EFECTO DE ENALAPRIL SOBRE LA RESTAURACIÓN ERITROPOYÉTICA EN LA ANEMIA MURINA 51

EFFECT OF ENALAPRIL ON ERYTHROPOIESIS RECOVERY IN MURINE ANEMIA

Efecto de Enalapril sobre la restauración

eritropoyética en la anemia murina
Effect of Enalapril on erythropoiesis recovery in murine anemia

VEUTHEY TV, D´ANNA MC, SÁNCHEZ M, GATTI CJ, ROQUE ME.

Autor para la correspondencia: Dr. Marta Elena Roque. E-mail: mroque@uns.edu.ar. Laboratorio de Fisiología
Humana, Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur. San Juan 670 (8000)
Bahía Blanca. Argentina.

RESUMEN
La presencia de receptores de Angiotensina en células eritropoyéticas y estromales medulares muestra claramen-
te un mecanismo de regulación de la eritropoyesis mediado por el Sistema Renina-Angiotensina. El objetivo fue
estudiar los efectos de Inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina (IECA) como Enalapril (E) sobre
la respuesta eritropoyética en ratones anémicos tratados con Fenilhidrazina (FHZ), a través de estudios hemato-
lógicos e histológicos. Tanto los ratones tratados con FHZ como los tratados con E y FHZ mostraron hemólisis el
día 14. Sin embargo, la recuperación del estado anémico fue el día 16 en ratones tratados con FHZ y el día 20 en
ratones tratados con E y FHZ. Se observó actividad eritropoyética en el bazo (día 16) y en el riñón (día 20) de
ratones tratados con E y FHZ. En ratones tratados con FHZ, se observó actividad eritropoyética en bazo y riñón
el día 16. Concluimos que la inhibición de la ECA con Enalapril retarda la recuperación eritropoyética en ratones
tratados con E y FHZ. La actividad eritropoyética en el bazo y riñón sugiere la participación de estos órganos en
la recuperación del eritrón.
PALABRAS CLAVE: Inhibidores de ECA. Anemia. Eritropoyesis. Riñón. Bazo.

ABSTRACT
The presence of Angiotensin receptors in erythropoietic bone marrow and marrow stromal cells clearly shows a mechanism for
Rennin-Angiotensin System-mediated regulation of erythropoiesis. The aim was to study the effects of Angiotensin-Converting
Enzyme inhibition (ACEI) as Enalapril(E) on erythropoietic response in anemic mice treated with Phenylhydrazine (PHZ) by
means of hematological and histological studies. Both PHZ and E-PHZ-treated mice showed hemolysis on day 14. However
the restoration of anemic state occurred on day 16 in PHZ-treated mice and on day 20 in E-PHZ-treated mice. Erythropoietic
activity was observed in spleen (day16) and kidney (day20) of E-PHZ-treated mice. In PHZ-treated mice erythropoietic activity
was seen in spleen and kidney on day 16. We conclude that Inhibition of ACE with Enalapril delays the erythropoietic recovery
of hemolytic anemia in E-PHZ-treated mice. Erythropoietic activity in spleen and kidney suggest an involvement of these
organs in the erythron recovery.
KEY WORDS: ACE inhibitors. Anemia. Erythropoiesis. Kidney. Spleen.

Fecha de recepción: 06-09-2007

Fecha aceptación: 11-03-2008

Ars Pharm 2008; 49 (1): 25-40.

