermatozoides se puede aplicar mejor
aprendiendo a reconocer las variaciones sutiles en la forma de todo el espermatozoide (cabezas y colas de los
espermatozoides normales/en el límite;higos. 2.13, 2.14 y 2.15).
La espermatogénesis defectuosa y algunas patologías del epidídimo se asocian

tecnicas
comúnmente con un mayor porcentaje de espermatozoides con formas anormales. Los

defectos morfológicos suelen ser mixtos. Los espermatozoides anormales generalmente
tienen un potencial fertilizante más bajo, según los tipos de anomalías, y también pueden
tener ADN anormal. Los defectos morfológicos se han asociado con una mayor
fragmentación del ADN.(117), una mayor incidencia de aberraciones cromosómicas
estructurales(118), cromatina inmadura(119)y aneuploidía(120, 121). Por lo tanto, se hace
hincapié en la forma de la cabeza, aunque también es importante tener en cuenta la cola
del espermatozoide (pieza intermedia y pieza principal) para comprender el aparato
de espermatozoides
reproductor masculino.
Residuos citoplasmáticos(122)son componentes normales de los espermatozoides humanos

fisiológicamente funcionales. Los residuos citoplasmáticos son osmóticamente sensibles y no
se conservan bien mediante los procedimientos de secado al aire de rutina.(109, 123). No son
evidentes en las preparaciones teñidas, donde pueden aparecer como pequeñas distensiones
de la pieza intermedia. Si están hinchados, pueden extenderse a lo largo de la pieza intermedia,
como se observa por contraste de fase, contraste de interferencia diferencial y microscopía de

rayos X de células vivas en semen, moco cervical y medio.(108, 124). El exceso de citoplasma
residual se asocia con espermatozoides anormales producidos por un proceso de espermiación
defectuoso. Este exceso anormal de citoplasma no debe confundirse con residuos
citoplasmáticos más fisiológicos que se pueden observar en microscopía directa del eyaculado
pero no en frotis de morfología secos, fijados y teñidos.(dieciséis).
8. Apéndices
Las colas enrolladas (más de 360°, fig. 2.10) pueden indicar disfunción del epidídimo(125).
9. Referencias
49
1. Introducción
Fig. 2.10 Dibujos esquemáticos de algunas formas anormales de espermatozoides humanos
A. Defectos de la cabeza
(a) (b) (C) (d) (mi) (F)

cónico piriforme Redondo Amorfo vacuolado Pequeña
examen
2. Básico
acrosomal
No Pequeña
área
acrosoma
examen
3. Extendido
B. Defectos en el cuello y la pieza intermedia C. Defectos de la cola D. Exceso residual

examenes
4. Avanzado
citoplasma
(gramo) (h) (i) (j) (k) (l) (metro) (norte)
cuello doblado Asimétrico Grueso Delgada Corto Doblado Enroscado > un tercio
inserción cabeza
tecnicas
de espermatozoides
8. Apéndices
9. Referencias
50
1. Introducción
Tabla 2.6 Clasificación de la morfología de los espermatozoides
Ubicación Apariencia normal (ideal/típica) Anormal
• acrosoma inferior al 40% o superior al 70% del área normal de

La cabeza debe ser lisa, de contorno regular
la cabeza, o
examen
2. Básico
y generalmente de forma ovalada. Debe

haber una región acrosomal bien definida • relación de largo a ancho inferior a 1,5 (redonda) o superior a
que comprenda del 40 al 70% del área de la 2 (alargada), o
cabeza (96). La región acrosomal no debe • forma: forma piriforme (en forma de pera), amorfa,
Cabeza contener vacuolas grandes y no más de dos asimétrica o no ovalada en la parte apical, o
vacuolas pequeñas, que no deben ocupar
más de una quinta parte de la cabeza del • las vacuolas constituyen más de una quinta parte del área de la cabeza o
examen
3. Extendido
están ubicadas en el área post-acrosómica, o

espermatozoide. La región post-acrosómica
no debe contener vacuolas. • cabezas dobles, o
• cualquier combinación
• forma irregular, o
La pieza intermedia debe ser delgada, regular y
• delgado o grueso, o
aproximadamente del mismo largo que la cabeza del
examenes
4. Avanzado
pieza intermedia espermatozoide. El eje principal de la pieza • inserción asimétrica o en ángulo en la cabeza, o
intermedia debe estar alineado con el eje principal de
• muy doblado, o
la cabeza del espermatozoide.
• curvas con ángulos pronunciados, o

La pieza principal debe tener un calibre
uniforme en toda su longitud, ser más
• suaves curvas cerradas, o
tecnicas
delgada que la pieza intermedia y tener • enrollado, o

una longitud aproximada de 45 µm
Cola • corto (roto), o
(alrededor de 10 veces la longitud de la
cabeza). Se puede enrollar sobre sí mismo, • ancho irregular, o
siempre que no haya una angulación
• múltiples colas, o
pronunciada que indique un flagelo roto.
de espermatozoides
Las gotitas citoplasmáticas (menos de un tercio

citoplasmático • El citoplasma residual se considera una anomalía solo cuando supera un
del tamaño normal de la cabeza de un
residuo tercio del tamaño normal de la cabeza del espermatozoide.
espermatozoide) son normales.
Categorías de anormalidades en los espermatozoides
Las categorías, o regiones, de interés son:

• cabeza (%H)
• cuello y pieza intermedia (%NM)
• cola (%T)
• exceso de citoplasma residual (%C).

8. Apéndices
Se puede utilizar un contador de teclas múltiples, con una tecla para normal (ideal, típica), una
para anormal y una para cada una de las cuatro categorías anormales (H, NM, T, C). Se puede
usar un contador mecánico para ingresar múltiples anormalidades manteniendo presionada la
primera tecla mientras ingresa las otras anormalidades observadas en un solo
9. Referencias
51
1. Introducción
esperma. Mediante esa operación, cada espermatozoide se cuenta una sola vez y cada una de sus
anomalías se puntúa por separado.
• A partir de la evaluación de 200 espermatozoides, es posible obtener el porcentaje de

espermatozoides ideales y anormales (las dos cifras deben sumar 100%), así como el
examen
2. Básico
porcentaje con cada tipo de anomalía, es decir, %H, %NM, % T y %C (la suma de estas
últimas cifras debe ser superior al 100% si la evaluación se realiza correctamente).
• El porcentaje de espermatozoides en estas clases de anormalidad se obtiene dividiendo el

número total de espermatozoides con un defecto en la categoría por el número total
puntuado. Estos números se utilizan para calcular el índice de teratozoospermia (TZI) (
examen
3. Extendido
Sección 3.2 en la página 86).
Descripciones de otros defectos espermáticos específicos y otros tipos de células
Ocasionalmente, muchos espermatozoides tendrán un defecto estructural específico. Por

ejemplo, el acrosoma puede no desarrollarse, dando lugar al “defecto de cabeza redonda” o
“globozoospermia”. Si la placa basal no se adhiere al núcleo en el polo opuesto al acrosoma en
la espermiación, las cabezas se absorben y solo se encuentran colas en el semen (el llamado
examenes
4. Avanzado
"defecto de cabeza de alfiler"). Las cabezas de alfiler (colas libres) no se cuentan como defectos
de cabeza, ya que no poseen cromatina ni estructura de cabeza anterior a la placa basal. Los
pacientes cuyos espermatozoides presentan uno de estos defectos suelen ser estériles. Tales
casos son raros, pero es fundamental que se identifiquen y se notifiquen correctamente. Si hay
muchas cabezas de alfiler o cabezas libres, se puede determinar su prevalencia en relación con
los espermatozoides (Secciones 2.5.16 y 2.5.17).
tecnicas
Informar la presencia y prevalencia relativa a los espermatozoides de:
• defectos espermáticos específicos, por ejemplo, cabezas de esperma libres, cabezas de alfiler (colas libres), cabezas que
carecen de acrosomas
• células germinales inmaduras (figs. 2.15 y 2.16)
• células no espermáticas (figs. 2.15 y 2.16).

de espermatozoides
Si hay muchos defectos de este tipo o células no espermáticas, se puede determinar su prevalencia en
relación con los espermatozoides.
Una orden estructurada para la evaluación de la morfología del esperma humano

La didáctica evaluación secuencial de cada espermatozoide es útil tanto en el
entrenamiento como en la realización de análisis de rutina(126).
8. Apéndices
9. Referencias
52
1. Introducción
Fig. 2.11 Orden estructurado para la evaluación de la morfología del esperma humano
Identificar el tipo de célula:

No
leucocito, célula germinal
¿Es un espermatozoide?
examen
2. Básico
u otro objeto(puntúe por

separado si es necesario)
Sí
No
Puede ser
Detener: ir a la siguiente celda
clasificado*?
examen
3. Extendido
Sí
Es grande
Sí Puntajeesperma anormal
citoplasmático
ycitoplasmático
residuo visible?
examenes
4. Avanzado
Anormalidad de residuos
No
es la cola
(si no por encima) yCola
¿anormal?
Anomalía
tecnicas
No
es la pieza intermedia
(si no por encima) ypieza intermedia
¿anormal?
Anomalía
de espermatozoides
No
es la cabeza
(si no por encima) yCabeza
¿anormal?
Anomalía
No
Puntajeespermatozoide ideal Detener: ir a la siguiente celda
* Completo con cabeza y cola, claramente visible y no superpuesto por otras celdas u
objetos
8. Apéndices
9. Referencias
53
1. Introducción
Evaluación microscópica y cálculos de resultados

