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UPIBI-IPN
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
ACADEMIA DE BIOQUMICA
Primera versin
ENERO 2008
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio
PRLOGO
El presente manual de laboratorio es para la asignatura de Bioqumica Farmacutica, tiene como
objetivo familiarizar al estudiante con las substancias, mtodos y equipo utilizados en la asignatura
de Bioqumica Farmacutica; darle experiencia personal en algunas tcnicas y ponerlo en
contacto con el mtodo cientfico y seguir estimulando su inters por esta rama de la ciencia, para
lograr este objetivo es necesario que el estudiante tenga presente:
a.- Qu debe leer sus experimentos antes de ejecutarlos
b.- Qu debe recurrir a sus libros de consulta, normas, instructivos de funcionamiento, etc., para
aclarar dudas y comprender el porque de las operaciones que se han de ejecutar
c.- Qu debe hacer cuidadosamente sus experimentos, procurando entender el porqu de los
hechos
d.- Qu debe observar minuciosa y crticamente cada uno de los cambios ocurridos
e.- Qu debe anotar sus observaciones y buscar la explicacin cientfica.
Cada una de las prcticas contiene la metodologa necesaria para el desarrollo experimental de la
prctica, as como los antecedentes tericos necesarios para la comprensin de cada uno de los
experimentos y poder reforzar los aspectos tericos del curso.
En el caso de algunos aspectos tericos complejos, stos pueden ser aclarados a travs de la
lectura suplementaria de la bibliografa recomendada al final del presente manual o bien la
sugerida al inicio del curso.
El manual est integrado por prcticas representativas y secuenciales de las unidades del curso
terico. Los criterios que se tomaron en cuenta para seleccionar el material incluido en este
manual fueron:
1) Que el experimento ilustrara un principio fundamental terico.
2) Que fuera lo ms simple posible permitiendo al alumno llevarlo a cabo en un tiempo de 3,0 h
3) Que fueran de utilidad para sus cursos posteriores.
Para que un alumno realice el experimento en el laboratorio es necesario tener ciertas
precauciones que se mencionan en el reglamento.
Esta primera edicin del Manual no pretende ser definitiva, sino ser objeto de revisiones y mejoras
sistemticas por parte de los miembros de la Academia de Bioqumica, cada una de las prcticas
fueron probadas por los responsables de su elaboracin y diseo antes de ser puestas en
operacin.
Este Manual no sustituye a la participacin y gua de los profesores en el desarrollo experimental,
ni a la discusin de los resultados obtenidos.
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INSTRUCCIONES GENERALES
I.- EVALUACIN
I.1.- El laboratorio se evala como sigue:
Trabajo* - laboratorio...............3,5 puntos
Discusin................................ 3,0 puntos
Reporte de la prctica........... 3,5 puntos
En el trabajo se evala
Antecedentes (lectura de la prctica)..0.5 puntos
Limpieza en todos los aspectos0.5 puntos
Organizacin (para trabajar en equipo)..1.0 punto
Habilidad..1.0 punto
Resultados obtenidos y registrados al momento..0.5 puntos
El reporte se evala:
Objetivo y bibliografa.................................
Resultados y anlisis de resultados............
Discusin y glosario........................
Conclusiones...................................
0,5 puntos
1,5 puntos
1,0 puntos
0,5 puntos
I.2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones
prcticas, aprobar el 80% de las prcticas efectuadas, entregar el 80% de los reportes y obtener
un promedio mnimo de seis.
I.3.- La calificacin del trabajo prctico se obtendr promediando las sesiones de las que conste la
prctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificar con cero en la parte
correspondiente.
I.4.- La calificacin final del laboratorio ser el promedio de las calificaciones de todas las prcticas
I.5.- Si un alumno no asiste a una sesin tendr cero en trabajo prctico, si la justifica se mantiene
la calificacin, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.
I.6.- Cada profesor elegir un reporte, revisando que todos los alumnos miembros del equipo
hayan elaborado el reporte. Si no es as el alumno que no lo presente tendr cero en el reporte.
I.7.- Los equipos que no laven el material correspondiente de la prctica y/o dejen sucias las
mesas tendrn cero en la prctica.
II.- ORGANIZACIN CON LOS ALUMNOS
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Una bata limpia y con botones, de preferencia debe ser de algodn, manga larga y blanca.
Instructivo de laboratorio
Bitcora
Un marcador indeleble
Encendedor o cerillos
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III.10.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio
es un lugar de trabajo.
III.11.- Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar, comer, ingerir
bebidas y mascar chicle dentro del laboratorio adems deber lavarse las manos al final de
cada prctica: Recordar que se maneja un tejido(sangre) as como diversas sustancias.
Todo material biolgico residual deber tratarse con el desinfectante que indique le
profesor (benzal o cloro) a fin de evitar riesgos a la salud.
III.12.- Durante el desarrollo de la prctica, queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo
que visiten a los alumnos.
III.13.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deber ser repuesto por la persona o
personas responsables de l.
III.14.- El alumno revisar el material que reciba y reportar cualquier anomala antes de iniciar el
trabajo prctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
III.15.- Despus de terminada la prctica, el material deber ser entregado limpio, a la persona
encargada del almacn del laboratorio y deber limpiar la mesa al iniciar y terminar la prctica.
III.16.- El alumno evitar su permanencia en el laboratorio despus de terminada la prctica.
III.17.- Todo material contaminado con sangre se depositar en el lugar asignado para su
esterilizacin.
III.18.- Esta prohibido el uso de celular durante la prctica, por lo que se le pide al alumno que lo
apague durante el desarrollo, y discusin de la misma.
NDICE
PRLOGO_________________________________________________________
NDICE____________________________________________________________
Instrucciones generales ______________________________________________
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Blanco
1.0
-
Patrn
1.0
10
-
Muestra
1.0
10
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Blanco
1.0
-
Patrn
1.0
10
-
Muestra
1.0
10
As Patrn
V. RESULTADOS
Anote sus resultados de As en los cuadros siguientes.
Tiempo
0
X1
X2
X3
As Patrn de glucosa
As Patrn de lactato
As Glucosa
As Lactato
Calcule las concentraciones de lactato y glucosa de acuerdo a las formulas dadas y anote los
resultados en la siguiente tabla.