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INTRODUCCIÓN
La eritropoyesis depende de la interacción de
múltiples citoquinas y factores de crecimiento1.
La eritropoyetina (EPO) es el principal factor de
crecimiento que estimula la mitogénesis y dife-
renciación de progenitores eritroides y previene
su apoptosis2. Se han descripto otros factores que
modulan la proliferación eritroide actuando sobre
progenitores eritroides a través de vías directas
o indirectas. Se ha descripto que Angiotensina II
es un factor mitogénico que podría incrementar
los niveles de EPO indirectamente3.
La presencia de receptores para Angiotensina
II en progenitores hemopoyéticos y en células
estromales de médula ósea, sugiere la regulación
de la eritropoyesis mediada por el Sistema Renina
Angiotensina4. Kamper y Nielsen (1990) reportaron
inhibición de la eritropoyesis utilizando drogas
que inhiben la síntesis de Angiotensina II5. Varios
estudios demostraron una respuesta reducida a la
terapia con EPO en pacientes con hemodiálisis
crónica tratados con inhibidores de la Enzima
Convertidora de Angiotensina (IECA)6. El incre-
mento en la apoptosis de células progenitoras y la
disminución en el hematocrito han sido también
asociados a la administración de IECA7. Aunque
el mecanismo de los IECA aún no está claro, se
han propuesto varias hipótesis8,9. Graafland y col.
(1992) reportaron que la inhibición de la ECA podría
causar anemia mediante el incremento del flujo
sanguíneo renal y la disminución de los niveles
de EPO8. Por lo tanto, este mecanismo podría
afectar la respuesta apropiada a la anemia.
Se sabe que Fenilhidrazina (FHZ) es un
agente hemotóxico ampliamente utilizado para
inducir anemia en modelos animales. La acción
de FHZ ha sido asociada al estrés oxidativo
inducido por drogas que tiene lugar dentro de
los eritrocitos10-12. Este proceso conduce a una
aumentada oxidación de la oxihemoglobina a
metahemoglobina, produciendo hemicromos
irreversibles, los cuales a su vez, forman los
cuerpos de Heinz13. Además del daño proteico
y la peroxidación lipídica, otras alteraciones
como depleción de glutatión y ATP, desbalance
catiónico, reducción en la deformabilidad de
la membrana y unión de anticuerpos, han sido
asociadas a la respuesta hemolítica inducida por
drogas oxidantes11,14. Se sabe que la activación
inmune está asociada con la anemia inducida
por Fenilhidrazina en distintas especies, y en
Ars Pharm 2008; 49 (1): 25-40.
VEUTHEY TV, D’ANNA MC, SÁNCHEZ M, GATTI CJ, ROQUE ME
INTRODUCTION
Erythropoiesis depends on interaction of multi-
ple cytokines and growth factors1. Erythropoietin
(EPO) is the main growth factor that stimulates
the mitogenesis and differentiation of erythroid
progenitors and prevents their apoptosis2. It have
been described additional factors that modulate
erythroid proliferation acting through direct or
indirect ways on erythroid progenitors. It has been
described that Angiotensin II is a mitogenic factor
that may indirectly increase EPO levels3.
The presence of Angiotensin II receptors
in hematopoietic progenitors and bone marrow
stromal cells suggest an erythropoiesis Rennin-
Angiotensin System-mediated regulation4. Kamper
& Nielsen (1990) have reported erythropoiesis
inhibition using drugs that prevent Angiotensin
II synthesis5. Several studies have demonstrated
a reduced response to EPO therapy in chronic
hemodialysis patients treated with Angiotensin–
Converting Enzyme Inhibitors (ACEI)6. Increase
in progenitor cells´s apoptosis and decrease in
hematocrit (HCT) have also been associated to
ACEI administration7. Although the ACEI me-
chanism is not yet clear, several hypotheses have
been proposed8,9. Graafland et al. (1992) repor-
ted that ACE inhibition could cause anemia by
increasing renal blood flow and then decreasing
EPO levels8. Therefore, this mechanism may
affect the proper anemia response.
It is well known that Phenylhydrazine (PHZ)
is an hemotoxic agent widely used to induce
anemia in animal models. PHZ action has been
long associated with drug-induced oxidative stress
occurring within erythrocytes10-12. This process
results in enhanced oxidation of oxyhemoglo-
bin to metahemoglobin, leading to irreversible
hemichrome formation which, in turn, produces
Heinz bodies13. In addition to skeletal protein
damage and lipid peroxidation, other alterations