Con el paradigma de evaluación de la morfología recomendado aquí, se deben considerar todas las
regiones funcionales del espermatozoide. No es necesario distinguir todas las variaciones en el
tamaño y la forma de la cabeza o los diversos defectos de la pieza central y la pieza principal. Incluso si
el laboratorio solo informa la proporción de espermatozoides ideales, el examinador en el laboratorio
examen
2. Básico
debe poder identificar todas las anomalías. La evaluación morfológica debe realizarse en cada
espermatozoide evaluable en varias áreas seleccionadas sistemáticamente del portaobjetos, para
evitar la selección sesgada de espermatozoides particulares.
Se recomienda comenzar examinando el frotis, por ejemplo, con un aumento total de ×400 (óptica de
campo claro) para obtener una impresión general de la distribución y apariencia de los
espermatozoides, otras células, desechos, etc.
examen
3. Extendido
La evaluación detallada se realiza utilizando un objetivo de campo claro de inmersión en aceite de ×100 y al
menos un ocular de ×10. El aceite de inmersión es esencial para obtener la mejor imagen en el microscopio
(índice de refracción, RI ~1,5).
1. Evalúe todos los espermatozoides en cada campo, moviéndose de un campo microscópico a otro.
examenes
4. Avanzado
• Evaluar sólo los espermatozoides intactos (aquellos con cabeza y cola). No incluya células
inmaduras en el recuento de espermatozoides. Las cabezas sin cola deben contarse por separado y
anotarse en el informe si hay más de 20 por 100 espermatozoides.
• No evalúe campos con espermatozoides superpuestos o con un espermatozoide lateral. Solo si

todos los campos tienen tal problema, se evalúan los espermatozoides en dichos campos, y luego
con un comentario adicional en el informe.
tecnicas
2. Evaluar al menos 200 espermatozoides, para lograr un error de muestreo aceptablemente bajo.
3. Contar el número de espermatozoides típicos o normales y anormalidades en las cuatro regiones

con la ayuda de un contador de laboratorio.
4. Calcula:
de espermatozoides
• las proporciones de formas típicas y las proporciones de anormalidades en las

diferentes regiones; y
• el TZI (la suma de todas las anormalidades dividida por la suma de los espermatozoides
anormales, dando siempre un resultado entre 1,00 y 4,00). El TZI tiene un máximo de cuatro
defectos por espermatozoide anormal: uno por cabeza, pieza intermedia y pieza principal, y
uno por exceso de citoplasma residual.
5. Informar los porcentajes de formas típicas al número entero más próximo y el TZI
con dos decimales.
8. Apéndices
9. Referencias
54
55
9
10
28
11
7
5
29
25
13
8
32
30
27
14
6
24
12
31
23
26
Placa 1
dieciséis
15
18
19
17
22
20
21
F
1. Introducción 2. Básico 3. Extendido 4. Avanzado 5. Preparación de esperma 6. Criopreservación 7. Garantía de calidad 8. Apéndices 9. Referencias
examen examen examenes tecnicas de espermatozoides y control de calidad
1. Introducción
Tabla 2.7 Placa de Papanicolaou 1
otra cabeza pieza principal esperma en general

Forma de la cabeza Comentarios de pieza intermedia
comentarios comentarios clasificación
1 normal normal normal normal

examen
2. Básico
2 anormal amorfo normal normal anormal
3 anormal amorfo grueso normal anormal
4 anormal normal normal anormal
5 anormal no ovalado grueso normal anormal

examen
3. Extendido
6 anormal no ovalado normal normal anormal
7 anormal aspiradora PA grueso normal anormal
9 anormal vacaciones normal normal anormal

examenes
4. Avanzado
11 anormal no ovalado grueso normal
13 anormal grueso/doblado normal anormal
14 anormal pequeña normal normal anormal

tecnicas
15 anormal grueso normal anormal
dieciséis anormal normal N/A anormal
17 normal normal normal Normal
18 normal normal normal Normal
19 normal grueso normal anormal

de espermatozoides
23 anormal grueso N/A anormal

26 anormal cónico grueso N/A anormal
28 normal grueso normal normal
29 anormal anormal
8. Apéndices
grueso normal
30 anormal no ovalado grueso duplicado
31 anormal asimétrico normal anormal
32 anormal no oval/PA vac normal normal anormal

9. Referencias
56
57
31
11
10
29
33
12
30
26
9
32
28
27
Plato 2
22
21
20
4
25
5
2
19
24
8
23
1
6
F
1. Introducción

1 normal normal anormal

examen
2. Básico
grueso
2 anormal normal normal normal

examen
3. Extendido
8 anormal normal asimétrico anormal
10 anormal normal N/A anormal

examenes
4. Avanzado
12 anormal grueso asimétrico anormal
13 normal normal N/A anormal

tecnicas
15 anormal pequeña grueso/asimétrico normal anormal
dieciséis anormal grueso normal anormal

de espermatozoides
23 anormal grueso anormal anormal
24 anormal demasiado ancho grueso anormal anormal

29
8. Apéndices
normal normal normal normal
32 anormal grueso asimétrico anormal
33 anormal cónico grueso normal anormal

9. Referencias
58
59
23
45
17
22
35
40
34
21
25
43
38
42
44
24
46
41
36
dieciséis
18
39
19
20
47
37
Plato 3
15
3
28
10
14
33
30
5
27
29
26
1
31
6
13
4
12
2
32
11
8
9
1. Introducción


examen
2. Básico
2 anormal grueso doblado anormal
3 anormal grueso/asimétrico N/A anormal
6
examen
3. Extendido
9 anormal aspiradora PA grueso normal anormal

examenes
4. Avanzado

tecnicas
dieciséis anormal grueso normal anormal
18 anormal normal N/A anormal

de espermatozoides
22 anormal cónico normal normal anormal
23 anormal grueso doble anormal
24 anormal pequeña grueso normal anormal

28 anormal grueso doblado anormal
30
8. Apéndices

9. Referencias
60
1. Introducción


examen
2. Básico

examen
3. Extendido
42 anormal asimétrico normal anormal
46 anormal anormal
examenes
4. Avanzado
normal normal
47 anormal grueso duplicado anormal

tecnicas
Célula Tipo de célula Célula Tipo de célula Célula Tipo de célula
1 macrófago 9 dividiendo la espermátide 17 división de espermatocitos
2 espermatozoide anormal 10 espermatocito 18 espermatozoide anormal
3 citoplasma 11 espermátida degenerada 19 citoplasma
4 espermatozoide anormal 12 espermátide 20 espermatozoide anormal
5 espermatocito 13 espermátida degenerada 21 espermátide

de espermatozoides
6 espermatozoide anormal 14 división de espermatocitos 22 macrófago fagocitador

espermatozoide anormal?
7 15 citoplasma 23 espermatocito
cabeza suelta en el citoplasma?
8 citoplasma dieciséis espermátida degenerada 24 citoplasma

Célula Tipo de célula Célula Tipo de célula Célula Tipo de célula
1 macrófago 7 espermátida degenerada 13 espermátida degenerada
2 8 14
8. Apéndices
espermatozoide anormal espermátida degenerada? espermátida degenerada
3 (dividiendo) espermátide 9 espermátida degenerada 15 espermátida degenerada
4 (dividiendo) espermátide 10 espermátida degenerada dieciséis macrófago
5 citoplasma 11 macrófago
6 no clasificable 12 espermátida degenerada