Tiempo
[Glucosa]
mmol/l
[Lactato]
mmol/l
0
X1
X2
X3
Construya las grficas de decaimiento de glucosa y de produccin de cido lctico en el mismo
eje cartesiano. No olvides anotar el pie de figura.
VI. ANALISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
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OBJETIVOS.
FUNDAMENTOS.
El termino respiracin es usado para hacer referencia al proceso en el cual la energa es generada a
travs de molculas nutrimentales, con O2 como el mximo aceptor de electrones, ste trmino es
tambin llamado respiracin celular para distinguirlo del trmino respiracin regular.
Existen tres estados de la oxidacin metablica de compuestos orgnicos:
1. Generacin de un fragmento activado de dos carbonos (el grupo acetilo de la acetil-CoA) del
piruvato (citoplasma), cidos grasos (mitocondria), o aminocidos (citoplasma/mitocondrias).
2. Oxidacin de los carbonos del fragmento de acetilo mediante el ciclo del cido ctrico
(mitocondrias).
3. Transferencia de electrones desde la oxidacin en el paso 2 a travs del sistema de transporte de
electrones para producir ATP de la fosforilacin oxidativa.
Transporte de electrones.
El transporte de electrones es un sistema en el que los electrones generados por la oxidacin son
transferidos. La transferencia de los electrones mediante este sistema genera energa potencial que
es usada para sintetizar ATP en la fosforilacin oxidativa.
El valor de E0 para los acarreadores de electrones en la membrana de la mitocondria se incrementa
en el mismo orden en el que son usados en el transporte electrnico. Dichas reacciones ocurren en el
siguiente orden:
NADH y NADH Deshidrogenasa (Complejo I) La molcula de NADH se genera mediante
numerosas deshidrogenasas en la clula. ste se reoxida a NAD+ por el Complejo I de la
mitrocondria (tambin llamado NADH deshidrogenasa).
Complejo II (Succinato deshidrogenasa) El complejo II no es la forma en la que los electrones
viajan desde el Complejo I. Este es un punto de entrada de los electrones desde FADH2 producido
por la enzima succinato deshidrogenasa en el ciclo del cido ctrico. Estos complejos I y II donan sus
electrones al mismo aceptor coenzima Q.
Coenzima Q (CoQ) - CoQ es una benzoquinona ligada a un nmero de unidades de isopreno. El
tallo de isopreno da a la molcula un character apolar que permite a la CoQ dispersarse rpidamente
a travs de la membrana mitocondrial interna. La CoQ tiene la capacidad de aceptar electrones en
pares y pasarlos uno a la vez mediante un intermediario semiquinona hacia el complejo III.
Complejo III El Complejo III contiene diversas roteinas acarreadoras de electrones. Entre ellas se
encuentran citocromo b, complejos hierro y azufre y citocromo c1. El citocromo b es la primer de las
protenas acarreadoras que contienen un grupo hemo que esta envuelta en el transporte de
electrones.
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EQUIPOS Y REACTIVOS.
Parte I.
Materiales, Equipo y Reactivos.
Material:
1 Tijeras de diseccin.
1 Mortero con pistilo.
1 Tubo de centrifuga con camisa.
11 Tubos de ensayo de 16 X 150 mm.
5 Pipetas de 1 mL.
3 Pipetas de 5 mL.
1 Pipeta de Kahn.
1 Propipeta.
1 Vaso de precipitados de 100 mL.
2 Gradillas.
1 Celda espetrofotomtrica.
1 Bao de hielo.
1 Incubadora a 30oC por seccin.
1 Incubadora a 4oC por seccin.
1 Centrifuga por seccin.
1 Espectrofotmetro por seccin.
2 Termmetro de 0o a 100oC.
Material Biolgico.
1 Rata por equipo.
Reactivo.
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1
(Testig
o)
2
(Completo)
3
(Azida
de
Sodio)
4
(Mg+2)
5*
(-20oC)
6
2,4
DNF
7
Gramicidi
na
KCl 1M
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
1.1
0.6
0.5
0.7
0.6
0.5
0.5
0.1
0.1
0.1
_____
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
______
________
0.1
_____
_____
_____
______
______
_
________
_____
____
_____
0.1
_______
______
_______
_____
_____
_____
____
0.1
Ver
punto
4.9
0.5
0.5
0.5
0.5* Ver
nota
0.5
0.5
Regulador de
Tris 0.1 M pH 7.3
(mL)
Mg Cl2 0.1 M
(mL)
ATP 60 mg/mL
(mL)
Azida de sodio
(mL)
2, 4 DNF (mL)
Gramicidina
(mL)
Preparacin de
mitocondrias
(mL)
*Nota: Para este tubo primero se incuban las mitocondrias a -20oC en hielo seco, durante 15 min y
despus se adicionan la tubo.
4.7 Incubar a 30oC durante 15 min.
4.8 Despus de transcurrido el tiempo de incubacin, adicionar a todos los tubos 1.0 mL de TCA al 30
%.
4.9 Al tubo 1, adicionar 0.5 mL de la preparacin de mitocondrias (despus del TCA).
4.10 Centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos.
4.11 Tomar 0.6 mL de los sobrenadantes y tratarlos como al tubo 4 de la curva tipo pero en lugar de
solucin tipo de fsforo se adiciona sta muestra problema y luego el resto de los reactivos como
marca la tabla.
Atencin: Se debe tener cuidado de No adicionar la solucin tipo de fsforo, pues en su lugar
estamos adicionando los sobrenadantes.
4.12 Determinar la densidad ptica a 660 nm de cada tubo.
C. CURVA TIPO DE FOSFORO.
Tubo
Slucin tipo de fsforo 1mM
(mL)
H2SO4 7.5 N (mL)
1
0.1
0.5
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
____
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
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6.6
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
3.5
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
3.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
Agitar
FeSO4 al 10% (ml)
0.4
0.4
4.14. Agitar y leer en el espectrofotmetro a 660 nm. Utilice como blanco el tubo 7.
PARTE II. TRANSPORTE Y ACEPTORES ARTIFICIALES DE ELECTRONES.
A. ACTIVIDAD DE SUCCINICO DESHIDROGENASA Y DE CITOCROMOS.
4.15 Preparar una serie de 5 tubos y adicione los reactivos que se muestran en la siguiente tabla y en
orden estricto.
CUIDADO!
