UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICAS DE LABORATORIO

BACILOS GRAM POSITIVOS

Maye Bernal Rivera

Introducción

La mayoría de bacilos Gram positivos se encuentran ampliamente distribuidos en la

naturaleza y pueden formar parte de la microbiota normal tanto en el hombre como en
animales. Frecuentemente, no son patógenos primarios para el hombre, aunque hay
algunas especies virulentas e importantes en patología humana.

Listeria

Cocobacilos, Gram positivos, que se presentan aislados o agrupados en cadenas

cortas; móviles a 22ºC mostrando un aspecto de “sombrilla”, pero inmóviles a 37ºC.
Crecen bien sobre placas de agar sangre, produciendo colonias pequeñas,
translúcidas, beta hemolítica, similares a Streptococcus sp, pero el halo de hemólisis
es pequeño en comparación con el tamaño de su colonia y a veces es necesario
remover la colonia para visualizar la hemólisis. Se desarrollan a 30-37ºC, pero crece
a bajas temperaturas (4ºC), característica que le permite desarrollarse en alimentos
refrigerados y producir infección por su consumo, convirtiéndose en el agente más
importante por contaminación alimentaria. Son catalasa positiva y utilizan hidratos
de carbono, como la glucosa, manosa y ramnosa, pero no el manitol. Hidrolizan la
esculina. Son aerobios facultativos y crecen mejor con una atmósfera de CO2.

Erysipelothrix rusiopathiae

Bacilos Gram positivos, microarefílicos y exigentes. Carecen de la enzima catalasa

negativos y producen H2S. Son inmóviles y no sintetizan cápsula ni esporos. Esta
especie se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza; En humanos produce
una celulitis “erisipeloide” caracterizada por una lesión eritematosa púrpura, dolorosa,
no supurada y bastante pruriginosa. En general el proceso es auto limitado y rara vez
causa enfermedad sistémica la enfermedad humana es poco frecuente y se limita a
trabajadores de la pesca, de mataderos, carniceros, etc., configurando una
enfermedad laboral. Presenta hialuronidasa y neuraminidasa como mecanismos de
patogenicidad.

Corynebacterium

Bacilos Gram positivos pleomórficos, la mayoría de las veces en forma de mazo y

agrupados en empalizada o formando letras en V, Y, L o caracteres chinos; por su
morfología típica se conocen como difteroides. Son facultativos, pero hay algunas
especies aerobias estrictas. Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza
(suelo, agua, superficie de plantas) y forman parte de la microbiota normal de
humanos y algunos animales.

Bacillus

Bacilos Gram positivos esporulados, largos, gruesos y delgados con bordes

recortados y pueden agruparse en cadena; aerobios estrictos, con excepción de
algunas especies facultativas. Se encuentran distribuidos en suelo, aguas y
vegetales y que por sus esporas logran mantenerse muchos años, aún en
condiciones adversas.

PRACTICA DE LABORATORIO
Objetivo

Proporcionar al estudiante el conocimiento científico y las habilidades prácticas de los

métodos y técnicas utilizados en Microbiología Médica para el aislamiento e
identificación de las principales especies de bacilos Gram positivos que afectan al
hombre

PARTE I. SIEMBRA

Objetivos específicos

- Establecer la diferencia entre géneros de bacilos Gram positivos aerobios

- Estudiar las características macroscópicas, microscópicas y cambios producidos
en el medio de diferentes especies de bacilos Gram positivos
- Conocer algunas de las pruebas bioquímicas de laboratorio utilizadas para la
identificación de especies de bacilos Gram positivos
- Identificar especies de los géneros Listeria, Erysipelothrix, Corynebacterium y
Bacillus.
- Estudiar el caso clínico y con base en él, establecer el diagnóstico clínico
presuntivo.
- Realizar la orden de solicitud y pedir los exámenes microbiológicos adecuados
para llegar al diagnóstico etiológico.

Materiales

- Casos clínicos
- Muestras biológicas
- Asa curva, mechero.
- Caldo BHI
- Agar Sangre
- Campana con vela (CO2) e incubadora a 37ºC y a 22ºC.

Procedimiento

1. Marcar adecuadamente cada uno de los medios.

2. Sembrar la muestra en caldo BHI y agar sangre (por agotamiento)
 3. Incubar a 37ºC por 24 horas en aerobiosis con atmósfera de CO2
4. Realizar pruebas para la identificación del agente, según instrucción del
profesor. (Motilidad, Glucosa, Manitol, etc.)