9. Referencias
61
62
Fig. 2.15 Placa de Papanicolaou 4

63
Fig. 2.16 Placa de Papanicolaou 5

1. Introducción
2.5 Información adicional y comentarios
2.5.1 Antecedentes para la evaluación del volumen del eyaculado

• El volumen medido con una pipeta de medición siempre se verá afectado por una pérdida de 0,3–
examen
2. Básico
0,9 ml(50, 51, 127). También puede haber burbujas de aire invisibles dentro de una pipeta
volumétrica que pueden causar una sobreestimación del volumen de eyaculación. Además, se
pierde algo de volumen en la propia pipeta, lo que puede dificultar otras evaluaciones en
eyaculados de bajo volumen.
• El bajo volumen de semen es característico de la obstrucción del conducto eyaculador o ausencia

congénita bilateral de los conductos deferentes (CBAVD)(128-131), una condición en la que las
examen
3. Extendido
vesículas seminales también están poco desarrolladas.
• El bajo volumen de semen también puede ser el resultado de problemas de recolección (pérdida de una
fracción del eyaculado), eyaculación retrógrada parcial o deficiencia de andrógenos.
• Un alto volumen de semen puede reflejar una exudación activa en casos de inflamación activa de
los órganos accesorios.
examenes
4. Avanzado
2.5.2 Problemas de licuefacción
• Ocasionalmente, las muestras pueden no licuarse, lo que hace prácticamente imposible la

evaluación diagnóstica del semen. En estos casos, el tratamiento adicional, la mezcla
mecánica o la digestión enzimática pueden permitir evaluaciones adicionales, pero las
tecnicas
manipulaciones afectarán la bioquímica del plasma seminal, la motilidad y la morfología de

los espermatozoides, y su uso debe informarse. La dilución del semen con medio de cultivo
debe tenerse en cuenta al calcular la concentración de esperma. Se debe utilizar el pipeteo
de desplazamiento positivo del semen para permitir la mayor precisión posible.
• Algunas muestras se pueden inducir a licuar mediante la adición de un volumen igual de

medio fisiológico o solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, verSección 8.4.5 en
la página 227, seguido de pipeteo suave repetido. Sin embargo, la adición de un medio de
de espermatozoides
cultivo cambiará la motilidad y concentración de los espermatozoides, así como los

marcadores bioquímicos.
• La falta de homogeneidad se puede reducir mediante el paso suave repetido (6 a 10 veces) a través
de una aguja roma de calibre 18 (diámetro interno 0,84 mm) o calibre 19 (diámetro interno 0,69
mm) conectada a una jeringa. Sin embargo, esto no se recomienda, ya que es probable que las
fuerzas de cizallamiento dañen los espermatozoides y, por lo tanto, afecten negativamente la
integridad del ADN.(132).
• La digestión por bromelina, una enzima proteolítica de amplia especificidad (EC 3.4.22.32), puede ayudar a
promover la licuefacción, pero cambiará tanto los marcadores bioquímicos como la motilidad de los
espermatozoides.
Prepare 10 UI/ml de bromelina en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Sección
8.4.5 en la página 227); es difícil de disolver, pero, al mezclar, la mayoría debería disolverse en 15 a
8. Apéndices
20 minutos. Diluir el semen 1+1 (1 : 2) con 10 UI/ml de bromelina, agitar con la punta de una pipeta
e incubar a 37 °C durante 10 minutos. Mezcle bien la muestra antes de continuar con el análisis.
9. Referencias
64
1. Introducción
2.5.3 Evaluaciones alternativas de viscosidad

• Alternativamente, la viscosidad se puede evaluar introduciendo una varilla de vidrio en
la muestra y observando la longitud del hilo que se forma al retirar la varilla.
• A diferencia de una muestra parcialmente sin licuar, una muestra de eyaculado viscoso muestra
examen
2. Básico
una pegajosidad homogénea y su consistencia no cambiará con el tiempo. La alta viscosidad puede
dificultar la evaluación adecuada de la motilidad y concentración de los espermatozoides, la
detección de anticuerpos antiespermatozoides y la evaluación de marcadores bioquímicos. Los
métodos para reducir la viscosidad son los mismos que para los problemas de licuefacción (Sección
2.5.2 en la página 64) y, por lo tanto, afectará a varios aspectos de las características de la
eyaculación. Incluso si la viscosidad puede mejorarse, afectará los resultados del examen de
eyaculación.
examen
3. Extendido
2.5.4 pH del eyaculado
• Si el pH es inferior a 7,0 en un eyaculado sin espermatozoides, puede haber una ausencia

congénita bilateral de los conductos deferentes.(129-131, 133), y debido al origen
embrionario común, las vesículas seminales también pueden faltar o estar poco
examenes
4. Avanzado
desarrolladas, lo que provoca un bajo volumen y un pH bajo.
• Para muestras viscosas, el pH de una pequeña alícuota del eyaculado se puede medir
utilizando un medidor de pH diseñado para la medición de soluciones viscosas.(134).
2.5.5 Mezcla de muestras

tecnicas
• Alternativamente, la mezcla se puede lograr aspirando la muestra ~ 10 veces en una pipeta de

plástico desechable de calibre ancho (apertura de aproximadamente 1,5 mm de diámetro) (estéril
cuando sea necesario). Entonces se debe tener cuidado de no causar burbujas de aire. No mezcle
con un mezclador de vórtice, ya que esto dañará los espermatozoides.
2.5.6 Preparación húmeda – principios

de espermatozoides
• El volumen de eyaculado y las dimensiones del cubreobjetos (tamaño y peso) deben ajustarse para dar una
preparación de profundidad fija de unos 20 mm, que permita que los espermatozoides naden libremente.(
135, 136). Es probable que una preparación más profunda cause dificultades, porque la profundidad focal
del microscopio no abarcará toda la profundidad de la preparación, lo que hará que los espermatozoides
aparezcan y desaparezcan a medida que se acercan y desenfocan.

• La profundidad de una preparación (Dµm) se obtiene dividiendo el volumen de la muestra (V, µl =

mm3) por la superficie sobre la que se extiende (A, mm2):D=V/A. Así, un volumen de 10 ml en un
portaobjetos de vidrio limpio y cubierto con un cubreobjetos de 22 mm × 22 mm (área 484 mm2)
proporciona una cámara de 20,7 µm de profundidad.
2.5.6.1 Probabilidad de espermatozoides no detectados al escanear preparaciones

8. Apéndices
húmedas
Si no se detectan espermatozoides en una o dos preparaciones húmedas, existe una baja

probabilidad de que todavía existan espermatozoides en el eyaculado, en parte dependiendo
del volumen total del eyaculado. La probabilidad de un cierto número de espermatozoides no
detectados se puede estimar calculando el intervalo de confianza del valor de un Poisson
9. Referencias
sesenta y cinco
1. Introducción
distribución(137)–lo que significa que si no se encuentran espermatozoides en la preparación húmeda,

se espera encontrar menos espermatozoides que los que se muestran en la Tabla 2.12 en todo el
eyaculado con un 95 % y un 99,5 % de probabilidad, respectivamente. La tabla muestra los resultados
de diferentes volúmenes y de una o dos preparaciones húmedas de 10 µl examinadas.
examen
2. Básico
Tabla 2.12 Probabilidad de espermatozoides no detectados al escanear preparaciones húmedas
esperma no detectado esperma no detectado

Eyacular (95% intervalo de confianza) (intervalo de confianza del 99,5 %)
volumen (ml)
10 µl 20 µl 10 µl 20 µl
examen
3. Extendido
1 300 150 530 265

2 600 300 1060 530
4 1200 600 2120 1060
8 2400 1200 4240 2120
examenes
4. Avanzado
2.5.6.2 Probabilidad de espermatozoides no detectados después de la centrifugación

Si no se detectan espermatozoides en una o dos preparaciones húmedas de gránulos de
centrifugación, existe una baja probabilidad de que aún existan espermatozoides en el
eyaculado, en parte dependiendo del volumen total del eyaculado. La probabilidad de un cierto
número de espermatozoides no detectados se puede estimar calculando el intervalo de
confianza del valor de una distribución de Poisson(137)–lo que significa que si no se encuentran
tecnicas
espermatozoides en la preparación húmeda, se espera encontrar menos espermatozoides que

los que se muestran en la Tabla 2.13 en todo el eyaculado con un 95 % y un 99,5 % de
probabilidad, respectivamente. La tabla muestra los resultados de diferentes volúmenes y de
una o dos preparaciones húmedas de 10 µl examinadas. En la tabla, la concentración por
centrifugación se ha calculado como de 1 ml a 50 µl (20x).
Tabla 2.13 Probabilidad de espermatozoides no detectados después de la centrifugación

de espermatozoides
esperma no detectado esperma no detectado

Eyacular (95% intervalo de confianza) (intervalo de confianza del 99,5 %)
volumen (ml)
10 µl 20 µl 10 µl 20 µl
1 15 8 27 14
2 30 15 53 27
4 60 30 106 53
8 120 60 212 106
2.5.7 Aglutinados espermáticos

8. Apéndices
• La presencia de aglutinación no es evidencia suficiente para deducir una causa inmunológica

de infertilidad pero sugiere la presencia de anticuerpos antiespermatozoides; es posible que
se requieran más pruebas (Sección 3.7 en la página 119).
• La aglutinación severa puede afectar la evaluación de la motilidad y concentración de los espermatozoides.