El KCN ES VENENOSO, UTILICE BURETA PARA ADICIONARLO A LOS TUBOS.
1
Testigo
(Sin
sustrato)
Sustancia
6
+CIT
Regulador de
fosfatos 0.3M pH 7.3
(mL)
3.3
2.3
2.1
2.6
1.8
2.1
DPIP 1M (mL)
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
____
____
0.2
0.2
____
___
____
____
____
____
0.5
___
____
____
____
____
___
0.2
____
0.5
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As 600 nm
1
2
3
4
5
6
7
5.2 Construya la curva tipo de fsforo en papel milimtrico, colocando en las ordenadas la densidad
ptica a 660 nm y en las abscisas la concentracin de fsforo en moles.
5.3 Determine la pendiente de la recta y utilcela como coeficiente para el clculo de la concentracin de
fsforo en el experimento de ATPasa. Diga que parmetro permite determinar si la curva tipo es vlida?
5.4 Escribir los resultados del experimento de ATPasa en la tabla siguiente.
Tubo
Condicin
As 660 nm
Concentracin de
Fsforo (moles)
1
2
3
4
5
6
7
5.5. Explique lo ocurri en el tubo 2.
5.6 Cul es el efecto de eliminar el Mg+2 del tubo de reaccin?
5.7 Qu ocurre en el tubo con mitocondrias preenfriadas a 20oC?
5.8 Qu ocurre en el tubo con azida de sodio?
5.9 Qu ocurre en el tubo con gramicidina?
5.10 Qu ocurre en el tubo con 2,4 DNF?
5.11 Cmo afecta la gramicidina el transporte de electrones?
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Condicin
As 660 nm
1
2
3
4
5
6
5.15 Por qu el tubo 1 disminuye el color, a pesar de que no se adicion el succinato?
5.16 Qu tipo de sustancia es el malonato y a que nivel acta en cadena respiratoria? Explique ya que
nivel acta en cadena respiratoria? Explique como demostr este resultado.
5.17 A qu nivel acta el CN- como inhibidor de la cadena respiratoria? Explicar como demostr lo
anterior.
5.18 Escriba la reaccin de reduccin del DPIP, con frmulas.
5.19 Explique que tipo de sustancia es la gramicidina, y cul es su uso teraputico.
VI. DISCUSIN DE RESULTADOS.
Analice y discuta en base a los resultados obtenidos y a la bibliografa consultada.
VII. GLOSARIO DE TRMINOS TCNICOS.
7.1 POTENCIAL REDOX.
7.2 REDUCCIN.
7.3 OXIDACIN.
7.4 TRANSPORTE DE ELECTRONES.
7.5 FOSFORILACIN OXIDATIVA.
7.6 INHIBIDOR DEL TRANSPORTE DE ELECTRONES.
7.6 DESACOPLANTE.
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BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
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Densidad
(g/ml)
<0.95
0.95-1.0
1.0-1.063
1.063-1.2
Dimetro
()
800-5000
300-800
180-280
50-120
Composicin (% peso)
Protenas
Colesterol
Fosfolpidos
2
10
25
55
9
20
20
24
4
20
45
17
Triglicridos
TAG
85
50
10
4
Los individuos con altos niveles sricos de colesterol de LDL con respecto a las HDL tienen una mayor
incidencia a sufrir ataques cardiacos. Los niveles altos de HDL se relacionan en forma inversa, es decir a mayor
concentracin de HDL es menor el riesgo de sufrir enfermedades cardiacas.
En general se promueve en la poblacin reducir el consumo de colesterol y grasas en la dieta, pero existen
factores que no podemos modificar como el gentico, el de gnero: las mujeres tienden a acumular menos
colesterol y sus niveles de HDL son ms altos y tienen menor incidencia a sufrir enfermedades cardiovasculares
que los hombres. Otros factores que si podemos modificar son el hbito de fumar, el consumo de alcohol, una
dieta abundante en grasa, la falta de ejercicio, y un continuo estrs, que en su conjunto aumentan los niveles de
colesterol y TAG.
Triglicridos: son un grupo de lpidos formados por tres cidos grasos y un glicerol. Son las principales
molculas energticas e ideales como reserva de energa a largo plazo, porque proporcionan ms del doble de
energa por unidad de masa que los carbohidratos. Los triglicridos, como son no polares, se almacenan en forma
anhidra en el tejido adiposo. Para utilizar la energa de los cidos grasos, primero deben ser liberados de los TAG,
y despus ser transportados de los tejidos perifricos a las mitocondrias para su degradacin metablica. El
catabolismo se realiza por -oxidacin, un proceso de cuatro etapas que genera acetil CoA, que entra
posteriormente al ciclo de Krebs. Si la cantidad de molculas disponibles como combustible rebasa las
necesidades fisiolgicas, se inicia la sntesis de cidos grasos, lo cuales se asocian con glicerol y se almacenan en
el tejido adiposo.
Los niveles de triglicridos se elevan por una ingesta alta en grasas saturadas o carbohidratos, tambin por exceso
de peso, consumo de alcohol, la edad (aumentan con la edad), algunos medicamentos como los anticonceptivos,
esteroides, diurticos causan aumento en los niveles de TAG, enfermedades como la diabetes, hipotiroidismo,
enfermedades renales y hepticas se asocian tambin con niveles altos, adems del factor hereditario (trastornos
genticos).
Un nivel elevado de triglicridos se asocia como factor de riesgo de enfermedad cardiaca junto con el colesterol,
adems de ser riesgoso al asociarse con diabetes y pancreatitis.
Membranas celulares. La diversidad de lpidos de membrana es extensa, sin embargo tienen en comn una
caracterstica muy importante, los lpidos de membrana son molculas anfipticas. Contienen una parte
hidroffica y otra hidrofbica. La formacin de membranas es una consecuencia de la naturaleza, sus cabezas
polares facilitan el contacto con el agua, mientras que sus colas hidrocarbonadas interaccionan entre si, en lugar
de hacerlo con el agua. Una forma de ordenarse en medio acuoso es formando micelas, estructuras globulares en
la que los grupos de la
cabeza polar estn rodeados de agua y las colas hidrocarbonadas estn secuestradas en el interior e interaccionan
una con otra, otro orden es la bicapa lipdica o liposomas, compuesta por dos capas de lpidos, las colas
hidrocarbonadas de cada capa individual interaccionan entre ellas, formando un interior hidrofbico que acta
como barrera de permeabilidad. Los grupos polares interaccionan con el medio acuoso. La estructura ms
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Fosfolpido
Micela
Bicapa lipdica
Liposoma
La formacin de bicapas lipdicas a partir de fosfolpidos es un proceso rpido y espontneo de auto ensamblaje,
siendo las interacciones hidrofbicas las principales fuerzas que determinan su formacin, adems de las fuerzas
de Van der Waals que favorecen el empaquetamiento compacto de las colas hidrocarbonadas.