such as glutathione and ATP depletion, cation
imbalance, reduced membrane deformability
and antibody binding, have been associated to
hemolytic response induced by oxidant drugs11,14.
It is well known that the immune activation is
associated with Phenylhydrazine-induced anemia
in different species and in these conditions, the
spleen is the main organ involved in hemolytic
state compensation15-17. It is also known that in
cases of great erythropoietic demands the liver
can assume the hemopoietic function18.
EFECTO DE ENALAPRIL SOBRE LA RESTAURACIÓN ERITROPOYÉTICA EN LA ANEMIA MURINA
EFFECT OF ENALAPRIL ON ERYTHROPOIESIS RECOVERY IN MURINE ANEMIA
estas condiciones el bazo es el principal órgano
involucrado en la compensación del estado hemo-
lítico15-17. También, se conoce que en situaciones
de gran demanda eritropoyética, el hígado puede
asumir la función hemopoyética18.
Por otra parte, los inhibidores de la Enzima
Convertidora de Angiotensina —como Enala-
pril— pueden inducir anemia por un mecanismo
diferente al de Fenilhidrazina. Como la respuesta
eritropoyética extramedular a la anemia hemolítica
en animales tratados con IECA permanece poco
clara, el propósito de este trabajo fue evaluar los
cambios tanto hematológicos como morfológicos
en ratones anémicos con inhibición farmacológica
del eje regulatorio de la eritropoyesis como es
el Sistema Renina-Angiotensina.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales
Los ratones hembra CF1 (44,2±3,7 g) pro-
vienen del Bioterio de la Universidad Nacional
del Sur. Los animales fueron mantenidos en
jaulas —tres por jaula— en una habitación con
temperatura regulada durante 10 días antes del
comienzo del estudio. Durante la experiencia
fueron alimentados con una dieta certificada y
con acceso libre a agua, bajo condiciones están-
dares: período luz-oscuridad de 12 horas en una
habitación con temperatura y humedad regulada.
El uso y cuidado de los animales estuvo acorde
con la American Physiological Society.
Diseño experimental
Los ratones fueron divididos al azar en tres
grupos: a) ratones sin tratar recibieron una dosis
subcutánea de Solución Salina estéril (SS)(0,9%
NaCl) una vez al día (días 0-9) y los días 10 y
12; b) ratones tratados con Fenilhidrazina (FHZ)
recibieron una dosis subcutánea de SS una vez
al día (días 0-9) y una dosis intraperitoneal de
Fenilhidrazina (60mg/kg peso corporal en 0,5 ml
de SS) los días 10 y 12;y c)ratones tratados con
Enalapril (E)-FHZ recibieron una dosis subcu-
tánea de Enalapril (10mg/kg peso corporal) una
vez al día (días 0-9) y una dosis intraperitoneal
de Fenilhidrazina (60mg/kg peso corporal en 0,5
ml de SS)los días 10 y 12.
53
On the other hand, Angiotensin Converting
Enzyme inhibitors —as Enalapril— may induce
anemia by a different mechanism to Phenyl-
hydrazine. Since extramedullar erythropoietic
response to hemolytic anemia in ACEI-treated
animals remains poorly understood, the purpose
of this work was to assess both hematological and
morphological changes in anemic mice with the
pharmacological inhibition of an erythropoietic
regulatory axis, such as the Rennin-Angiotensin
System.
MATERIAL AND METHODS
Animals
Female CF1 mice (44.2 ± 3.7 g) were provided
by the Bioterio of the Universidad Nacional del
Sur. The animals were kept in cages -three per
cage- in a temperature-regulated room for 10
days before the beginning of the study. During
the experience were fed on a certified diet with
free access to water, under standard conditions:
a 12 h light-dark period in a temperature and
humidity regulated room. Use and care of animals
were in accordance with American Physiological
Society.
Experimental Design
Mice were randomly divided into three groups:
a) Untreated mice received a subcutaneous dose
of sterile Saline Solution (SS) (0.9 % NaCl) once
a day (days 0-9), and on days 10 and 12; b)
Phenylhydrazine (PHZ)-treated mice received a
subcutaneous dose of SS once a day (days 0-9)
and an intraperitoneal dose of Phenylhydrazine
(60 mg/Kg of body weight in 0.5 mL of SS),
on days 10 and 12; and c) Enalapril (E)- PHZ
treated mice received a subcutaneous dose of
Enalapril (10 mg/Kg of body weight) once a day
(days 0-9) and an intraperitoneal dose of PHZ,
60 mg/Kg of body weight in 0.5 mL of SS, on
days 10 and 12.
Phenylhydrazine and Enalapril Preparation
A Phenylhydrazine hydrochloride solution