9. Referencias
66
1. Introducción
2.5.8 Cámaras de recuento de espermatozoides
• Los espermatozoides se adhieren fácilmente a las superficies de vidrio. Por lo tanto, es esencial una
limpieza a fondo.
• Limpie la cámara del hemocitómetro y el cubreobjetos con agua y detergente.

examen
2. Básico
• Frotar suavemente la superficie de la rejilla eliminará los espermatozoides residuales de la

muestra anterior.
• Seque bien con un pañuelo después de su uso, ya que cualquier residuo seco puede inhibir la carga.
• De acuerdo con las normas de salud y seguridad existentes, el riesgo de contaminación con un agente
examen
3. Extendido
potencialmente infeccioso debe contrarrestarse, por ejemplo, empapando las cámaras reutilizables y los
cubreobjetos durante la noche en desinfectante (Sección 8.2.5 en la página 219)
• Hay cámaras desechables disponibles para determinar la concentración de espermatozoides(

86, 138-141), pero pueden producir resultados diferentes a los del hemocitómetro de
Neubauer mejorado.
examenes
4. Avanzado
• Las cámaras poco profundas (típicamente de 20 µm) que se llenan por acción capilar no
tienen una distribución uniforme de los espermatozoides debido al efecto de la transmisión.(
142, 143). Podría ser posible corregir esto(143), pero no se recomienda(144).
2.5.9 Área y volumen de un campo de microscopía de alta potencia (HPF)

tecnicas
El volumen de semen observado en cada campo microscópico depende de la profundidad

de la preparación y del área del campo (πr2, donde π es aproximadamente 3.142 y res el
radio del campo microscópico) y la profundidad de la cámara (20,7 µm para la
preparación húmeda). El diámetro del campo microscópico se puede medir con un
micrómetro de platina o se puede estimar dividiendo el diámetro de la apertura de la
lente ocular por el aumento de la lente del objetivo.
Con un objetivo ×40 y un ocular ×10 de apertura de 20 mm, el campo del microscopio tiene un
de espermatozoides
diámetro de aproximadamente 500 µm (20 mm/40). En este caso,r=250 micras, r2= 62 500
Con un objetivo ×20 y un ocular ×10 de apertura de 20 mm, el campo del microscopio tiene un
diámetro de aproximadamente 1000 µm (20 mm/20). En este caso,r=500 micras, r2= 250 000
2.5.10 Pruebas de toxicidad de los recipientes de recolección de eyaculado
Seleccione al menos cinco eyaculados con alta concentración de esperma y buena motilidad de esperma. Los
eyaculados deben recogerse en los contenedores seguros conocidos (control) y luego transferir la mitad a los
contenedores desconocidos (prueba). Evaluar la motilidad de los espermatozoides (Sección 2.4.6 en la página
8. Apéndices
23) directamente y después de 4 horas. Se sugiere esta duración, ya que es el doble de cualquier tiempo
probable de exposición del semen al recipiente. Se debe utilizar semen nativo, ya que ese es el fluido expuesto
relevante. Si no hay diferencias en cada momento entre las evaluaciones de control y de prueba (PAGS>0,05 a
juzgar por una prueba t pareada), se puede considerar que los recipientes de prueba no son tóxicos para los
espermatozoides y cumplen con los requisitos de recolección de semen. Otros elementos utilizados en el
análisis de diagnóstico del semen, como las puntas de pipeta, deben probarse para ver si tienen efecto,
teniendo debidamente en cuenta el tiempo de exposición.

9. Referencias
67
1. Introducción
2.5.11 Recolección estéril de semen para reproducción asistida y crioalmacenamiento
Esto se realiza como para la recolección de diagnóstico, pero los recipientes de muestra, las puntas de
pipeta y las pipetas para mezclar deben estar estériles. Los requisitos legales pueden diferir, pero a
menudo se requiere que los procedimientos para la preparación de esperma reduzcan el riesgo de
examen
2. Básico
contaminación con microorganismos y otras partículas. A menudo se requiere un espacio limpio

(campana de flujo de aire laminar) y una calidad de aire controlada.
2.5.12 Recolección estéril de semen para análisis microbiológicos
Es bien sabido que es difícil obtener información útil a partir de cultivos microbiológicos de
examen
3. Extendido
semen. Por lo tanto, es importante minimizar la contaminación microbiológica de fuentes

distintas al semen (p. ej., organismos comensales de la piel). Los recipientes para muestras, las
puntas de pipeta y las pipetas para mezclar deben estar esterilizados. Lo ideal es tomar las
alícuotas para análisis microbiológicos antes de realizar cualquier otra evaluación del
eyaculado. El tiempo entre la recolección de la muestra de semen y el inicio de la investigación
por parte del laboratorio microbiológico no debe exceder las 3 horas.
examenes
4. Avanzado
El hombre debe:
• orinar;
• lavarse las manos y el pene con jabón, para reducir el riesgo de contaminación del
espécimen con organismos comensales de la piel;
tecnicas
• enjuague el jabón;
• secarse las manos y el pene con una toalla desechable nueva; y
• eyacular en un recipiente estéril.
2.5.13 Pruebas de vitalidad alternativas

de espermatozoides
2.5.13.1 Prueba de vitalidad con eosina sola
Este método es simple y rápido, pero las preparaciones húmedas no se pueden almacenar con fines
de control de calidad y se requiere una óptica de contraste de fase negativa para obtener resultados
confiables. Estas ópticas son muy difíciles de obtener, y el contraste de fase positivo más común hace
que las cabezas de color rosa tenue sean difíciles de discernir.
Preparando los reactivos

1. NaCl al 0,9 % (p/v): disolver 0,9 g de NaCl en 100 ml de agua purificada.
2. Eosina Y al 0,5 % (p/v): disolver 0,5 g de eosina Y (índice de color 45380) en 100 ml de NaCl al 0,9 %.
8. Apéndices
• Si una solución de eosina disponible comercialmente es una solución acuosa hipotónica, puede matar
algunos de los espermatozoides y dar resultados falsos positivos (75). Si usa una solución de este tipo, use
una solución salina de 170 mM para que sea aproximadamente isotónica con la eyaculación.(17).
9. Referencias
68
1. Introducción
Procedimiento
1. Mezcle bien el eyaculado.
2. Extraiga una alícuota de 5 µl de eyaculado y combínela con 5 µl de solución de eosina en un portaobjetos de
microscopio. Mezcle con la punta de una pipeta, haciendo girar la muestra en el portaobjetos.
examen
2. Básico
3. Cubrir inmediatamente con un cubreobjetos de 22 mm × 22 mm y dejar actuar durante 30 segundos.
4. Examine el portaobjetos con óptica de contraste de fase negativa con un aumento de ×200 o ×400.
5. Cuente el número de células teñidas (muertas) y no teñidas (vitales) con la ayuda de un

contador de laboratorio.
examen
3. Extendido
6. Evaluar 200 espermatozoides, para lograr un error de muestreo aceptablemente bajo.
7. Calcular la proporción de células vivas.
8. Reporte el porcentaje de espermatozoides vitales al número entero más cercano.

examenes
4. Avanzado
Puntuación
• Los espermatozoides vivos tienen cabezas blancas y los espermatozoides muertos tienen cabezas
teñidas de rojo o rosa.
• Si la mancha se limita solo a una parte de la región del cuello y el resto del área de la cabeza no está
manchada, esto se considera una "membrana del cuello con fugas", no un signo de muerte celular y
desintegración total de la membrana. Estas células deben evaluarse como vivas.
tecnicas
2.5.13.2 Prueba de vitalidad usando hinchazón hipoosmótica
Como alternativa a la exclusión del colorante, se puede utilizar la prueba de hinchazón hipoosmótica
para evaluar la vitalidad.(145). Esto es útil cuando se debe evitar la tinción de los espermatozoides, por
ejemplo, al elegir los espermatozoides para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
La prueba de hinchazón hipoosmótica supone que solo las células con membranas intactas (células
de espermatozoides
vivas) pueden hincharse en soluciones hipotónicas. Los espermatozoides con membranas intactas se
hinchan en 5 minutos en medio hipoosmótico y todas las formas flagelares se estabilizan en 30
minutos.(146).
• Use 30 minutos de incubación para diagnósticos de rutina.
•
Use 5 minutos de incubación cuando los espermatozoides se vayan a procesar para uso terapéutico.
Preparando los reactivos

1. Solución hinchante para diagnóstico: disolver 0,735 g de citrato de sodio dihidrato
y 1,351 g de D-fructosa en 100 ml de agua purificada.
• Se pueden congelar alícuotas de 1 ml de esta solución a –20 °C.

8. Apéndices
2. Para los espermatozoides destinados a la Reproducción Médicamente Asistida (MAR), diluir el

medio de cultivo a utilizar 1+1 (1 : 2) con agua purificada estéril apropiada.
9. Referencias
69
1. Introducción
Procedimiento
1. Descongele la solución de hinchamiento congelada y mezcle bien antes de usar.
2. Caliente 1 ml de solución de expansión o 1 ml de medio diluido 1+1 (1 : 2) en un tubo de

microcentrífuga cerrado a 37 °C durante 5 minutos.
examen
2. Básico
3. Mezcle bien el eyaculado.
4. Extraiga una alícuota de 100 µl de eyaculado y agréguela a la solución de hinchamiento. Mezcle suavemente
introduciéndolo y sacándolo de la pipeta.
5. Incube a 37 °C durante exactamente 5 minutos o 30 minutos (ver arriba), luego transfiera una
examen
3. Extendido
alícuota de 10 µl a un portaobjetos limpio y cubra con un cubreobjetos de 22 mm × 22 mm.
6. Vuelva a mezclar la muestra de semen, extraiga una alícuota duplicada, mezcle con la solución de expansión y prepare un
portaobjetos duplicado, como se indicó anteriormente.
7. Examine cada portaobjetos con óptica de contraste de fase con un aumento de ×200 o ×400.
examenes
4. Avanzado
8. Cuente el número de células no hinchadas (muertas) e hinchadas (vitales) con la ayuda de un

contador de laboratorio.
9. Evaluar 200 espermatozoides en cada repetición, para lograr un error de muestreo

aceptablemente bajo.
Puntuación
tecnicas
1. Los espermatozoides hinchados se identifican por cambios en la forma de la célula, como lo indica el
enrollamiento de la cola (Figura 2.16 en la página 63).
2. Las células vivas se distinguen por la evidencia de hinchazón de la cola del espermatozoide; puntúe todas las formas
de colas hinchadas como espermatozoides vivos.
Fig. 2.17 Representación esquemática de cambios morfológicos típicos en espermatozoides humanos sometidos a estrés hipoosmótico
de espermatozoides
(a) (b) (C) (d) (mi) (F) (gramo)

8. Apéndices
(a) = sin cambio; (b)–(g) = varios tipos de cambios de cola. La hinchazón en la cola está indicada por el área sombreada.
Reproducido de Jeyendran et al. (1984), con autorización.