La tendencia de los fosfolpidos a formar membranas, se ha utilizado para crear una importante herramienta
experimental y clnica, los liposomas, que son compartimentos acuosos rodeados por una bicapa lipdica, con un
arreglo similar al de las membranas celulares, pueden emplearse para el estudio de la permeabilidad de la
membrana o para liberar frmacos en las clulas.
Los liposomas pueden prepararse suspendiendo un lpido como la fosfatidilcolina, en un medio acuoso.
Posteriormente, la mezcla se agita por medio de ondas snicas de alta frecuencia, con lo que se consigue una
dispersin de vesculas cerradas de tamao bastante uniforme, las vesculas formadas segn el procedimiento
indicado tiene una forma esfrica, con un dimetro de unos 50 nm
(500 ). Se pueden formar vesculas mayores de 1 m de dimetro, mediante la evaporacin lenta del disolvente
orgnico de una suspensin de fosfolpidos en una mezcla de disolventes. Los liposomas pueden estar formados
por una bicapa lipdica, liposoma unilamelar (LUV) o varias capas concntricas, liposomas multilamelar( MLV)
cuyas capas estn separadas por espacios acuosos. La estructura vesicular de los liposomas y su capacidad de
incorporar sustancias hidroflicas o hidrofbicas, permite aplicarlos en diversos campos de la ciencia y tecnologa.
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REACTIVOS
Nota: Dependiendo del Kit que se tenga en la prctica, las concentraciones, cantidades y condiciones de las
reacciones pueden variar.
R1
Regulador
R2
Enzimas
GOOD pH 7,5
50 mmol/L
p-Clorofenol
2 mmol/L
Lipoprotein lipasa (LPL) Glicerol quinasa (GK) 150000 U/L
Glicerol-3-oxidasa (GPO) Peroxidasa (POD)
500 U/L
4 Aminofenazona (4-AF)
2500 U/L
ATP
440 U/L
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Blanco
1,0
Patrn
1.0
Muestra
1.0
Patrn (L)
--
10
--
Muestra (L)
--
--
10
5.1 RESULTADOS
Equipo Triglicridos (mg/dl) Equipo Triglicridos (mg/dl)
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CONTROL DE CALIDAD. Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados. S los
valores hallados se encuentran fuera del intervalo de tolerancia, se recomienda revisar el instrumento, los
reactivos y el calibrador.
VALORES DE REFERENCIA
Hombres: 40 160 mg/dL
Mujeres: 35 165 mg/dL
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
B) HDL-COLESTEROL (Lipoprotenas de alta densidad)
FUNDAMENTO. Esta tcnica permite la determinacin directa del HDL-colesterol sin necesidad de pretratamiento o centrifugado de la muestra.
El mtodo se basa en las propiedades de un detergente que solubiliza slo la fraccin HDL, el cual se libera
reaccionando con la enzima colesterol esterasa, la colesterol oxidad y los cromgenos.
Las lipoprotenas LDL, VLDL y los quilomicrones son inhibidas debido a la adsorcin del detergente en sus
superficies hacindolas resistentes a la enzima. La intensidad de color formado es proporcional a la concentracin
de HDL presente en la muestra.
MUESTRA. Obtener 3 mL de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el cogulo
durante 5 a 35 o C y centrifugar durante 7 a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de 13 x 100
utilizando una pipeta Pasteur, se puede utilizar plasma pero no con citrato. El HDL-colesterol es estable por 7
das a temperatura ambiente, en este mtodo. No utilizar muestras hemolizadas.
REACTIVOS
GOOD pH 7,0
Colesterol oxidasa
< 1000 U/L
R1
Peroxidasa
< 1300 U/L
DSBmT
< 1 mM
GOOD p H 7,0
Colesterol esterasa
< 1500 U/L
R2
4-aminoantipirina
< 1 mM
Detergente
< 2%
Ascrbico oxidasa
< 3000 U/L
HDL-colesterol/ LDL-c CAL Calibrador. Suero humano liofilizado
PREPARACIN DE REACTIVOS. Los reactivos R1 y R2 estn listos para usarse. El calibrador se reconstituye
con 1 mL de agua destilada, tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver el contenido.
PROCEDIMIENTO
1. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . 600-700 nm
Cubeta o celda:. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37C
2. Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada.
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45
Blanco
300
Calibrador
300
Muestra
300
Calibrador (L)
--
--
Muestra (L)
--
--
R 2 L
Calibrador
100
Muestra
100
(A) Muestra
(A) Calibrador
Factor de conversin: mg/dL x 0,0259 = mmol/L.
5. 2 RESULTADOS
Equipo HDL-colesterol (mg/dl) Equipo
HDL-colesterol (mg/dl)
Las lipoprotenas de baja densidad (LDL) y de muy baja densidad (VLDL) se pueden determinar de
acuerdo con la ecuacin de Friedewald:
VLDL-C= triglicridos/5
LDL-C= colesterol total - (HDL C + VLDL C)
VALORES DE REFERENCIA
Hombres
Mujeres
Riesgo menor
> 50 mg/dL
Riesgo normal 35-50 mg/dL
Riesgo elevado < 35 mg/dL
> 50 mg/dL
45-60 mg/dL
< 45 mg/dL
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio
46
Lecitina (m L)
-----
----
Almidn (mL)
----
2
1
1
5.3 RESULTADOS
Hacer esquemas de las observaciones al microscopio de cada tubo
Anota con signo + si la prueba de lugol es positiva, en los tubos probados, en la tabla siguiente.
