CURSO:

Microbiología de GRUPO: M05

Alimentos
INTEGRANTES: Stiven Serrano Cordero
Sherin López Ortiz
NOMBRE GUIA DE LABORATORIO: DETERMINACIÓN DE COLIFORMES EN ALIMENTOS.
DOCENTE: MSc.
Sandra Lorena FECHA: 02/09/2021
Contreras C.
NOMBRE DEL
PRODUCTO: Leche en polvo
MARCA:
Klim
DIRECCIÓN DE LA
Transversal 18 Nº 96-41, Bogotá, Colombia.
EMPRESA:
CARACTERÍSTICAS
SENSORIALES: Sabor: ligeramente dulce.

PH Y Tº: pH= 6.5-7,2

T°= 30ºC

La leche en polvo para almacenar a granel se utilizan bolsas de papel

CLASE DE EMPAQUE kraft de tres folios con una bolsa interior de polietileno sellada
Y ESTADO DEL independientemente; los folios externos deben estar cosidos “sellado
EMPAQUE (consultar) herméticamente”. Si esta es empacada en material rígido como hojalata
debe ser empacada en atmosfera de gas inerte.

Nº REGISTRO
RSA-0007305-2019
SANITARIO
Nº DE LOTE L 10326537 E4
FECHA DE
VENCIMIENTO/VIDA
VENCE: 1 Feb 2022
ÚTIL ESPERADA EN
VIDA ÚTIL ESTIMADA: 9-12 meses
TIEMPO Y
T°= 26-30ºC
TEMPERATURA
(Consultar)
NTC 1036/02
NORMA NACIONAL
Dec 616 / 2006

ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICOS
CON SUS
RESPECTIVOS
RANGOS
 NMP = número más probable (se recomienda utilizar la técnica de NMP
debido a que esta técnica se utiliza más para productos con baja carga
microbiana.

n = número de muestras que se van a examinar

m = índice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad

M = índice máximo permisible para identificar nivel de calidad aceptable

C = número de muestras permitidas con resulta de entre m y M

< = léase menor de

Límite máximo de contaminantes

Tomada de: (ICONTEC 2008), con modificaciones.

ANÁLISIS
FISICOQUÍMICOS

Tomada de: (ICONTEC 2008), con modificaciones.

 FORMATO: RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

NORMA –
PARÁMETRO DILUCIONE
(registren el S
FECHA recuento INFORM
Tº/TIEMPO
DE MUESTR ANÁLISIS permitido para MEDIO DE E (NTC
TÉCNICA INCUBACIO
LECTUR A LABORATORIO el CULTIVO 4092 E
N 10-
A microorganis X N° INVIMA)
mo analizado,
según la
norma)
Leche en DETERMINACI Caldo técnica 35ºC +/-2ºC/ 10-1 T1:1
02/09/202 polvo ÓN DE Fluorocult colorimétri 24-48 horas T2:0
1 COLIFORMES 10-100 ca T3:0
EN
ALIMENTOS.
Leche en DETERMINACI Caldo técnica 35ºC +/-2ºC/ 10-2 T1:1
02/09/202 polvo ÓN DE Fluorocult colorimétri 24-48 horas T2:1
16 NMP
1 COLIFORMES 10-100 ca T3:1
ml/gr.
EN
ALIMENTOS.
02/09/202 Leche en DETERMINACI Caldo técnica 35ºC +/-2ºC/ 10-3 T1:0
1 polvo ÓN DE Fluorocult colorimétri 24-48 horas T2:0
COLIFORMES 10-100 ca T3:0
EN
ALIMENTOS.
Leche en DETERMINACI Petrifilm Superficie 35ºC +/-2ºC/ 10-1 P1:36
02/09/202 polvo ÓN DE 24-48 horas
1 COLIFORMES 10-100 36
EN
ALIMENTOS.
Leche en DETERMINACI Petrifilm Superficie 35ºC +/-2ºC/ 10-2 P1:0
02/09/202 polvo ÓN DE 10-100 24-48 horas 0
1 COLIFORMES
 EN
ALIMENTOS.