9. Referencias
70
1. Introducción
Fig. 2.18 Fotomicrografías bajo microscopio de contraste de fase de espermatozoides sometidos a estrés hipoosmótico
1. Cola normal 2. Arrollamiento de la punta de la cola 3. <50% de la cola doblada 4. 50% de la cola doblada
examen
2. Básico
Cortesía de E. Holmes(147).
examen
3. Extendido
2.5.14 Técnicas de tinción de morfología alternativa
2.5.14.1 Tinción corta
La tinción de Shorr proporciona porcentajes similares de formas normales que la tinción de

examenes
4. Avanzado
Papanicolaou, pero no ha sido validada y evaluada con los estrictos criterios recomendados por
la OMS(148). Además, las comparaciones realizadas no evaluaron si la tinción de Shorr daba los
mismos resultados que la tinción de Papanicolaou adaptada a los espermatozoides.
reactivos
1. Hematoxilina de Harris (verSección 8.4.11.3 en la página 231): igual que la tinción de Papanicolaou.
tecnicas
2. Solución corta: compre ya preparada o prepárela de la siguiente manera. Disolver 4 g de

polvo Shorr en 220 ml de etanol tibio al 50 % (v/v). Dejar enfriar, añadir 2,0 ml de ácido
acético glacial (en una vitrina de gases) y filtrar.
3. Etanol acético: añadir 25 ml de ácido acético glacial a 75 ml de etanol al 95 % (v/v).
4. Etanol amoniacal: añadir 5 ml de hidróxido de amonio al 25 % (v/v) a 95 ml de

de espermatozoides
etanol al 75 % (v/v).
Fijación del frotis de eyaculado secado al aire
Sumergir los portaobjetos en etanol acético o etanol al 75 % (v/v) durante 1 hora.
Teñir el frotis de eyaculado fijo Sumergir

secuencialmente los portaobjetos en:
1. agua corriente 12–15 inmersiones7
2. hematoxilina 1–2 minutos
3. agua corriente 12–15 inmersiones

8. Apéndices
4. etanol amoniacal 10 inmersiones
5. agua corriente 12–15 inmersiones
6. Etanol al 50 % (v/v) 5 minutos

9. Referencias
7Una inmersión corresponde a una inmersión de aproximadamente 1 segundo.
71
1. Introducción
7. Mancha corta 3–5 minutos
8. Etanol al 50 % (v/v) 5 minutos
9. 75% (v/v) de etanol 5 minutos

examen
2. Básico
10. 95% (v/v) de etanol 5 minutos
Montaje del frotis de eyaculado teñido

Los portaobjetos se pueden ver sin montar o montados, pero los portaobjetos montados se pueden utilizar en
la formación y para IQC y comparación dentro del laboratorio. Además, no hay riesgo de contaminación de los
objetivos del microscopio cuando los portaobjetos están correctamente montados.

examen
3. Extendido
Fig. 2.19 Placa corta
9
10
examenes
4. Avanzado
3 2
1 12
11 13
5 14
4
15
tecnicas
6
7
dieciséis
17
de espermatozoides
24
25
18
19
20
21 26 28 27
29
30
31
8. Apéndices
22
23
32 33
9. Referencias
72
1. Introducción
Tabla 2.14 Placa corta

1 anormal sin acrosoma normal normal anormal

examen
2. Básico

examen
3. Extendido
7 anormal anormal normal anormal
9 anormal demasiado largo normal normal anormal

examenes
4. Avanzado

tecnicas
dieciséis anormal normal normal anormal

de espermatozoides

29
8. Apéndices
33 anormal anormal N/A anormal

9. Referencias
73
1. Introducción
2.5.14.2 Tinción rápida

Los métodos de tinción rápida pueden ser útiles cuando los resultados son necesarios el mismo día.
Están disponibles varios juegos de tinción diferencial, y aunque se han informado resultados similares(
149), otros estudios han señalado la necesidad de límites de referencia separados debido a las
diferencias en las anomalías detectadas(150, 151). Algunos frotis teñidos por procedimientos rápidos
examen
2. Básico
tienen una tinción de fondo alta y pueden ser de menor calidad que los teñidos con la tinción de
Papanicolaou. Más importante aún, los tamaños de las cabezas de los espermatozoides fijados y
teñidos difieren en comparación con la tinción de Papanicolaou.(152).
reactivos
• Kit de tinción rápida DiffQuik
examen
3. Extendido
• Fijador: metanol al 95 % (v/v) solo o 1,8 mg de triarilmetano disueltos en 1000 ml de

metanol al 95 % (v/v).
Fijación del frotis de eyaculado secado al aire
Sumerja los portaobjetos en fijador de triarilmetano durante 15 segundos o metanol al 95 % solo durante 1
hora. Drene el exceso de solución colocando los portaobjetos verticalmente sobre papel absorbente.
examenes
4. Avanzado
Teñir el frotis de semen fijado Sumergir

secuencialmente los portaobjetos en:
1. solución de tinción rápida 1 10 segundos
2. solución de tinción rápida 2 5 segundos

tecnicas
3. agua corriente del grifo 10–15 inmersiones para eliminar el exceso de tinte
Drene el exceso de solución en cada paso colocando los portaobjetos verticalmente sobre papel absorbente.
Montaje del semen teñido

Los portaobjetos se pueden ver sin montar o montados, pero los portaobjetos montados se pueden utilizar en
la formación y para IQC y comparación dentro del laboratorio. Además, no hay riesgo de contaminación de los
objetivos del microscopio cuando los portaobjetos están correctamente montados.

de espermatozoides
8. Apéndices
9. Referencias
74
75
23
9
8
18
6
5
dieciséis
22
20
19
7
17
21
DifQuick
14
15
13
3
1
10
4
Fig. 2.20 Placa DiffQuick
11
12
2
1. Introducción
Tabla 2.15 Placa DiffQuick


examen
2. Básico
5 anormal amorfo grueso normal anormal

examen
3. Extendido

examenes
4. Avanzado

tecnicas
dieciséis anormal amorfo grueso normal anormal
17 anormal cónico grueso normal anormal
18 normal asimétrico normal anormal

de espermatozoides
23 anormal no ovalado asimétrico normal anormal

8. Apéndices
9. Referencias
76
1. Introducción
2.5.15 Consideraciones estadísticas
2.5.15.1 Lograr 200 espermatozoides por réplica en las rejillas de la cámara

de Neubauer mejorada
examen
2. Básico
• Si hay 10 espermatozoides por HPF de la preparación húmeda, serían 2,5/nl y 250/cuadrícula

central. Diluir la muestra 1+1 (1 : 2) reduciría el fondo y el número de espermatozoides a
aproximadamente 125 por cuadrícula; evaluar una segunda cuadrícula aumentaría el
número a aproximadamente 250, lo cual es suficiente para un error de muestreo aceptable.
• Estas concentraciones calculadas son solo estimaciones aproximadas porque se cuentan

muy pocos espermatozoides y los volúmenes también son muy inexactos. Las
examen
3. Extendido
concentraciones estimadas de las preparaciones sin diluir pueden estar entre el 30% y el
130% de las concentraciones derivadas de muestras diluidas en cámaras de recuento.
2.5.15.2 Errores de muestreo estimados y límites de confianza según el número

total de espermatozoides contados
examenes
4. Avanzado
• Contar muy pocos espermatozoides producirá un resultado incierto, lo que puede tener
consecuencias para el diagnóstico y la terapia. Esto puede ser inevitable cuando los
espermatozoides se extraen con fines terapéuticos y el número de espermatozoides es bajo.
• Cuando el volumen de semen es pequeño y se cuentan menos espermatozoides de los

