NO 39

TIPIFICACIÒN DE ADN DE UN SÒLO CABELLO.

(TIPIFICACIÓN DE ADN DE CABELLOS INDIVIDUALES)
CARTA A LA REVISTA NATURE (NATURALEZA)

AUTORES: Russell Higuchi, Cecilia H. von Beroldingen(*), George F.

Sensabaugh(*) and Henry A. Erlich.
Departamento de Genética Humana, Cetus Corporation, Emeryville,
California 94608, EE. UU.
(*) Programa de Ciencias Forenses, Universidad de California,
Berkeley, California 94720, EE. UU.

El Conocimiento, La Sabiduría y la Producción de Conocimiento están en Ser Humilde.

Compilado por Chola Wengué Venezuela, 05-12-2021.
 RESUMEN

La caracterización de la variación genética a nivel del ADN ha

generado importantes avances en el mapeo de genes, enfermedades
(1), y en la identificación forense de individuos (2-6).

El método más común de análisis de ADN, el del polimorfismo de

longitud de fragmentos de restricción (RELP), requiere cantidades
de microgramos de ADN relativamente sin degradar para la tipificación
de múltiples locus y cientos de nano gramos para las comparaciones
de un solo locus (7).

Con frecuencia, dicho ADN no puede obtenerse de muestras forenses,

como cabellos individuales y manchas de sangre, o de muestras
antropológicas, genéticas o zoológicas recolectadas en el campo.

Para detectar secuencias de ADN polimórfico de cabellos humanos

individuales, hemos utilizado la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), en la que regiones cortas específicas de un gen pueden
amplificarse en gran medida in vitro (8-10) a partir de una sola
molécula de ADN (10).

Hemos detectado secuencias de ADN nuclear y mitocondrial

genéticamente variables de la región de la raíz de la muda, así como
de pelos individuales recién arrancados.
Se han detectado secuencias de ADN mitocondrial (ADNmt) en una
muestra de un solo tallo de cabello.
Hemos utilizado tres métodos diferentes de tipificación de ADN en
estas muestras:
1. La determinación de las diferencias en la longitud de los fragmentos
de ADN amplificado.
2. Hibridación con sondas de oligonucleótidos específicos de alelo y
3. Secuenciación directa de ADN.

La mayor parte del ADN en el cabello se encuentra en la raíz y las

células de la vaina circundante (11).
Según lo medido por la fluorescencia de los complejos de ADN-tinte
en lisados crudos de cabello, el extremo de la raíz de los pelos recién
depilados puede contener hasta 0,5 µg (microgramos) de ADN,
mientras que los tallos del cabello contienen muy poco ADN, para
determinar su cantidad y condición (11).

Nuestra recuperación de ADN purificado, sin embargo, rara vez ha

superado los 200 ng de los pelos recién arrancados y, por lo general,
ha sido inferior a los 10 ng (nano gramos) de los cabellos caídos.

El análisis de "huellas dactilares" de ADN con sondas de múltiples

locus se ha realizado en el ADN combinado de varios cabellos recién
arrancados del mismo individuo (3) y presumiblemente se podría
realizar un análisis de un solo locus en un solo cabello recién
arrancado (7).

Los cabellos encontrados en la escena de un crimen, sin embargo,

pueden provenir de diferentes individuos y suelen ser cabellos caídos.

Por lo tanto, la tipificación de los cabellos sueltos sería mucho más

preferible que la de las muestras reunidas y recién arrancadas.
La figura 1 muestra la electroforesis de los productos de amplificación
del ADN aislado de las porciones separadas de la raíz y el tallo de los
pelos de la cabeza individuales recién arrancados de dos individuos:
Eje de la raíz Eje de la raíz

120 pb
111 pb
(1)
(1)