(Sigma Chemical Co.) in 0.1 M potassium
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Preparación de Fenilhidrazina y Enalapril
La solución hidroclorada de Fenilhidrazina
(Sigma Chemical Co.) en 0.1M de buffer fos-
fato de potasio (pH 7,4) se preparó el día 0. La
solución filtrada y esterilizada, se inyectó por
vía intraperitonel los días 10 y 12. Se utilizó
una solución inyectable de Enalapril (Lotrial®,
Roemmers, Argentina) en una concentración de
1,25 mg/ml.
Hematología
El estado anémico y la recuperación eri-
tropoyética se evaluaron utilizando técnicas
hematológicas convencionales: HCT y Hb. Los
ratones fueron anestesiados con halotano para
la recolección sanguínea (n=3). Se obtuvieron
muestras del plexo venoso retro-orbital en tubos
capilares heparinizados (n=3). La morfología
de células sanguíneas y eventuales infecciones
se evaluaron a través de extendidos sanguíneos
coloreados con May Grünwald-Giemsa.
Estudios Histopatológicos
Un subgrupo (n=3) de cada grupo fue euta-
nizado por inhalación de dietil éter (días 0, 10,
12, 14, 16, 18 y 20). Bazo, hígado y riñones
fueron removidos bajo condiciones estériles por
incisión abdominal y separación de las uniones
a los órganos lindantes. Las muestras tisulares
fueron fijadas por inmersión en solución fresca
fijadora (Solución de Formaldehído en buffer
fosfato 4% y solución de Bouin). Una vez que
los tejidos fueron embebidos en parafina, se
obtuvieron secciones de 5 µm de espesor que
fueron coloreadas con hematoxilina y eosina. Los
islotes eritroblásticos esplénicos y renales fueron
semicuantificados mediante el siguiente escore
(campos de 10X): a) 0-5 islotes/10 campos: +;
b) 6-12 islotes/10 campos: ++; c) 13-19 islo-
tes/10 campos: +++; d) > 20 islotes/10 campos:
++++. Los islotes eritroblásticos hepáticos fueron
semicuantificados mediante el siguiente escore
(campos de 10X): a) 0-5 islotes/5 campos: +; b)
6-15 islotes /5 campos: ++; c) 16-50 islotes /5
campos: +++; d) 51-100 islotes /5 campos: ++++;
e) 101-150 islotes /5 campos: +++++.
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VEUTHEY TV, D’ANNA MC, SÁNCHEZ M, GATTI CJ, ROQUE ME
phosphate buffer (pH 7.4) was prepared on
day 0. The filtered and sterile solution was
intraperitoneally injected on days 10 and 12.
An injectable Enalapril solution (Lotrial ® ,
Roemmers, Argentina) in a 1.25 mg/mL con-
centration was used.
Hematology
Anemic state and erythropoietic recovery
were assessed using conventional hematological
methods: HCT, Hb. Mice were anesthetized with
halothane for blood collection (n=3). Samples
from the retro-orbital venous plexus were taken
with heparinized capillary tubes (n=3). Blood cells
morphology and eventual infections were evaluated
by means of blood smears stained according to
the May Grünwald-Giemsa procedure.
Histopathological Studies
A subset (n=3) of each group was euthanized
by diethyl ether inhalation (days 0, 10, 12, 14,
16, 18, and 20). Spleen, liver and kidneys were
removed under sterile conditions by abdominal
incision and separation from their attachments
to the surrounding organs. Tissue samples were
fixed by immersion in fresh fixative solution
(4% phosphate buffered formaldehyde and Bouin
solution). Once the tissues were embedded in
paraffin, 5 µm-thick sections were obtained and
stained with hematoxilin and eosin. Splenic and
renal erythroblastic islands were semiquantified
using the following score (10x fields): a) 0-5
island/10 fields: +; b) 6-12 island/10 fields: ++;
c) 13-19 island/10 fields: +++; d) > 20 island/10
fields: ++++. Hepatic erythroblastic islands were
semiquantified using the following score (10x
fields): a) 0-5 island/5 fields: +; b) 6-15 island/5
fields: ++; c) 16-50 island/5 fields: +++; d) 51-
100 island/5 fields: ++++; e) 101-150 island/5
fields: +++++.
Statistical Analysis
Results were expressed as the mean ± SD.
Statistical differences among different treated
groups their respective control were determined
by means of the Kruskal-Wallis test followed by
EFECTO DE ENALAPRIL SOBRE LA RESTAURACIÓN ERITROPOYÉTICA EN LA ANEMIA MURINA
EFFECT OF ENALAPRIL ON ERYTHROPOIESIS RECOVERY IN MURINE ANEMIA
Análisis estadístico
Los resultados fueron expresados como la
media ± SD. Las diferencias estadísticas entre
los distintos grupos tratados y sus respectivos