recomendados, la precisión de los valores obtenidos se reducirá significativamente. Si se
cuentan menos de 200 espermatozoides por repetición, informe el error de muestreo como
tecnicas
se indica en la Tabla 2.16.
• El error de muestreo es una medida del error esperado en los resultados en función del número de
observaciones. El intervalo de confianza del 95 % proporciona límites superior e inferior para el
rango en el que se encuentra el valor real de la población, en función del número de observaciones
en la alícuota investigada.
de espermatozoides
8. Apéndices
9. Referencias
77
1. Introducción
Cuadro 2.16 Errores muestrales redondeados (%) y límites del intervalo de confianza del 95%, según número total de espermatozoides contados
Número de Límites del intervalo de confianza del 95 % Número de Límites del intervalo de confianza del 95 %
Muestreo Muestreo
observaciones observaciones
error (%) error (%)
(NORTE) Más bajo Superior (NORTE) Más bajo Superior
examen
2. Básico
1 100 0 6 55 13 41 72
2 71 0 7 60 13 46 77
3 58 1 9 sesenta y cinco 12 50 83
4 50 1 10 70 12 55 88
5 45 2 12 75 12 59 94
examen
3. Extendido
6 41 2 13 80 11 63 100
7 38 3 14 85 11 68 105
8 35 3 dieciséis 90 11 72 111
9 33 4 17 95 10 77 116
examenes
4. Avanzado
10 32 5 18 100 10 81 122
15 26 8 25 150 8 127 176
20 22 12 31 200 7 173 230
25 20 dieciséis 37 250 6 220 283
30 18 20 43 300 6 267 336
tecnicas
35 17 24 49 350 5 314 389

40 dieciséis 29 54 400 5 362 441
45 15 33 60 450 5 409 494
50 14 37 66 500 4 457 546
de espermatozoides
2.5.15.3 Errores en la estimación de porcentajes
La certeza de una estimación de un porcentaje depende no solo del número (N) de

espermatozoides contados, sino también del porcentaje verdadero, pero desconocido (pags)
(Distribución binomial). El error estándar aproximado (SE) es √((pags(100–pags))/norte) para
porcentajes entre 20 y 80. Fuera de este rango, un método más adecuado a utilizar es la
transformación angular (arco sen raíz cuadrada),z=pecado–1√(pags/100), con una desviación
estándar de 1/(2√norte) radianes, que depende únicamente del número de espermatozoides

contados y no del porcentaje real.
8. Apéndices
9. Referencias
78
1. Introducción
2.5.15.4 Comparación de porcentajes de réplicas

Una diferencia mayor que la aceptable entre las réplicas sugiere que hubo un error de conteo o de
pipeteo, o que las células no se mezclaron bien, con una distribución no aleatoria en la cámara o en el
portaobjetos. Con estos valores de corte del intervalo de confianza del 95 %, aproximadamente el 5 %
de las réplicas estarán fuera de los límites solo por casualidad. Los límites de confianza binomiales
examen
2. Básico
exactos ahora se pueden generar por computadora, y estos se usan en este manual, redondeados
para asegurarse de que las probabilidades supuestas, por ejemplo, "menos del 5%", son correctas.
2.5.15.5 Importancia de contar un número suficiente de espermatozoides

examen
3. Extendido
Para reducir la influencia de la variación aleatoria, es importante que las evaluaciones se basen en un
número suficiente de observaciones (preferiblemente un total de al menos 400, de recuentos
repetidos de aproximadamente 200) (Tabla 2.16 en la página 78). La precisión de la estimación del
número de espermatozoides depende del número de espermatozoides contados. En una distribución
de Poisson, el SE de una cuenta (norte) es su raíz cuadrada (√norte), y el intervalo de confianza (IC) del
95% para el número de espermatozoides en el volumen de semen es de aproximadamentenorte±
1,96x√norte(onorte± aproximadamente 2x√norte).
examenes
4. Avanzado
Si se cuentan 100 espermatozoides, el EE es 10 (√100) y el IC del 95 % es 80–120 (100 ± 20

o 20 %). Si se cuentan 200 espermatozoides, el EE es 14 (√200) y el IC del 95 % es 172–228
(200 ± 28 o 14 %). Si se cuentan 400 espermatozoides, el EE es 20 (√400) y el IC del 95 % es
360–440 (400 ± 40 o 10 %).
Cabe señalar que con un punto de corte del 4% para formas ideales, sería necesario evaluar
tecnicas
más de 1500 espermatozoides para poder afirmar que el 3% y el 5% son diferentes.
2.5.15.6 Teoría estadística detrás de las comparaciones de recuentos repetidos
Se espera que la diferencia entre cuentas independientes sea cero, con un EE igual a la raíz cuadrada
de la suma de las dos cuentas. De este modo (norte1–norte2)/(√ [norte1+norte2]) debe ser < 1,96 solo
por casualidad para un IC del 95 %.
de espermatozoides
Si la diferencia entre las cuentas es menor o igual a la indicada enTabla 2.3 en la página
33para la suma dada, se aceptan las estimaciones y se calcula la concentración a partir de
su media (Tabla 2.4 en la página 35).
Las diferencias más grandes sugieren que se ha producido un error de recuento, hubo errores de
pipeteo o las células no se mezclaron bien, lo que dio como resultado una distribución no aleatoria en
la cámara o en el portaobjetos.
Cuando la diferencia entre los conteos sea mayor a lo aceptable, descartar los dos
primeros valores, y preparar y evaluar dos diluciones frescas de semen. (No cuente una
tercera muestra y tome la media de los tres valores o tome la media de los dos valores
más cercanos).
8. Apéndices
Esto se aplica a los recuentos de espermatozoides y células positivas para peroxidasa (Sección 3.4.1.1 en la
página 108). Para células positivas para CD45 (Sección 3.4.2 en la página 113) y células germinales
inmaduras (Sección 3.6 en la página 118), las preparaciones teñidas deben ser reevaluadas.
9. Referencias
79
1. Introducción
Con estos valores de corte del IC del 95 %, aproximadamente el 5 % de las réplicas estarán fuera de los límites
solo por casualidad.
2.5.16 Medidas de esperma

examen
2. Básico
Un micrómetro ocular puede ser útil para distinguir entre cabezas de espermatozoides de
tamaño normal y anormal.
Las dimensiones de la cabeza de 77 espermatozoides teñidos con Papanicolaou clasificados como

normales según los criterios proporcionados aquí y medidos por un sistema computarizado
(coeficiente de variación para mediciones repetidas 2–7%) tenían las siguientes dimensiones: mediana
examen
3. Extendido
de longitud 4,1 µm, IC del 95% 3,7– 4,7 µm; anchura mediana 2,8 µm, IC del 95 % 2,5–3,2 µm; relación
mediana de longitud a anchura 1,5, IC del 95 % 1,3–1,8.
Las piezas intermedias de 74 espermatozoides teñidos con Papanicolaou clasificados como normales
según los criterios aquí indicados y medidos por el mismo sistema computarizado tenían las
siguientes dimensiones: mediana de longitud 4,0 µm, IC del 95 % 3,3–5,2 µm; anchura mediana 0,6
µm, IC del 95 % 0,5–0,7 µm.
examenes
4. Avanzado
2.5.17 Ejemplos resueltos
2.5.17.1 Cálculo de la concentración de otros elementos
Las concentraciones de otras células y, por ejemplo, partes de espermatozoides (colas sin cabeza,
tecnicas
cabezas sin cola) pueden calcularse en relación con la concentración de espermatozoides. Siempre que
la presencia de los elementos se haya contado en el mismo volumen (HPF) que se contaron los
espermatozoides, se puede utilizar la siguiente fórmula:
C = S × N/N
i s
Dónde
de espermatozoides
C = la concentración de otras células, partes de células u otros elementos de interés
S = concentración de esperma calculada
N = el número de otras células, partes de células u otros elementos contados

i
N = el número de espermatozoides contados en el mismo volumen (área) que los elementos buscados.
s
2.5.17.2 Porcentajes de espermatozoides con morfología normal y TZI
De 200 espermatozoides puntuados con un contador de 6 teclas, 12 espermatozoides se puntuaron como
normales y 188 como anormales. De los 188 espermatozoides anormales, 184 tienen defectos en la cabeza,
8. Apéndices
102 tienen defectos en la pieza intermedia, 30 tienen defectos en la pieza principal y 44 tienen exceso de
citoplasma residual.
9. Referencias
80
1. Introducción
• formas normales 12/200 = 6%
• cabezas anormales 184/200 = 91%
• cuello anormal/piezas intermedias 102/200 = 51 %

examen
2. Básico
• cola anormal 30/200 = 15%
• porcentaje con exceso de citoplasma residual 44/200 = 22%
• TZI (184+102+30+44)/188 = 1,91.

examen
3. Extendido
2.5.17.3 Cálculo de partes de esperma o células no espermáticas en frotis de morfología
C = la concentración deseada de otras células, partes de células u otros elementos