Leche en
DETERMINACI MC-MEDIA Superficie 35ºC +/-2ºC/ 10-1 PCC:6 Están
02/09/202 polvo ÓN DE PAD E. COLI 24-48 horas PEC:9 por
1 COLIFORMES 10-100 Y debajo
EN COLIFORME del
ALIMENTOS. S rango
02/09/202 Leche en DETERMINACI MC-MEDIA Superficie 35ºC +/-2ºC/ 10-2 PCC:0
1 polvo ÓN DE PAD E. COLI 24-48 horas PEC:0
COLIFORMES 10-100 Y 0
EN COLIFORME
ALIMENTOS. S
RESULTADOS DEL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS USADOS Y DEL AGUA PEPTONA:

Figura 1. Análisis positivo para la presencia de coliformes totales en placas de petrifilmTM en la dilución 10-1.
Figura 2. Análisis negativo para la presencia de coliformes totales en placas de petrifilmTM en la dilución 10-2.

A B C
Figura 3. Análisis muestra de leche en polvo positivo para la presencia de coliformes totales en (A, C), usando la luz UV no se
identificó la presencia de E. coli en Caldo Fluorocult, indol negativo, incubados a 35ºC por 48 horas.
 A B C
Figura 4. Análisis muestra de leche en polvo en Caldo Fluorocult con presencia de coliformes totales en (A, C), indol negativo,
incubados a 35ºC por 48 horas.

FUNDAMENTOS MEDIOS DE CULTIVO

1. Caldo Fluorocult: es una prueba rápida para la detección simultánea de presencia o ausencia de coliformes totales y
Escherichia coli en el agua potable o alimentos. Se suministra como un paquete de medios esterilizados, de un solo uso,
premedidos. Si hay coliformes en la muestra de agua o en el alimento, sus enzimas β-galactosidasas hidrolizan la X-GAL
incolora y el medio de cultivo vira de color transparente a azul verdoso. El 1- isopropil-β-D-1- tiogalactopiranósido (IPTG)
actúa como sustancia intensificadora en la síntesis enzimática y aumenta el contenido de la actividad de β-D-
galactosidasa. Si E. coli está presente entre los coliformes, sus enzimas β-glucuronidasas hidrolizan el sustrato MUG (4-
metilumbeliferil-β-glucurónido) contenido, produciendo fluorescencia azul, que es visible a la luz UV (366 nm). Esta
reacción del MUG no es completamente específica de E. coli. Otras pocas especies de bacterias también pueden hidrolizar
el MUG (mug positivas) y se sabe que ciertas cepas de E. coli son MUG negativas. Puede realizarse directamente una
prueba bioquímica para E. coli en la muestra añadiendo el reactivo indol de KOVAC. El reactivo reacciona con el indol y
muestra un anillo rojo cuando hay E. coli, debido a la capacidad de este microorganismo para producir indol a partir del
aminoácido triptófano. Un resultado positivo demuestra la presencia de E. coli con una certidumbre del 99 % y elimina la
necesidad de etapas de confirmación añadidas que duran de 24 a 48 horas.
 2. Placas Petrifilm para el Recuento de Coliformes (Coliform Count, CC): contienen nutrientes de Bilis Rojo-Violeta,
(VRB), un agente gelificante soluble en agua fría, y un indicador tetrazolium, que facilita el recuento de las colonias. La
película superior atrapa el gas producido por los coliformes fermentadores de lactosa. La AOAC Internacional y el Manual
de Análisis Bacteriológico de la FDA de los Estados Unidos definen los coliformes como colonias de bastoncillos Gram-
negativos que producen ácido y gas durante la fermentación metabólica de la lactosa. Las colonias de coliformes crecen en
la Placa Petrifilm CC y producen un ácido que causa el oscurecimiento del gel por el indicador de pH. El gas atrapado
alrededor de las colonias rojas de coliformes confirma su presencia.