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio
47
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio
48
TRIS pH 7,8
L-Aspartato
NADH
Lactato deshidrogenasa (LDH)
Malato deshidrogenasa (MDH)
-Cetoglutarato
80 mmol/L
200 mmol/L
0,18 mmol/L
800 U/L
600 U/L
12 mmol/L
o-Ftalaldehido
4,8 mmol/L
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio 50
Solucin borato
87 mmol/L
Fosfatos pH 7,4
50 mmol/L
2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS)
4 mmol/L
Uricasa
60 U/L
Peroxidasa (POD)
660 U/L
Ascorbato oxidasa
200 U/L
4 - Aminofenazona (4-AF)
1 mmol/L
Patrn primario acuoso de cido rico 6 mg/dL
3.3. Equipo
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro
2 celdas espectrofotomtricas
3.4 Muestra biolgica
Muestra de suero o plasma heparinizado
Muestra de orina
Urea en orina: Diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por
50 (factor de dilucin). Evitar el crecimiento bacteriano, manteniendo el pH < 4.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
TOMA DE MUESTRA
a.- Suero
1.- Tomar de manera asptica 5 ml de sangre siguiendo las instrucciones del profesor en un tubo de
ensaye limpio y seco, el cual debe estar etiquetado.
2.- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm
3.- Separar el suero por medio de una pipeta Pasteur
b.- Orina
1.- En un frasco de toma de muestra de orina limpio y seco depositar aproximadamente 50 ml de orina,
de preferencia la primera de la maana.
c.- Determinacin de transaminasas
1.- Encender el aparato y seleccionar la longitud de onda de:340 nm
2.- Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada.
3.- Disolver una tableta de R2 (sustrato) en R1 (regulador)
4.- En la celda espectrofotomtrica pipetear lo que se indica en el siguiente cuadro.
RT (mL)
Muestra (L)
1,0
100
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio 51
As60s____
As 120s:______
As180s:_____
Patrn
1,0
1,0
-50
---
Muestra
1,0
-50
3.- Mezclar e incubar por un minuto a 35 C y aadir 1 ml del reactivo (R2) a cada tubo.
4.- Inmediatamente colocar el contenido del tubo a una celda espectrofotometrica y leer la absorbancia a
los 60 y 120 s.
5.- Calcular el incremento de Absorbancias As= As2 As1 .
Datos:
As1 60 s: _______________
CLCULOS
(As) muestra
---------------------X 50 (conc. del patrn)= mg/dl de urea en la muestra.
(As) patrn
Valores de referencia orientativos.
Urea
Suero: de 15 a 45 mg/dL (2.49-7.49 mmol/L)
Orina: de 20 a 35 g/24 horas
e.- Determinacin cuantitativa de cido rico (marca SPINREACT)
1.- Preparar el reactivo de trabajo, disolviendo el contenido de R2 (enzimas) en el frasco de R1
(regulador), el reactivo as preparado es estable por un mes de 2 a 8 C o 10 das a temperatura
ambiente.
2.- Encender el espectrofotmetro y seleccionar la longitud de onda de 520 nm
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio 52
Blanco
1,0
---
Patrn
1,0
25
--
Muestra
1,0
-25
Concentracin
del
patrn:
Suero o plasma
(As) muestra
---------------------X 6 (conc. del patrn)= mg/dl de cido rico en la muestra.
(As) patrn
(As) muestra
---------------------X 6 X vol (dl) orina / 24 h = mg/24 h de cido rico en la muestra.
(As) patrn
Valores de referencia orientativos.
cido rico
Suero o plasma
Mujeres:
Hombres:
Orina:
PRCTICA 6
DETERMINACIN DE COLESTEROL EN SUERO HUMANO
UNIDAD V. Anabolismo celular
Tema: 5.4. Metabolismo de colesterol.
1.- OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
El alumno analizar el anabolismo de lpidos mediante la determinacin de colesterol.
1.2 Objetivo especfico.
El alumno realizar la determinacin experimental de colesterol en suero humano.
2. INTRODUCCIN.
El colesterol es un lpido esteroide presente en las clulas de los tejidos animales, hidrofbico, poco
soluble en medio acuoso, se puede encontrar libre o esterificado con cidos grasos, se une a diversas
protenas formando las lipoprotenas plasmticas para ser transportado. La determinacin de la
concentracin plasmtica de colesterol tiene gran inters clnico, pues est demostrada la relacin entre los
niveles altos de colesterol y la incidencia de aterosclerosis y cardiopata isqumica.
Sabemos que el colesterol es necesario para el adecuado crecimiento y desarrollo celular, pero en exceso
es potencialmente daino. Su transporte por las lipoprotenas y captura en las clulas est regulado, pero
demasiado colesterol en la sangre lleva a que se acumule, en especial en las arterias a las que puede
obstruir (ateroesclerosis).
Los mamferos pueden obtener el colesterol por dos vas, la exgena y la endgena. La va exgena es por
la ingesta de alimentos de origen animal, como el hgado, lcteos, carnes rojas y yema de huevo. La va
endgena es la biosntesis de colesterol en el organismo, que se realiza en el retculo endoplsmico liso y
cuyo precursor es la acetil-coenzima A. Diariamente el hgado produce alrededor de 800 a 1000 mg de
colesterol, aunado a los cientos de miligramos que ingerimos en la dieta, dara una elevada concentracin
de este, pero la ingesta de colesterol disminuye la sntesis en el organismo.
El colesterol desempea varias funciones bioqumicas importantes, es un componente esencial de las
membranas celulares en animales, donde regula su fluidez y es un precursor de muchas biomolculas
importantes, incluidas las hormonas esteroideas, las sales biliares y la vitamina D. Los problemas de salud
no se deben a un efecto directo de la molcula, sino a una deficiencia fisiolgica en su transporte, debido a
su baja solubilidad y tiene que ser transportado por protenas plasmticas formando lipoprotenas, como
las LDL, VLDL y HDL.
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio
54
El proceso de captacin inicia con la unin de las LDL que contienen colesterol con lugares de unin
especficos en las clulas, conocidos como receptores proteicos de la membrana plasmtica. Las LDL se
invaginan en la membrana plasmtica y se fusionan como parte de ella para formar una vescula
endoctica. Dentro de la clula, la vescula se fusiona con los lisosomas, y las enzimas lisosomales
catalizan la hidrlisis de los steres de cido graso dejando al colesterol libre para la construccin de
membranas. Una de las causas de hipercolesterolemia (niveles altos de colesterol sanguneo) es un
defecto gentico, donde las personas carecen de receptores de LDL funcionales y desarrollan el sndrome
conocido como hipercolesterolemia familiar. Esta enfermedad ocasiona que los niveles de colesterol
lleguen hasta 700 mg/100 ml, los niveles normales estn entre 150-200 mg/100 ml). El colesterol se
deposita como placas en las arterias y provoca aterosclerosis (endurecimiento de las arterias), muchos de
las personas que padecen esta enfermedad mueren de ataques cardiacos durante su infancia.