N = número de células no espermáticas o partes de espermatozoides contadas en el mismo número de campos que
200 espermatozoides
S = concentración de espermatozoides en millones por ml

examenes
4. Avanzado
C = S × (N/200) en millones por ml se puede calcular a partir de la fórmula.
2.5.17.4 Concentración de esperma
Ejemplo 1
tecnicas
cuadrículas, mientras que la réplica 2 contiene 250 espermatozoides en 2 cuadrículas. La suma de los
valores (200+250) es 450 en 4 cuadrículas y la diferencia (250–200) es 50. DeTabla 2.3 en la página 33
se ve que esto excede la diferencia límite (41), esperada solo por casualidad, por lo que los resultados
se descartan y se hacen dos nuevas diluciones repetidas.
Ejemplo 2
Con una dilución 1+1 (1 : 2), se encuentra que la réplica 1 contiene 219 espermatozoides en 3 cuadrículas,
mientras que la réplica 2 contiene 180 espermatozoides en 3 cuadrículas. La suma de los valores (219+180) es
de espermatozoides
399 en 6 cuadrículas y la diferencia (219–180) es 39. DeTabla 2.3 en la página 33se ve que esto es igual a la
diferencia límite (39), por lo que es menor que la que se encuentra solo por casualidad, por lo que se aceptan
los valores.
La concentración de espermatozoides en la muestra para una dilución 1+1 (1 : 2) es C = (norte/norte)/

50 espermatozoides/nl o (410/6)/50 = 1,37 espermatozoides/nl, o 1,4×106 espermatozoides/ml de
semen (a dos cifras significativas).
Ejemplo 3
Con una dilución 1+1 (1 : 2), se encuentra que la réplica 1 contiene 120 espermatozoides en las
9 cuadrículas, mientras que la réplica 2 contiene 140 espermatozoides en las 9 cuadrículas. La
suma de los valores (120+140) es 260 en 18 cuadrículas y la diferencia (140–120) es 20. De Tabla
2.3 en la página 33se ve que es menor que la diferencia límite (31), por lo que se aceptan los
valores.
8. Apéndices
9. Referencias
81
1. Introducción
Cuando se evalúan las nueve cuadrículas en cada cámara (un total de 1,8 µl), la concentración de
espermatozoides en la muestra para una dilución 1+1 (1 : 2) esC= (norte/1,8) × 2 espermatozoides por
µl = (260/1,8) × 2 = 288,8 espermatozoides/µl, o 290×103espermatozoides por ml de semen (a dos
cifras significativas). Como se contaron menos de 400 espermatozoides, informe el error de muestreo
para 260 espermatozoides como se indica en la Tabla 2.3 (aproximadamente 6,3%).
examen
2. Básico
Ejemplo 4
Con una dilución 1+1 (1:2), se encontró que la réplica 1 contenía 10 espermatozoides en las 9
cuadrículas, mientras que la réplica 2 contenía 8 espermatozoides en las 9 cuadrículas. Como se
encuentran menos de 25 espermatozoides en las 9 cuadrículas, la concentración es < 56 000/ml;
informan que “se observaron 18 espermatozoides en las muestras, muy pocos para una
determinación precisa de la concentración (< 56 000/ml)”.
examen
3. Extendido
Ejemplo 5
Con una dilución 1+1 (1 : 2), no se encuentran espermatozoides en ninguna de las réplicas. Como se
contaron menos de 25 espermatozoides, la concentración es < 56 000/ml; informan que "No se
observaron espermatozoides en las réplicas, demasiado pocos para una determinación precisa de la
concentración (< 56 000/ml)".
examenes
4. Avanzado
tecnicas
de espermatozoides
8. Apéndices
9. Referencias
82
1. Introducción
Capítulo 3:
Examen extendido
examen
2. Básico
3.1 Índices de defectos espermáticos múltiples.................................................... .......83

3.2 Fragmentación del ADN espermático.................................................... ........................86
3.3 Pruebas genéticas y genómicas.................................................... ......................105
3.4 Pruebas relacionadas con la inmunología y
examen
3. Extendido
métodos inmunológicos.................................................... ............................108

3.5 Evaluación de interleucinas – marcador de masculino
inflamación del tracto genital.................................................... .......................116
3.6 Evaluación de células germinales inmaduras en el eyaculado.........118
3.7 Prueba del recubrimiento de anticuerpos de los espermatozoides.............................119
3.8 Ensayos bioquímicos para la función de las glándulas sexuales accesorias........125
3.9 Evaluación de la secuencia de la eyaculación..........................................135
examenes
4. Avanzado
Las pruebas descritas en este capítulo no son necesarias para el análisis de semen de rutina,
pero pueden ser útiles en ciertas circunstancias con fines de diagnóstico o investigación.
Algunas publicaciones pueden indicar la utilidad de una prueba basada en un alto coeficiente
de correlación. Sin embargo, incluso con coeficientes de correlación altos, para evaluar si una
prueba es útil para el hombre individual, se deben considerar los valores predictivos positivo y
tecnicas
negativo (medidas de probabilidades de que un resultado positivo o negativo sea cierto,

respectivamente).
Algunas pruebas incluidas aquí se describieron siguiendo las pruebas estándar recomendadas.
En aras de la estandarización y la claridad de las recomendaciones, las pruebas alternativas se
trasladaron a este capítulo. Es aceptable que los laboratorios consideren el uso de dichas
pruebas para reemplazar los exámenes básicos recomendados, siempre que se establezca y
explique la relación con los exámenes básicos.
de espermatozoides
Clínicamente, existe una creciente conciencia de que
las anomalías cromosómicas y las mutaciones
genéticas subyacen a un espectro diverso de

infertilidad masculina que subyace a muchas de las
anomalías observadas en un análisis de semen.

8. Apéndices
3.1 Índices de defectos espermáticos múltiples
Los espermatozoides morfológicamente anormales a menudo tienen múltiples defectos (de la

cabeza, pieza intermedia o pieza principal, o combinaciones de estos defectos). Una evaluación
detallada de la incidencia de anomalías morfológicas puede ser más útil que una simple
evaluación del porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales, especialmente
9. Referencias
83
1. Introducción
en estudios de la extensión del daño a la espermatogénesis humana(58, 153). El registro de los

espermatozoides morfológicamente normales, así como de aquellos con anomalías en la
cabeza, la pieza intermedia y la pieza principal, en un sistema de entrada múltiple, da el número
medio de anomalías por espermatozoide evaluado.
examen
2. Básico
Se pueden obtener tres índices a partir de los registros de anomalías detalladas de la cabeza, la pieza
intermedia y la pieza principal en un sistema de entrada múltiple:
• el índice de teratozoospermia (TZI)(104, 154)(como se recomienda en el Capítulo 2);
• el índice de anomalías múltiples (MAI)(58);

examen
3. Extendido
• el índice de deformidad del esperma (SDI)(155-157).
Estos índices se han correlacionado con la fertilidad in vivo (MAI y TZI)(58, 104) e in
vitro (SDI)(155), y puede ser útil en la evaluación de ciertas exposiciones o
condiciones patológicas(153, 156, 157).
examenes
4. Avanzado
3.1.1 Cálculo de índices de defectos morfológicos múltiples
Cada espermatozoide anormal se califica por defectos de la cabeza, pieza intermedia y pieza principal,
y por la presencia de exceso de citoplasma residual (volumen de más de un tercio del tamaño de la
cabeza del espermatozoide). Se pueden utilizar contadores de células de laboratorio, con el número de
claves de entrada adaptado al tipo de índice que se está evaluando. Si no se dispone de un contador,
se puede utilizar una hoja de puntuación simple.
tecnicas
• El TZI tiene un máximo de cuatro defectos por espermatozoide anormal: uno por cabeza,
pieza intermedia y pieza principal, y uno por exceso de citoplasma residual. Se pueden
utilizar los criterios morfológicos dados en este manual (Véase tambiénEvaluación
microscópica y cálculo de resultados en la página 54).
• El MAI es similar al TZI, ya que se basa en el número medio de anomalías por

espermatozoide anormal. Todas las anomalías de cabeza, pieza intermedia y pieza
de espermatozoides
principal se incluyen en el cálculo. Los criterios morfológicos utilizados para este

análisis son de(158)modificado por(159), y difieren de los presentados en este manual (
Sección 2.4.9 en la página 41).
• El SDI es el número de defectos dividido por el número total de espermatozoides (no

sólo los espermatozoides anormales). Incorpora varias categorías de anomalías de la
cabeza, pero solo una para cada pieza intermedia y pieza principal. Se pueden utilizar
los criterios morfológicos dados en este manual.
La Tabla 3.1 muestra un ejemplo de los cálculos involucrados en la generación de estos índices,
para demostrar las diferencias entre ellos.
8. Apéndices
9. Referencias
84
1. Introducción
Capítulo 3: Examen ampliado
Tabla 3.1 Cálculo de índices de defectos espermáticos múltiples
AMI TZI IDE

Valor máximo 4.00 3.00
examen
2. Básico
Denominador esperma anormal esperma anormal todo el esperma
(A) No. de espermatozoides contados 200 200 200

espermatozoides normales (N) 46 46 46
espermatozoides normales (%) 23 23 23
(B) Número de espermatozoides con defectos (200–46) 154 154 154
examen
3. Extendido
(1) Número de defectos de la cabeza (MAI, SDI) o número de