Placas Petrifilm para el recuento de E. coli/Coliformes (EC): contienen nutrientes de Bilis Rojo Violeta (VRB), un agente
gelificante soluble en agua fría, un indicador de actividad de la glucuronidasa y un indicador que facilita la enumeración de las
colonias. La mayoría de las E. coli (cerca del 97%) produce beta-glucuronidasa, la que a su vez produce una precipitación azul
asociada con la colonia. La película superior atrapa el gas producido por E. coli y coliformes fermentadores de lactosa. Cerca del
95% de las E. coli producen gas, representado por colonias entre azules y rojo-azules asociadas con el gas atrapado en la Placa
Petrifilm EC (dentro del diámetro aproximado de una colonia). Las colonias coliformes que crecen en la Placa Petrifilm EC
producen un ácido que causa el oscurecimiento del gel por el indicador de pH. El gas atrapado alrededor de las colonias rojas de
coliformes confirma su presencia.
ANÁLISIS DE RESULTADOS:

Para la determinación de Coliformes y E. coli por el método del número más probable (NMP) para obtener una cantidad estimada
presente en la muestra de leche Klim que se utilizó. Para el desarrollo de este procedimiento se utilizó el caldo Fluorocult más 1ml
de la dilución del alimento, este medio funciona de tal forma en que este posee un sustrato cromogénico (5-bromo-4-cloro-3-
indolil-β-Dgalactopiranocida) el cual, es adherido por los coliformes, produciendo un color azul verdoso en el caldo como se
observa en la figura 4, lo cual indica presencia de coliformes totales; este también posee una enzima β-Dglucoronidasa la cual es
muy específica para E.coli, esta divide el sustrato MUG, produciendo fluorescencia con luz UV, e indicando la presencia de E.coli,
para esta parte del procedimiento no se logró confirmar la presencia de E. coli. Por otra parte, el caldo Fluorocult posee una
prueba confirmativa mediante el uso del verde brillante. Por último, para medir las características metabólicas de E. coli se utilizo
el reactivo de Kovacs para determinar la desaminación reductiva del triptófano mediante el conjunto de triptofanasas,
obteniéndose un halo negativo para la prueba de indol.

Las muestras analizadas poseían coliformes totales, se puede inferir que estos productos cumplen con la norma NTC 1036/02 y el
Dec 616 / 2006, que tolera un nivel máximo de coliformes totales de <3ufc/g. Existen peligros microbiológicos potenciales y
diversos riesgos asociados con el almacenamiento y preparación de los alimentos, la presencia de E. coli en las muestras, nos
indica que el origen de esta contaminación es variable, siendo la manipulación inadecuada la causa más común (Michaine S.,
1994). Para mejorar el proceso se pueden determinar las causas de la contaminación, dar ciertas recomendaciones para que se
establezca la aplicación del sistema de análisis de riesgos y puntos críticos de control (HACCP) y contribuir al establecimiento de
límites recomendados que permitan garantizar a los comensales la calidad sanitaria de los alimentos, con el fin de evitar
problemas de salud pública.
Las bacterias coliformes son capaces de fermentar la lactosa a 35°C con producción de gas, dentro de estas existen dos grupos,
las coliformes fecales que son habitantes del tracto intestinal de animales de sangre caliente y que son indicadores de riesgo de
afecciones humanas y por otro lado esta el grupo de las coliformes que son residentes naturales del suelo y agua (Madigan et al.,
2004; Perdomo et al, 2001). El primer grupo al estar presentes en algún alimento estas representan mala calidad higiénica en el
proceso, falta de higiene de los manipuladores o recontaminación después del proceso (Perdomo et al, 2001). Existen varias
cepas de E. coli, estas contienen enterotoxinas y/o otros factores de virulencia incluyen factores de invasión y colonización,
pueden causar enfermedad diarreica, infecciones en el tracto urinario e infecciones nosocomiales incluyendo septicemia y
meningitis (Jhon, Noel, Peter, James, Stanley, 1997). Es por esto que para la evaluación higiénica de los alimentos crudos o de
productos que no han sido sometidos al tratamiento de inocuidad mediante calor, E. coli es el microorganismo índice más
utilizado, por lo cual para su detección comúnmente se utilizan pruebas para coliformes y de confirmación a través de las pruebas
IMViC (indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato sódico) (ICMSF, 2000).