En general se promueve en la poblacin reducir el consumo de colesterol y grasas en la dieta, pero existen
factores que no podemos modificar como el gentico y el de gnero: las mujeres tienden a acumular
menos colesterol y sus niveles de HDL son ms altos y tienen menor incidencia a sufrir enfermedades
cardiovasculares que los hombres. Otros factores que si podemos modificar son el hbito de fumar, el
consumo de alcohol, una dieta abundante en grasa, la falta de ejercicio, y un continuo estrs, que en su
conjunto aumentan los niveles de colesterol y TAG.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS POR EQUIPO
Bao a 25 o 30o C
1 gradilla
5 tubos de 13 x 100
2 pipetas de 2 ml
2 pipetas de 1 ml
Una jeringa de 10 ml y/o aguja, adaptador y tubo vacutainer sin anticoagulante.
EQUIPO
Espectrofotmetro para luz UV
2 celdas espectrofotomtricas
1 porta celdas
1 centrfuga
REACTIVOS
Kit para Colesterol
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
MUESTRA: Obtener 3 ml de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el
cogulo durante 5 a 35 o C y centrifugar durante 7 a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de
13 x 100 utilizando una pipeta pasteur.Se puede utilizar suero o plasma. La muestra es estable 7 das a 28C y varios meses si se mantiene la muestra congelada (-20C).
A. COLESTEROL. Los primeros mtodos para la determinacin del colesterol se basaban en la formacin
de compuestos coloridos mediante reacciones qumicas del colesterol. No obstante, debido a los lquidos
corrosivos que utilizan, estos mtodos actualmente no se suelen emplear para los anlisis de rutina, a la
fecha se han desarrollado mtodos enzimticos, igualmente especficos, de fcil manejo y de gran
sensibilidad.
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55
Fundamento: En estos mtodos enzimticos, la primera reaccin consiste en la hidrlisis de los steres de
colesterol por accin de esterasas bacterianas inespecficas con respecto al cido graso esterificado; a
continuacin se produce la oxidacin del colesterol (el formado en la reaccin anterior y el preexistente, o
colesterol libre en plasma) por una colesterol oxidasa, producindose H2O 2, el cual con la participacin
de peroxidasa da lugar a la formacin de un compuesto colorido. El esquema de las reacciones acopladas
es el siguiente:
CHE
steres colesterol + H2O Colesterol + cidos grasos CHOD
POD2O
Colesterol + O2 4-Colestenona + H2O2
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona Quinonimina + 4H+ Compuesto colorido
CHE: Colesterol esterasa
CHOD: Colesterol oxidasa
POD2O: Peroxidasa
La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de colesterol presente en la muestra
ensayada
El colesterol es una sustancia presente en todas las clulas del organismo. El hgado produce naturalmente
todo el colesterol que necesita para formar las membranas celulares y producir ciertas hormonas. La
determinacin del colesterol es uno de las herramientas ms importantes para el diagnstico y
clasificacin de las lipemias. El aumento del nivel de colesterol es uno de los principales factores de
riesgo cardiovascular.
El diagnostico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos y de laboratorio.
Dependiendo del Kit que se tenga en la prctica, las concentraciones, cantidades y condiciones de las
reacciones pueden variar.
REACTIVOS
PIPES pH 6,9
R1
Regulador Fenol
Colesterol esterasa (CHE)
Colesterol oxidasa (CHOD)
R2
Enzimas
Peroxidasa (POD)
4 - Aminofenazona (4-AF)
Patrn de Colesterol
90 mmol/L
26 mmol/L
300 U/L
300 U/L
1250 U/L
0,4 mmol/L
200 mg/dL
PREPARACIN DE REACTIVOS:
Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en 1 frasco de R 1 Regulador,
tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
Estabilidad (RT): 4 meses en nevera (2-8C) o 40 das 15-25C. Mantener protegido de la luz
Conservacin y estabilidad. Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8C, protegidos de la luz y se
evita su contaminacin.
Patrn de colesterol. Una vez abierto, es estable 1 mes si se mantienen bien cerrados a 2-8C, protegidos
de la luz y se evita su contaminacin.
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56
PROCEDIMIENTO
1. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . 505 nm (500-550)
Cubeta o celda. . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz
Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37C /15-25C
2. Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada.
3. Pipetear en una celda:
Blanco
Patrn
Muestra
1,0
1,0
1,0
--
10
--
Muestra (L)
--
--
10
Colesterol (mg/dl)
VALORES DE REFERENCIA
Evaluacin del riesgo:
Menos de 200 mg/dL Normal
200-239 mg/dL
Moderado
240 o ms
Alto
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57
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.
6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.
Analiza y discute los resultados obtenidos, as como la metodologa utilizada. Discute la importancia del
uso de las enzimas en el diagnstico clnico. Contesta las siguientes preguntas e inclyelas en la discusin.
1.- Cual es la importancia clnica de las determinaciones de colesterol?
2.- Explica 3 enfermedades ocasionadas por la alteracin de los niveles de colesterol y que otros
parmetros hay que tomar en cuenta.
3.- Por qu los valores de colesterol pueden variar de una localidad a otra?
4.- Por qu la ingesta de colesterol, disminuye la sntesis de colesterol en el hgado?
5.- Investiga 2 frmacos que se utilicen para disminuir la concentracin de colesterol en la sangre
6.- Qu enfermedad gentica ocasiona la hipercolesterolemia, y que protena se ve afectada?
7.- CONCLUSIONES. Con el anlisis y discusin de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos
de la prctica y la investigacin bibliogrfica, haz tus conclusiones.
8.- BIBLIOGRAFIA.
Cita la bibliografa consultada para hacer tu reporte.
Bibliografia
Davidsohn I., Henry J. B.Todd-Sanford. Diagnstico clnico por el laboratorio.6. Edicin. Salvat editores.