Individuos 1 2
Figura 1: Amplificaciones por PCR de mtDNA de un solo cabello.
Los pelos de dos individuos se separaron en "raíz" [que contienen bulbo, vaina (funda), zona de
alargamiento y algunas partes del eje (11)] y del eje.
Se preparó el ADN y se realizó la amplificación por PCR como se indica a continuación.
Las longitudes de los fragmentos se determinaron mediante electroforesis:
Carril 1: Producto de PCR de la porción de la raíz de un cabello de la cabeza del individuo 1.
Carril 2: Producto de PCR de la parte del tallo del mismo cabello.
Carril 3: Producto de PCR de la porción de la raíz de un cabello del individuo 2 y
Carril 4: Producto de PCR de la parte del tallo del mismo cabello.
Métodos:
1. Pelos sueltos, Se arrancaron 10 cm de longitud, se cortaron con tijeras y se enjuagaron en H 2O
destilada seguido de etanol absoluto y
2. Después del secado, las porciones de cabello se digirieron como en la ref. 3, en 0,5 ml de 0,001 Tris-HCL,
0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl (pH 8,0) conteniendo 50 µg (microgramos) ml-1 proteinasa K, 0,039 M DTT y SDS
al 2%.
3. El ADN se extrajo con volúmenes iguales de fenol/cloroformo seguido de n-butanol.
4. La fase acuosa se añadió a 2 ml de TE (0,01 M de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA (pH 8,0) en la parte superior
de un dispositivo Centricon 30 de ultrafiltración (Amicòn).
5. La muestra se centrifugó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, la porción retenida se re
suspendió en 2 ml de TE y se volvió a centrifugar.
6. El ADN desalado se recuperó en 40 µl (micro litros).
7. La amplificación por PCR utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I (*) se realizó sobre
15 µl (micro litros) de esta solución en un volumen final de 100 µl (micro litros) que incluía los reactivos
descritos en la ref. 9 junto con cebadores específicos para una región intergénica del mtDNA humano (13).
8. Los ciclos (30) de PCR se realizaron como se describe (8,9).
9.El ADN de la mitad de las reacciones de amplificación se sometió a electroforesis en geles compuestos de
agarosa no modificada al 3%, sin tamiz, agarosa (FMC) al 1% y
10. El gel se tiñó con bromuro de etidio y se fotografió bajo luz ultravioleta, como se muestra.
____________
(1) ¿Qué es pb o bp en genética?
Las siguientes abreviaciones son usadas comúnmente para referirse a la longitud de una molécula de
ADN/ARN: pb = pares de bases (un par de bases mide alrededor de 3,4 Å) kpb (o kb) = mil pb.
En genética un par de bases (en inglés bp) es una unidad que consta de dos núcleos bases unidas entre sí
por enlaces de hidrógeno.
En la presente figura 1 se puede apreciar 2 ejemplos de bp (pb): 111 pb y 120 pb, respectivamente.
El fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I (*) se utilizó para
estas amplificaciones (8,9).

Un polimorfismo de longitud previamente caracterizado en el ADNmt

humano distingue las muestras de los diferentes individuos; La
secuenciación del ADN del ADNmt del individuo I había mostrado
una deleción de 9 pares de bases (pb) en esta región (13).

PCR con cebadores de oligonucleótidos que flanquean esta región y

es 111 ó 120 pb (bp) dependiendo de si esta deleción está presente
[esta diferencia podría, por lo tanto, considerarse una “(PCR)
(FLP)”].

Los productos de amplificación de los tamaños apropiados para cada

individuo se obtienen tanto de la raíz como del tallo de los pelos.

Por lo tanto, incluso la parte del eje contiene suficientes copias de

mtDNA para ser detectadas mediante PCR.