Otro punto a tener en cuenta son los criterios o límites microbianos que se han seleccionado para los alimentos, en este caso el
proceso que se hace para la obtención de la leche KLIM, donde son el punto de partida para mantener una adecuada calidad
microbiológica segura para el usuario desde un punto de vista de salud pública, sin que esto implique que no se pueda ser más
exigentes, ya que en muchos casos depende del personal de supervisión, que dirige los procesos en la cadena de producción y
servicio. Es por ello que se considera muy importante el establecimiento de límites que permitan garantizar a los usuarios la
calidad sanitaria de los alimentos, con el fin de evitar las enfermedades transmitidas por alimentos, que han constituido
recientemente un problema de salud pública en el ámbito nacional. También es imprescindible que se sigan manteniendo los
controles microbiológicos de la calidad de los alimentos servidos en las empresas y la vigilancia epidemiológica de las ETA.
BIBLIOGRAFÍA:
Maldonado A. & Velázquez M. (2015). Diagnóstico de la situación Actual de procesos productivos en empresas para la
implementación de técnicas orientadas al mejoramiento del proceso (BPM, HACCP, OTROS) [Tesis de grado, Universidad
Nacional Autónoma de Nicaragua]. https://repositorio.unan.edu.ni/6270/1/6297.pdf
Merk. (2021). Medios fluorogenos. Tomado de:
https://www.merckmillipore.com/CO/es/20130913_083824?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
3M. (2017). Petrifilm para coliformes. Tomado de: https://multimedia.3m.com/mws/media/1409677O/guia-interpretacion-petrifilm-
coliformes.pdf
3M Microbiology. (2021). Placas Petrifilm para E. coli/Coliformes. Tomado de: https://multimedia.3m.com/mws/media/444950O/3m-
petrifilm-e-coli-coliform-count-plate-interpretation-guide-spanish.pdf
MERCK. Folletos informativos Fluorocult, LMX.
Tablas de interpretación de resultados de NMP/100 cm³ para Colilert, Tubos de fermentación por diluciones múltiples, LMX y
Fluorocult, para 15 tubos, 9 tubos y 10 tubos.
Holt, Jhon; Krieg, Noel; Sneath, Peter; Staley, James; Williams, Stanley. (1997). Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
Ninth Edition.. Pg 178-181, 224-225, 232-235. USA: Williams and Wilkins Press.
Anexar consultas y fotos tanto del proceso como de los resultados.
(1) El % de proteínas está calculado con base en las proteínas en los sólidos no grasos de la leche.

(2) Las proteínas de la leche en los sólidos no grasos de la leche basadas en la norma Codex Stan 207.
(3) La lactosa residual en sólidos no lácteos de la leche deslactosada es un dato teórico.
 Características bioquímicas del género E. coli.

MC MEDIA PAD para coliformes totales

COLIFORMES – Fácil lectura gracias a las colonias de color azul.
MC-Media Pad® está disponible para la detección de Escherichia Coli, levadura y moho, coliformes ocontaminación microbiana
aerobia total.

VENTAJAS:

• Los MC-Media Pad® están codificados por color para identificarlos fácilmente.
• Fácil de usar: menos pasos de manejo que los métodos tradicionales.
• Es ecológico: reduce el impacto ambiental respecto a las placas preparadas pues reduce el desperdicio.
• Ahorro de espacio en heladera e incubadora respecto a placas preparadas.
• Resultados confiables y rápidos.
• El MC-Media Pad® cumple con los estándares internacionales (AOAC-PTM / ISO 16140 / MicroVal) y tiene un control de
calidad de acuerdo con ISO 11133: 2014.
• Mejora la gestión de inventario con una vida útil de hasta 36 meses. Las placas preparadas duran entre 6 y 9 meses.
• No se requiere dispositivo de propagación (rastrillo)
• Los paquetes abiertos pueden conservarse en la heladera durante un máximo de 4 semanas, entre (2 y 15) °C.
• Se pueden utilizar directamente desde la heladera: no es necesario esperar a que estén a temperatura ambiente.
• Vida útil de hasta 3 años.