Barcelona. 1979. 1484 pgs.
Devlin. T. M., Bioqumica con aplicaciones clnicas tomo I y II 3. Ed- Revert S.A., Espaa. 1997. 1298
pgs.
Boyer R. Conceptos en Bioqumica.1ra. Edicin. International Thomson Editores. Mxico. 1999. 694 pg
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58
Practica No 7
TRANSFERENCIA Y EXPRESIN DE MATERIAL GENTICO
Relacin con Unidad Temtica
VI. Aspectos Genticos del Metabolismo
I. OBJETIVOS
El alumno trasferir material gentico a un microorganismo.
El alumno verificara que el material gentico contiene la informacin especfica.
II. FUNDAMENTOS TERICOS.
El DNA (cido desoxirribonucleco) es el almacn de la informacin gentica de los seres
vivos, en el se encuentran codificadas todas la caractersticas que definirn a un ser vivo
como miembro de una determinada especie, as como un organismo con caractersticas
propias individuales.
La expresin de material requiere primero de su amplificacin por el mecanismo de
transcripcin, donde se generan molculas de RNA que llevan la informacin gentica
hacia el sistema donde sta ser decodificada mediante el proceso de traduccin, en el, la
informacin es traslocada a una protena especfica, las diversas protenas generadas por la
transcripcin y traduccin de diversos genes darn origen a los complejos
macromoleculares enzimticos o estructurales que generarn en ltima instancia las
caractersticas propias de cada individuo.
Si bien el pool gentico es propio de cada especie e individuo, en la naturaleza existen
diversos mecanismos que permiten el intercambio de material gentico entre organismos de
modo tal que las caractersticas de un individuo as como de su descendencia pueden
modificarse y ser expresadas como propias. Desde hace varios aos los investigadores han
logrado manipular los diversos mecanismos de transferencia de material gentico para
lograr un fin determinado, intentando incluso la manipulacin gentica en el ser humano
empelando para ello las tcnicas modernas de biologa molecular.
La transduccin, la conjugacin y la transformacin son las vas, mediante las cuales se
puede introducir material gentico exgeno a una clula. La transformacin gentica se
presenta cuando, el DNA desnudo es incorporado a la clula, despus de esto, el DNA
puede o no ser integrado al propio material gentico. El material gentico puede ser un
plsmido que ha sufrido o no la manipulacin por el hombre, por lo que podra contener
genes de resistencia o de importancia industrial o farmacolgica.
La sntesis de protenas puede ser constitutiva o inducida, esto es, la sntesis de protenas es
regulable, la regulacin ocurre a nivel de transcripcin, lo que significa que muchas
protenas solo sern generadas cuando la clula lo requiera, cuando se presente un estmulo
que desencadene su produccin, estmulo que generalmente es una seal del medio
ambiente.
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En esta prctica se emplear el plsmido pGLO, el cual, contiene el gen para la protena
verde fluorescente, aislada de la medusa Aequorea victoria, (un eucariota), unida al
promotor PBAD de arabinosa, el gen ara C, y el gen para resistencia a ampicilina el cual
acta como gen reportero. ste plsmido se introducir a una clula bacteriana para dotarla
de la capacidad de producir la protena verde fluorescente (GFP) y se inducir su expresin
con el catabolito arabinosa.
III. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
Plsmido pGLO.
Solucin de transformacin con cloruro de calcio estril.
Caldo Luria
Medio Luria con Ampicilina (50g/ml)
Medio Luria con Ampicilina y Arabinosa (1mg/ml)
Tubos de microensayo de 1.5 ml estriles.
Pipetas automticas de una 1000l y otra de 10l
Puntas estriles
Asa bacteriolgica
Pipetas estriles de 1ml.
Varilla acodada
Bao de hielo
Bao Maria a 42C
Lmpara de luz UV
Incubadora a 37C
IV. DESARROLO EXPERIMENTAL
Todo el trabajo se realizar en condiciones de esterilidad, cerca de un mechero encendido.
1. Marcar dos tubos de microensayo estriles como +pGLO y pGLO (Testigo)
2. Transferir a cada tubo 250l de solucin de transformacin.
3. Colocar los tubos en hielo.
4. Con asa bacteriolgica tomar una colonia de bacterias y sumergirla en la solucin de
transformacin en uno de los tubos, agitando para formar una suspensin bacteriana.
5. Repetir el procedimiento con el otro tubo.
6. Tomar el tubo con la solucin de pGLO y examinarlo bajo luz UV. Anotar las
observaciones.
7. Tomar 1l de sta solucin de plsmido y adicionarlo al tubo con la suspensin
bacteriana. Adicionar tambin 1l al tubo testigo.
8. Incubar los tubos en hielo durante 10minutos.
9. Transferir ambos tubos a un bao mara a 42C durante exactamente 50 segundos.
10. Inmediatamente despus regresarlos al hielo. Para mejores resultados se deben realizar
los cambios de hielo a 42C y de regreso a hielo, lo ms rpido posible.
11. Incubar en hielo durante 2 minutos.
12. Sacar del hielo los tubos y adicionar a cada uno 250l de caldo luria en condiciones
estriles. Mezclar perfectamente.
13. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos.
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14. Tomar 0,1ml de cada tubo y colocarlos en las diferentes cajas de petri segn el siguiente
esquema: (Usar una pipeta estril para cada tubo)
Tubo con pGLO
LB + Amp
LB + Amp + Ara
Con pGLO
LB + Amp.
LB+Amp+Ara
Sin pGLO
LB + Amp
LB
61
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PRACTICA No. 8
DETERMINACIN DE HORMONA GONADOTROPINA CORINICA HUMANA (HGC)
UNIDAD VII: Integracin y Regulacin del Metabolismo.
TEMA
7.3 Principales Hormonas en humanos.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo General
Explicar la regulacin del metabolismo y el papel de las hormonas en el mismo.
1.2 Objetivos Especficos
1.2.1 El alumno realizar la determinacin cualitativa de la hormona gonadotropina corionica humana en
una muestra biolgica.
1.2.3 El alumno interpretar el resultado como una forma de diagnostico.
2. INTRODUCCIN
A partir del momento en que el vulo es fecundado por un espermatozoide, comienzan a producirse en el
cuerpo de la mujer, una serie de cambios bioqumicos destinados a adaptarse a la nueva situacin, y que
continuarn durante los nueve meses siguientes. Esto es lo que conocemos como un embarazo.