La electroforesis también puede distinguir productos de amplificación

que difieren en su patrón de sitios de enzimas de restricción (3,
9,14).
_________________
(*)[El fragmento de Klenow: Es un fragmento proteico de gran tamaño
perteneciente a la enzima DNA polimerasa I, procedente de E. coli. Este fragmento
puede separarse del resto de la enzima gracias a la proteasa subtilisina. Publicado
por primera vez en 1970(1) mantiene la actividad polimerasa 5’→3’ y la
actividad exonucleasa 3’→ 5’ para eliminar nucleótidos previos a la secuencia
codificante y corrección de errores, pero pierde su actividad exonucleasa 5'→3'. El
resto de fragmentos pequeños originados cuando la DNA polimerasa I de E. coli se
procesa por subtilisina mantiene la actividad exonucleasa 5'→ 3' pero no tiene las
otras dos actividades mostradas por el fragmento Klenow ( i.e. actividad polimerasa
5'→3', y actividad nucleasa 3'→5'). Puede ser liberado del resto de la polimerasa
mediante tratamiento con tripsina].

(1)Klenow H and Henningsen I (1970): «Selective Elimination of the Exonuclease Activity of the

Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Escherichia coli B by Limited Proteolysis (Eliminación
selectiva de la actividad exonucleasa de la polimerasa del ácido desoxirribonucleico de
Escherichia coli B mediante proteólisis limitada”. Proc Natl Acad Sci 65: 168-175.
 La Figura 2 muestra tipificaciones de un gen nuclear amplificado a
partir de las porciones de la raíz de cabellos sueltos individuales de
seis individuos diferentes:
(*) Controles de escritura:
1 1 2 3 4 5 6
Individuo a

Investigación:

(*)Pelo depilado

(*)
Individuo b 1 1 2 3 4

Investigación:

(*)Pelo depilado
Figura 2. Tipificación de HLA en cabellos sueltos:
(a). Las muestras provienen de la porción de la raíz de un solo cabello (Cabello) o de sangre fresca del mismo individuo (Bld.):
1. También se incluye un cabello recién depilado del individuo I.
2. Para cada muestra, el producto de PCR amplificado a partir del exón 2 del locus HLA de clase II, DQα, se fijó en membranas de nailon en
un patrón de cuatro puntos por muestra.
3. Cada punto fue probado para hibridación con una sonda oligonucleotídica conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP; C.Cheng,
manuscrito en preparación) y específica para uno de los cuatro alelos definidos por secuencias entre el codón 47 y 56 de este gen (16) (nota:
la nomenclatura para estas secuencias se ha modificado de la referencia 16 a la de la referencia 29).
4. La HRP se detectó mediante su catálisis localizada de conversión del sustrato incoloro, tetrametilbencidina, a un precipitado azul (30); la
retención de una sonda HRP correspondiente en secuencia a un alelo dado indica la presencia de ese alelo en la muestra.
5. Las cuatro muestras más a la derecha son productos de PCR de control amplificados a partir del ADN de líneas celulares homocigotas para
los tipos de DQA indicados según se define por la secuencia de ADN, ellos son:
-LG2 (tipo serológico-DR1, DQw1).
-HAR (DR3, DQw2).
-DKB (DR9, DQw3) y
-LBF (DR7, DQw2).
6. Los resultados de escritura son:
-Individuo 1- (DQA 1, 4).
-Individuo 2- (1,4).
-Individuo 3- (1,2).
-Individuo 4- (1,3).
-Individuo 5- (2,4) y
-Individuo 6- (3, 4).
7. Aunque aparecen puntos débiles en varios lugares de la membrana expuesta a la sonda DQA2, la comparación con los controles de
tipificación, por ejemplo, DQA2 frente a DKB, muestra que no se elevan sobre el fondo.

(b). Subtipado de muestras que poseen el alelo DQA1:

1. Se sondaron "manchas de puntos" de las mismas amplificaciones de los individuos 1-4 usados anteriormente con oligonucleótidos
específicos de alelo derivados de la región del codón 47-56 de DQα.
2. Tenga en cuenta que la sonda DQA1.2 se hibrida de forma cruzada con los alelos 1.3 y 4.
3. Por lo tanto, se requiere una sonda adicional para distinguir el genotipo 1.2, 1.3 del 1.3, 1.4.
4. Estas sondas se marcaron con (32) P y su retención se detectó mediante auto radiografía.
5. Combinando estos resultados con los anteriores, los individuos 1-4 como escriben a continuación:
-(1.1, 4).
-(1.3, 4).
- (1.2, 2) y
- (1.2, 3), respectivamente.
Métodos:
-Los ADN individuales se prepararon a partir de las puntas de la raíz de los pelos como se muestra en la Figura 1.
-Las amplificaciones de PCR se realizaron, sin embargo, con la ADN polimerasa termoestable de T. Aquaticus (D. Gelfand et al., Datos no
publicados y refs., 10,31).
-La PCR se realizó en alícuotas de 15 µl del ADN de cada cabello en volúmenes de 100 µl de 0,01 M Tris-HCL (pH 8,3), 0,05 M KCL, 2,5 mM
MgCl2, 0,188 mM de cada dNTP que contenía 100 µg ml -1 gelatina, 20 pmol de cada cebador (16) y 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq.
-Los ciclos (40) de PCR se realizaron en un dispositivo automatizado de ciclos de temperatura (Perkin-Elmer Cetus) que proporcionó, por
ciclo, 1min cada uno de incubación a 95, 55 y 70oC, respectivamente.
-En un colector de mancha de puntos [(dot-blot) (S y S)], se inmovilizaron 50 ng de producto de PCR específico en cada punto en una
membrana de nailon Genatrans (Plasco) que luego se expuso a luz ultravioleta para fijar el ADN (32).
-En (a), las membranas se hibridaron como en R. Saiki et al. (Manuscrito enviado), con sondas HRP a una concentración de 1 pmol ml -1.
-El lavado final fue a 40ºC en 0.1% X SSPE, 0.1% Tritón X-100.
-La evolución del color se describió en la ref.30.
-En (b), las membranas se hibridaron como en la ref. 16 excepto que el lavado final antes de la auto radiografía fue a 42 °C en 0,1 X SSPE,
0,1% de SDS.
Los genes nucleares de "copia única", en este caso el gen DQα de
HLA de clase II, son un desafío mayor de detectar que las
secuencias de ADNmt, que están presentes en cientos de copias por
célula.
Sin embargo, los genes nucleares ofrecen una mayor variación
potencial y, por lo tanto, una tipificación más informativa.
En este experimento, la mayor eficiencia de la PCR utilizando una
ADN polimerasa termoestable (10) facilitó la amplificación y tipificación
de una región de 242 pb del gen DQα (16).
Los alelos de este gen se pueden distinguir usando sondas de
oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) contra "puntos"
inmovilizados (dot-blots: Manchas de puntos) del ADN amplificado.
La tipificación en el panel A se realizó utilizando sondas ASO
acopladas a peroxidasa de rábano picante (R. Saiki, et al., En
preparación).
Tal formal no radioactivo, hecho posible por la gran amplificación de
las secuencias diana, beneficiaría a los laboratorios forenses y otros
que no pueden usar radioisótopos.
Las sondas ASO son específicas para los cuatro alelos definidos por
secuencias entre los codones 47 y 56 de DQα (16).
El alelo definido por la sonda DQA1 puede subdividirse aún más,
como se muestra en el panel b, por tres sondas ASO adicionales a
la región entre los codones 30 y 45 (ref.16).
Las frecuencias alélicas definidas por estas sondas se muestran en
la Tabla 1:

Tabla 1. Frecuencia de alelos de DQα

Alelo 1 2 3 4
Frecuencia 0.380 0.105 0.212 0.302

Su tipificación
del alelo 1:
Alelo 1.1 1.2 1.3
Frecuencia 0.139 0.207 0.034
La distribución de estos alelos y los veintiún genotipos que definen en
poblaciones caucásicas, negras y asiáticas será objeto de un informe
posterior (G. Horn y R. Helmuth, datos no publicados).

Las distribuciones observadas de genotipos dentro de cada población

son consistentes con las frecuencias esperadas basadas en el
equilibrio de Hardy-Weinberg.