284 154 212
espermatozoides con > 1 defecto de la cabeza (TZI)
(2) Número de defectos de pieza intermedia (MAI) o número de

54 52 52
espermatozoides con 1 defecto de pieza intermedia (TZI, SDI)
(3) Número de defectos de pieza principal

(MAI) o número de espermatozoides con1 54 46 46
examenes
4. Avanzado
defecto de pieza principal (TZI, SDI)
(4) No. de espermatozoides con

14 14 14
exceso de citoplasma residual
(C) Total defectos (1)+(2)+(3) (= C) (MAI) 392

(D) Defectos totales (1)+(2)+(3)+(4) (= D) (TZI, SDI) 266 324
tecnicas
Cálculo del índice C/B D/B D/A

Valor de índice 2.55 1.72 1.62
Nota:Esta descripción del TZI está de acuerdo con la del artículo original
de Menkveld et al.(104)y el manual de la Sociedad Europea de
de espermatozoides
Reproducción Humana y Embriología(12)y la Asociación Nórdica de

Andrología(160), que dan valores que van de 1,00 a 4,00. Esto es diferente
de la descripción en una edición anterior de este manual.(4), en el que no
se registró por separado el exceso de citoplasma residual, y que dio
valores de TZI que oscilaban entre 1,00 y 3,00. Interpretación
3.1.2 Interpretación
La Tabla 3.2 presenta valores de MAI y TZI para hombres que asisten a clínicas de infertilidad y
hombres que han tenido un hijo en los últimos tres años. Cabe señalar que existe una superposición
entre hombres fértiles y hombres en parejas subfértiles, lo que significa que también con respecto a
estas medidas, no existe un límite nítido entre hombres completamente fértiles y subfértiles.
Sin embargo, debe recordarse que el pronóstico de la fertilización espontánea o asistida no es el único
8. Apéndices
uso para la evaluación de la morfología del esperma humano. La alteración de la espermatogénesis en

hombres con producción cuantitativa ordinaria de espermatozoides brinda más información y puede
indicar estrés testicular, mal funcionamiento del epidídimo o incluso trastornos genéticos de la cola de
los espermatozoides. En este último caso, es poco probable que cualquier estimulación hormonal
tenga éxito, y se podría ofrecer a la pareja una investigación genética clínica para comprender el
riesgo de trastornos en la descendencia.
9. Referencias
85
1. Introducción
Las diferencias observadas en los índices de defectos espermáticos para parejas masculinas de
parejas fértiles e infértiles son pequeñas, lo que dificulta el uso de estos criterios para intentar
distinguir estos grupos con estos índices. Usando un sistema algo diferente para clasificar,
múltiples anomalías morfológicas de los flagelos (MMAF)(161)revisado en Coutton, et al.,(162),
las deficiencias morfogénicas están asociadas a una serie de defectos genéticos que afectan a
examen
2. Básico
la función espermática.
Tabla 3.2 Índices de defectos espermáticos para hombres de parejas fértiles e infértiles
parejas infértiles parejas fértiles
AMIa TZIb AMIC TZIb

examen
3. Extendido
Significar 1.94 1.81 1.58 1.51

Desviación Estándar 0.37 0.30 0.20 0.20
Mínimo 1.12 1.26 1.04 1.17
Máximo 3.9 2.64 2.38 2.07
examenes
4. Avanzado
percentiles
5 1.44 1.27
10 1.51 1.74 1.34 1.33
25 1.67 1.44
50 1.88 1.81 1.58 1.54
tecnicas
75 2.14 1.72
90 2.44 1.86
95 2.65 1.94
norte 4 930 103 994 107
Datos no publicados de J. Auger, París, usando la clasificación morfológica de David(158), modificado por Auger & Eustache
de espermatozoides
(2000)(159).
b Menkveld et al. (2001)(104).
C Jorgensen et al. (2001)(163), usando la clasificación morfológica de David(158); modificado por Auger & Eustache (2000)(159)
3.2 Fragmentación del ADN espermático

3.2.1 Antecedentes
El daño del ADN espermático se puede definir como cualquier cambio químico en la estructura normal
del ADN. Entre estos cambios, la fragmentación del ADN espermático (sDF) es una de las alteraciones
más comunes que afectan al material genético en forma de roturas de cadena simple o doble. El sDF
puede desencadenarse por diferentes procesos, incluido el empaquetamiento defectuoso del ADN
8. Apéndices
durante la espermatogénesis, y procesos de muerte celular y estrés oxidativo que pueden estar
asociados con varias condiciones patológicas y ambientales.(164-166).
9. Referencias
86

Fig. 2.7 Exploración de Todo El Cubreobjetos para Detectar La Presencia de Espermatozoides Móviles

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Fig. 2.7 Exploración de Todo El Cubreobjetos para Detectar La Presencia de Espermatozoides Móviles

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Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

Capítulo 2: Examen básico

4. El informe debe indicar que se trata de una aproximación y no de un valor exacto.

húmedas, consulteSección 2.5 en la página 64.

1200 campos totales

Estimación de la concentración basada en observaciones HPF

observaron espermatozoides móviles. Esta estimación imprecisa solo debe hacerse

Evaluación de cantidades bajas de espermatozoides en cámaras desechables de gran volumen

espermatozoides (preferiblemente un total de al menos 400 de recuentos repetidos de aproximadamente 200)

(Tabla 2.16 en la página 78).

1. Mezclar bien la muestra de semen.

La dilución 1+1 (1 : 2) para muestras con menos de 2 espermatozoides en la evaluación inicial

3. Si la fluorescencia está disponible en el microscopio, la tinción de esperma fijado "diluido"

con un tinte apropiado, como DAPI, puede ayudar a su identificación.

interior. Diluir la muestra 1+1 (1 : 2) reduciría el fondo y el número de espermatozoides a 3

espermatozoides y los volúmenes pueden ser inexactos.

1. Tome la muestra correspondiente como se indicó anteriormente (diluida o pura).

2. Llene cada cámara del portaobjetos con 25 µl del líquido.

inmovilizadas sedimentarán en el piso de la cámara durante este tiempo).

4. Examine la diapositiva con un aumento de ×250.

7. Anote el número de campos evaluados para llegar al menos a 200 espermatozoides. El

8. Contar el número de espermatozoides y campos con la ayuda de un contador de laboratorio.

9. Cambie a la segunda cámara y realice el recuento de réplicas en el mismo número de

10. Calcula la suma y la diferencia de los dos números.

11. Determinar la aceptabilidad de la diferencia deTabla 2.3 en la página 33–la diferencia

Capítulo 2: Examen básico

12.Si la diferencia es aceptable, calcule la concentración. Si la diferencia es demasiado

13.Reporte la concentración promedio de espermatozoides con dos cifras significativas.

total de espermatozoides por eyaculado.

Cálculo de bajas concentraciones de esperma por campo examinado

n) × (1/v) × factor de dilución.

C = (N/n) × (1/80) × 2 espermatozoides/nl = (N/n) × (1/40) espermatozoides/nl (millones de

C = (N/n) × (1/20) × 2 espermatozoides/nl = (N/n) × (1/10) espermatozoides/nl (millones de

Cuando se ha evaluado toda el área de ambas cámaras, se divide el número total de

Si la muestra no se ha diluido, el factor de dilución es 1.

• El diámetro del campo microscópico se puede medir con un micrómetro de

por el aumento de la lente del objetivo.

Sensibilidad del método

Si se cuentan menos de 25 espermatozoides en cada cámara, la concentración será < 2000

Es importante señalar que la ausencia de espermatozoides de la alícuota examinada

La concentración de espermatozoides en la muestra, para una dilución 1+1 (1 : 2) es C = (N/n) ×

Capítulo 2: Examen básico

Cálculo del número total de espermatozoides

Examen de muestras centrifugadas para detectar espermatozoides independientemente de su

1. Mezclar bien la muestra de semen.

2. Extraer una alícuota de 1 ml de semen y centrifugar idealmente a 3000 g durante 15 minutos.

3. Decantar la mayor parte del sobrenadante y resuspender el sedimento de esperma en los

aproximadamente 50 µl restantes de plasma seminal.

describió anteriormente (Sección 2.4.4 en la página 19).

• La presencia de espermatozoides en la muestra indica:

• paso del testículo(s) a la uretra

• producción de espermatozoides gravemente limitada o transporte de espermatozoides obstaculizado.

• La ausencia de espermatozoides sugiere:

extremadamente baja de espermatozoides

no hay paso de los testículos a la uretra.

2.4.9 Morfología espermática

El valor de la evaluación de la morfología del esperma humano no es solo el valor pronóstico

“normales”. Es importante evaluar la morfología específica de cabeza, cuello/pieza intermedia y

diferentes. Las definiciones anteriores de la morfología de los espermatozoides se basaban principalmente en

las experiencias de la medicina veterinaria y las investigaciones microscópicas.

Los criterios presentados aquí se desarrollaron a partir de investigaciones de la morfología de

El término espermatozoide “normal” es en cierto modo ambiguo, lo que provoca malentendidos