Existen muchas seales asociadas al embarazo, la ms comn es la falta menstrual, pero como no todas
las mujeres tienen periodos regulares es importante observar otras seales como: nuseas, acidez,
fatiga, y micciones frecuentes, aunque para confirmar el embarazo, es necesario detectar la presencia de
una hormona llamada gonadotropina corinica humana (HGC), que es producida por la placenta y se
encuentra presente en la sangre y en la orina de la mujer embarazada, siendo detectable de 7 a 10 das
tras la concepcin.
La hormona gonadotropina corinica humana (HCG) es una hormona glicoproteica que se produce en
condiciones normales en la placenta y aparece en el plasma y en la orina durante el embarazo. La HCG,
junto a la hormona folculo estimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del
tiroides (TSH), est constituida por una cadena alfa, estructuralmente similar entre ellas, y una cadena
beta especfica que determina su actividad biolgica. Esta hormona estimula la produccin de hormonas
esteroides por el cuerpo lteo, lo que propicia el ambiente uterino adecuado para el desarrollo del
embrin. El principal uso de la determinacin de la HCG es el diagnstico temprano del embarazo; sin
embargo, es posible observar niveles elevados en pacientes con carcinomas urogenitales, embarazos
ectpicos y ovricos.
La HGC constituida por dos subunidades, la subunidad la cual es idntica a las subunidades de
hormonas hipofisiarias como la (LH), (FSH), y (TSH). La subunidad es la que proporciona su funcin
biolgica especfica y la que detecta especficamente a la hora de hacer la prueba, por lo tanto cuando se
determina la HCG lo que realmente se mide es la subunidad de la HGC.
La determinacin de HCG se realizaba tradicionalmente por ensayo inmunoisotpico (RIA) con el uso de
anticuerpos policlonales, mtodo altamente sensible pero que presenta un marcado efecto de reacciones
cruzadas en relacin con las dems hormonas glicoproteicas, lo cual hace poco precisos los resultados.
De ah que recurrir a la tecnologa de produccin de hibridomas es una ventaja en este sentido, ya que
permite disponer de poblaciones homogneas de anticuerpos que por su especificidad y suministro
ilimitado permiten desarrollar metodologas alternativas.
En el mercado existen muchos reactivos comerciales entre los que podemos encontrar los
inmunoensayos por cromatografa de flujo lateral. El mtodo emplea una combinacin nica de
conjugado anticuerpo monoclonal-colorante y anticuerpos policlonales en fase slida para identificar
selectivamente HCG presente en la muestra, con un elevado grado de sensibilidad. En menos de 5
minutos, pueden detectarse niveles de HCG tan bajos como 10 mIU/ml.
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Cuando se aplica una cantidad suficiente de muestra en la porcin absorbente, sta migra por capilaridad
a travs de la tira. El conjugado anticuerpo-colorante se une a la HCG formando un complejo anticuerpoantgeno. Este complejo se une al anticuerpo anti-HCG de la zona de reaccin positiva produciendo una
banda coloreada rosa cuando la concentracin de HCG es mayor de 10 mIU/ml. En ausencia de HCG, no
se observa banda alguna en la zona de reaccin positiva. La mezcla de reaccin continua la migracin a
travs de la tira hasta la zona control. El conjugado libre an, se une a los reactivos de la zona control
formando una banda coloreada rosa, demostrando el correcto funcionamiento de la prueba.
3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO
3.1. Material por equipo
2 tubos de ensaye 13 X 100 mm
1 gradilla
1 pipetas Pasteur
1 bulbo para pipeta Pasteur
1 jeringa con aguja estril de 5 mL
Torundas impregnadas con alcohol
1 ligadura
Recipiente para objetos punzocortantes
3.2. Reactivos
1 kit comercial para la deteccin de HGC
3.3. Equipo
Centrfuga clnica
3.4 Muestra biolgica
Muestra de suero
Muestra de orina
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
TOMA DE MUESTRA
a.- Suero
1.- Tomar de manera asptica 5 ml de sangre, con el procedimeitno que indique el profesor en un tubo de
ensaye limpio y seco, el cual debe estar etiquetado.
2.- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm
3.- Separar el suero por medio de una pipeta Pasteur
b.- Orina
1.- Etiquetar un frasco, el cual debe estar limpio y seco
2.- Solicitar a la persona a la cual se le har la determinacin la muestra de orina, de preferencia la
primera orina de la maana.
3.- Si el anlisis no se realiza inmediatamente la muestra se puede refrigerar de 2 a 8 C, hasta por 24
horas.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1.- Una vez colocada la muestra en el tubo correspondiente ya sea de suero u orina.
2.- Introducir verticalmente la tira HCG en la muestra durante 5 segundos para las muestra de orina o 10
segundos para las muestras de suero.
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio
65
3.- Leer en ambos casos el resultado a los 3-5 minutos y comparar con el resultado que viene en el
inserto de la prueba.
Precaucin: No sobrepasar la marca roja y no interpretar el resultado despus de transcurrir 10 minutos.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1.- La prueba solo sirve como diagnostico in vitro como un estudio preliminar cualitativo.
2.- No realizar la prueba en embarazos muy temprano, pues a bajas concentraciones el resultado puede
ser negativo.
RESULTADOS
Negativo: Si slo aparece una banda coloreada transversal en la zona blanca superior (banda control)
Positivo: Adems de la banda transversal roja (control) aparece una segunda banda transversal roja en
la zona blanca central de la tira
No vlido: Si no aparece ninguna banda coloreada visible se recomienda repetir la prueba con una
nueva placa u obtener una muestra fresca.
ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
Las siguientes preguntas se deben emplear para fortalecer el reporte.
Cul es la sensibilidad de este mtodo?, Dado que existe una fraccin similar en varias hormonas Cul
es la importancia de elegir una fraccin especfica en la determinacin de esta prueba?, Con que
hormonas puede ocasionar reacciones cruzadas y cuando se llevara a cabo? Existen algunas
sustancias que interfieran en el mtodo?, Esta hormona solo es secretada en las mujeres?, Cul es la
funcin de la HGC?
CONCLUSIONES
Anota las conclusiones obtenidas en esta prctica
BIBLIOGRAFA
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