Como se muestra, los genotipos DQα de estos cabellos caídos

coincidían en todos los casos con los encontrados en el ADN de las
células nucleadas de sangre periférica del mismo individuo.

De los cabellos caídos normalmente recuperamos menos de 10 ng de

ADN, es decir 1.000 copias de este gen HLA.

Las amplificaciones del gen DQα han tenido éxito en copias únicas de
este gen (U.Gyllensten, comunicación personal), al igual que las
amplificaciones de copias únicas del gen de la β-globina humana
(10).

En experimentos posteriores, hemos tenido éxito en la tipificación de

pelos caídos de varios meses de edad en los que no pudimos detectar
el ADN por medios químicos (<1 ng de ADN).

Hasta ahora hemos tipificado casi un centenar de cabellos individuales

utilizando el sistema ASO para DQα en ADN amplificado por PCR.

Mientras que las figuras 1 y 2 muestran tipificaciones de ADN

basadas en diferencias en la secuencia de ácidos nucleicos, la figura
3 muestra el polimórfico de las raíces de un solo cabello.

En el caso, se amplificó una parte de la región del D-círculo del

ADNmt humano.

La secuenciación del ADN, sin clonación, se realizó directamente

sobre el ADN amplificado (13,17).
 Individuos
1 2

Los individuos eran de

ascendencia caucásica,
negra y asiática.
Para cada una de estas
poblaciones, la frecuencia
de genotipos se encuentra
en un equilibrio aproximado
de Hardy-Weinberg.
Número de alelos
muestreados, 410.

Figura 3. Secuencia de ADN mitocondrial determinada directamente a partir de una sola raíz de cabello.
Se amplificó una porción de 228 pb de la región del D-Círculo de ADNmt humano a partir del ADN obtenido
de raíces de un solo cabello utilizando como cebadores oligonucleótidos correspondientes a las posiciones
(33) 16.192 a 16.209 del ADNmt humano (cebador D18) y al complemento de la secuencia de 16.401 a
16.420 (cebador D6).
La preparación del ADN del cabello y la PCR fue como en la Figura 2.
La secuenciación del ADN amplificado (13,17) utilizó el método de terminación dideoxi (34) y la ADN
polimerasa de T7 modificada, Sequenasa (productos bioquímicos de EE. UU.).
Se muestran porciones de auto rradiografías de geles de secuenciación de ADN de bucle D amplificado de
dos individuos.
La flecha apunta a una diferencia de un solo nucleótido entre ellos. El ADN también se aisló y el ADN del
bucle D se amplificó y secuenció en sangre de los mismos individuos.
En ambos casos, las secuencias determinadas a partir de sangre y cabello del mismo individuo fueron las
mismas (datos no mostrados).
Métodos:
El ADN amplificado se purificó mediante electroforesis en un gel de agarosa Nusieve (FMC) al 4%.
La banda de ADN predominante se cortó del gel y se colocó en 0,1 ml de TE (0,01 M de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1
mM de EDTA).
La rodaja de gel en TE se congeló y se descongeló dos veces para ayudar a eluir el ADN (35).
Se añadió una porción de 20 µl del sobrenadante a una nueva reacción de PCR de 0,1 ml con los mismos
cebadores que antes (20 pmol cada uno).
Se realizaron ciclos de PCR adicionales (15).
Esta elución/re amplificación en gel produce 1 µg de secuencia predominantemente del D- Círculo.
El producto de re amplificación se trató como en la referencia 13 excepto que la reacción de PCR se extrajo
una vez con un volumen igual de 1:1, fenol/CHCL3 (equilibrado con TE), y una vez con n-butanol, antes de
la diálisis por centrifugación en un Centricon 30 (Amicon).
En 12 µl de TE, Se mezclaron 0,5 pmol de producto de PCR con 2 pmol de uno de los mismos
cebadores, D6, usados en la amplificación.
Este cebador se había marcado con (32) P usando quinasa T4.
La mezcla de imprimación y plantilla se calentó a 90°C durante 5 min y se colocó inmediatamente en hielo.
Las reacciones se iniciaron agregando 2,8 µl de esta mezcla a 3,15 µl de dideoxi G, A, T y C y mezclas de
reacción compuestas de los reactivos proporcionados en la "secuencia" del equipo de la siguiente manera:
2,5 µl de las "mezclas de terminación” G, A, T o C.
0,15 µl de Sequenasa (2 unidades), 0,38 µl de “5 X buffer” y 0,22 µl de 0,1 M de DTT.
Después de incubación a 37oC durante 10 min., estas reacciones se trataron como en la referencia 13.
Existe un polimorfismo de secuencia extenso en el D-círculo
(referencia 18 y P. Bluford et al., Resultados no publicados).