Actividad

1. ¿Cuáles son las especies de cada uno de estos géneros más importantes en
patología humana?
2. Escriba qué pruebas se debe realizar para diferenciar especies de los géneros a
estudiar.

PARTE II.

LECTURA E INTERPRETACION PARA LA DIFERENCIACION E IDENTIFICACIÓN

DEL AGENTE ETIOLÓGICO.

Listeria. Diagnóstico de Laboratorio

Las colonias de listeria son medianas, cremosas, traslúcidas, ligeramente convexas,

de bordes regulares, rodeadas de un halo pequeño de beta hemólisis. Para iniciar la
identificación además de las características macro y microscópicas de la colonia, se
utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del género estreptococo.

Pruebas Bioquímicas

CATALASA
Principio
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en
agua y oxígeno según la siguiente reacción:
2H2O2® 2H2O + O2 (burbujas de gas)

Materiales
- Colonia aislada (Medio de cultivo sembrado e incubado)
- Peróxido de hidrógeno al 3%

Procedimiento
1. Con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la
superficie de un portaobjetos.
2. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y observar la formación de
efervescencia o burbujas.

Resultados
- Positiva: Una prueba positiva está dada por la aparición rápida y sostenida de
burbujas o efervescencia.
- Negativa: Unas pocas burbujas pequeñas después de 20 a 30 segundos se
considera un resultado negativo.
 - Falsas Positivas: Los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual debe tenerse
cuidado de no tomar eritrocitos del agar sangre junto con el material de la
colonia.

Prueba de Motilidad

Principio
Determinar si la bacteria es móvil o inmóvil. Ayuda a diferenciar entre cepas de
Listeria monocytogenes y cepas de Corynebacterium

Materiales
- Colonia aislada
- Agar motilidad
-
Procedimiento
- Inocular en el medio de motilidad, haciendo una picadura central, hasta la
mitad del medio
- Incubar a 22°C por 48 horas

Resultados
- Positiva: Motilidad en “sombrilla”.
- Negativa: Inmóvil, el medio permanece límpido (crecimiento únicamente en la
línea de inóculo.

UTILIZACION DE HIDRATOS DE CARBONO

Principio
Determinar la capacidad del microorganismo de utilizar (fermentar o degradar) un
carbohidrato específico incorporado en un medio de cultivo básico, con la producción
de ácido, el cual provoca la disminución del pH en el medio y este se detecta
mediante el viraje del indicador rojo de fenol a amarillo.

Materiales
- Cepa en estudio
- Caldo con un hidrato de carbono incorporado (Glucosa, Manosa, Sacarosa,
Ramnosa, Manitol, etc.)

Procedimiento
- Sembrar la colonia en el caldo
- Incubar a 35ºC por 24 horas

Resultados
- Positivo: cuando el indicador del medio vira a amarillo
- Negativo: cuando conserva su color rojo

Objetivos específicos

- Estudiar las características macroscópicas de las colonias de bacilos Gram

positivos.
 - Diferenciar los tipos de hemólisis.
- Observar las características microscópicas de los diferentes géneros.
- Leer e interpretar diferentes pruebas bioquímicas utilizadas para la
identificación de bacilos Gram positivos.
- Establecer el diagnóstico etiológico responsable del cuadro infeccioso de su
paciente.
- Realizar el reporte de resultados, dirigido al médico.

Materiales

- Cultivos de las muestras de los pacientes asignados y medios de las diferentes

pruebas bioquímicas realizadas.
- Láminas, asas, mecheros, marcador de vidrio, papel absorbente
- Colorantes para Gram.
- Microscopio y aceite de inmersión.
- Formato para el informe de resultados.

Procedimiento

1. Describir las características macroscópicas de la colonia

2. Clasificar de acuerdo al tipo de hemólisis
3. Observar las características microscópicas mediante la coloración de Gram
4. Leer e interpretar las diferentes pruebas bioquímicas
5. Identificar el agente etiológico (Género y especie) responsable del caso clínico
asignado.
6. Hacer el informe al médico.
7. Revisar los casos clínicos del grupo, hacer correlación clínica.

Actividad

1. Dibuje las diferentes características microscópicas de los hallazgos.

2. Defina los diferentes tipos de hemólisis.
3. Realice un flujograma para la identificación del agente etiológico (Diagnóstico
etiológico) del caso clínico asignado.
4. Escriba 5 enfermedades infecciosas de los agentes etiológicos aislados en el
grupo y otras especies de microorganismos Gram positivos importantes en
patología humana.
5. Haga un cuadro con las entidades más importantes producidas por las
especies de estos géneros y el examen microbiológico de Laboratorio, útil para
su diagnóstico.