Como se ve en la Figura 3, los dos individuos se distinguen por estas

secuencias de ADN.

La secuencia de cada individuo son coincidencias de cabello que se

obtienen del ADN del mismo individuo es sangre (datos no
mostrados).

El uso de una ADN polimerasa termoestable ha permitido automatizar

la PCR (10).

Los avances recientes en la automatización de la secuenciación de

ADN (19,20) sugieren que estos podrían combinarse para
proporcionar una tipificación de ADN automatizada basada en la
secuencia de ADN o determinaciones de la longitud de los fragmentos.

Dado que la preparación de muestras para PCR podría simplificarse

(16) y automatizarse, una máquina capaz de determinar secuencias
informativas de ADN de un solo cabello es una posibilidad muy real.

Los pelos son una de las formas de evidencia biológica que se

encuentran con mayor frecuencia en la escena del crimen (21,22),
por lo que su identificación puede tener una importancia forense
considerable.

La identificación actual de los pelos se basa principalmente en la

morfología y tiene una subjetividad inherente (21,22), aunque se han
detectado polimorfismos de proteínas y agrupaciones ABH realizadas
en pelos individuales (22-24).

Los polimorfismos de proteínas en el cabello no tienen el gran

potencial de identificación individual que ofrece la tipificación del ADN.

Debería ser posible amplificar simultáneamente más de un gen, por

ejemplo, el mtDNA y los genes HLA, a partir de una sola muestra
para que los sistemas polimórficos.
La capacidad de determinar el genotipo directamente promete
proporcionar al especialista forense en cabello criterios objetivos para
la identificación individual.

Para el médico antropólogo, la recolección de muestras de cabello, en

lugar de sangre, también puede ser útil en aquellas circunstancias en
las que la donación de sangre está prohibida por la religión o la
costumbre y/o donde el transporte de muestras de sangre puede ser
difícil o costoso.

Para el zoólogo, la recogida de una muestra de sangre (O. Ryder,

comunicación personal) que puede resultar difícil (por ejemplo, de
un elefante o de un miembro de una especie en peligro de
extinción que no debe ser perturbada).

Finalmente, señalamos que el contenido de ADN de los cabellos suele

ser Limitado y/o degradado.

Sin embargo, siempre que haya suficiente ADN mono catenario para
salvar la distancia entre los extremos 5' de los dos cebadores
oligonucleotídicos, puede tener lugar la amplificación por PCR (D.
Bugawan, observación no publicada).

Por lo tanto, cualquier muestra biológica cuyo contenido de ADN sea

demasiado bajo o demasiado degradado para el análisis RFLP o la
clonación molecular, como tinciones pequeñas y viejas de sangre o
esperma, especímenes histológicos (25,26) o muestras de interés
histórico o prehistórico como tejido momificado permanece (27,28),
deberían ser susceptibles de análisis genético mediante PCR.

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FUENTE: DNA typing from single hairs.

TIPIFICACIÒN DE ADN DE UN SÒLO CABELLO.
AUTORES: Higuchi, Russell , von Beroldingen, Cecilia
H. , Sensabaugh, George F. , Erlich, Henry A.
NATURE, Volumen: 332, Año: 1988.

Church, George and Gilbert, Walter: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.
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Individual Root Shaft

120 bp

a Individual