controles fueron determinadas mediante el test de
Kruskal-Wallis seguido del test de comparación
múltiple no paramétrico de Nemenyi. El nivel
de significación fue de p<0,05.
RESULTADOS
Hematología
El tratamiento con Enalapril durante 10 días
causó una disminución en los niveles de Hb desde
15,8±0,2 g/dL a 10,4±1,2 g/dL. Estos cambios
se relacionaron directamente con la disminución
en el HCT (desde 45,4±1,6% a 40,6±0,5%). Los
grupos tratados con Solución Salina durante 10
días no mostraron variación de estos parámetros.
El día 14, los ratones tratados con FHZ y los
tratados con E y FHZ mostraron niveles de Hb
menores que 7,4±0,6g/dL y el HCT permaneció
por debajo de 34,3±0,3%.
El día 18 del protocolo experimental, los pa-
rámetros hematológicos evaluados en los ratones
tratados con FHZ fueron: Hb de 15,0±0,8g/dL
y HCT de 48,0±1,0%; mientras que los ratones
tratados con E y FHZ permanecieron con bajos
niveles de Hb (9,4±0,7g/dL)y de HCT (41,0±0,8%).
El día 20, el nivel de Hb de los ratones tratados
con E y FHZ fue de 12,7±0,9g/dL y de HCT
49,5±0,7%. Los parámetros hematológicos de
los ratones no tratados permanecieron sin variar
durante todo el diseño experimental.
Los extendidos sanguíneos del día 12 en los
ratones tratados con FHZ y en los tratados con E
y FHZ mostraron una disminución en el número
de glóbulos rojos y lisis celular moderada, sin
afectarse las poblaciones leucocitarias.
En el día 14, los ratones tratados con FHZ
y los tratados con E y FHZ revelaron una in-
tensa destrucción de glóbulos rojos, abundantes
fragmentos de membrana, sin alteraciones en los
leucocitos. Además, se observó intensa policro-
masia, anisocitosis y poiquilocitosis.
55
the non-parametric multiple comparison Nemenyi’s
test. Significance level was set at P<0.05.
RESULTS
Hematology
Treatment with Enalapril for 10 days caused
a decrease in Hb levels from 15.8±0.2g/dL to
10.4±1.2g/dL. These changes were directly re-
lated to the decrease in HCT (from 45.4±1.6%
to 40.6±0.5%). Groups treated with Saline So-
lution 10 days did not show variation in these
parameters. On day 14, PHZ and E-PHZ-treated
mice showed Hb levels lower than 7.4±0.6g/dL
and HCT remained below 34.3±0.3%.
On day 18 of the experimental protocol,
the assessed hematological parameters of PHZ-
treated mice were Hb: 15.0±0.8g/dL and HCT:
48.0±1.0%; while E-PHZ-treated mice remained
with low levels of Hb (9.4±0.7g/dL) and HCT
(41.0±0.8%). On day 20, Hb level of E-PHZ-trea-
ted mice was 12.7±0.9g/dL and HCT 49.5±0.7%.
The hematological parameters of untreated mice
remained invariable during the whole experi-
mental design.
Blood smears of PHZ- and E-PHZ-treated mice
on day 12 showed a reduction in the number
of red blood cells and moderate cellular lyses,
without affecting leukocytes populations.
On day 14, PHZ- and E-PHZ-treated mice
revealed intense destruction of red blood cells,
plenty of membrane fragments without alterations
in leukocytes. In addition, intense polychromasia,
anisocytosis, and poikilocytosis were observed.
Histopathological Studies
The histological study of the spleen, liver,
and kidney of SS-treated mice showed uniform
cellularity (Fig. 1 A, B, C).
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Estudios Histopatológicos

El estudio histológico del bazo, hígado y

riñón de los ratones tratados con SS, mostró
uniformidad celular (Fig. 1 A, B, C). La obser-
vación macroscópica en ambos grupos de ratones
tratados con FHZ reveló severa esplenomegalia
el día 16. La histología del bazo de los ratones
tratados con E y FHZ reveló excesiva congestión
eritrocítica, expansión de la pulpa roja, presencia
de hemosiderina, macrófagos y abundantes mega-
cariocitos entre los días 14 y 18 (Fig. 2). Estos
cambios llevan a la pérdida en la organización
de la pulpa roja. Los ratones tratados con FHZ
mostraron un comportamiento similar pero entre
los días 12 y 16.

FIGURA 1: Morfología del Bazo, Hígado y Riñón de ratones no tratados. La examinación histológica
muestra uniformidad celular del tejido esplénico(A), hepático (B) y renal(C). PB: pulpa blanca; PR: pulpa
roja; VS: vaso sanguíneo. Los tejidos fueron procesados para H&E de acuerdo a lo descripto en materiales
y métodos. x 100 (A); x 200 (B, C)
FIGURE 1: Morphology of Spleen, Liver and Kidney of untreated mice. Histological examination shows uniform
cellularity of the splenic (A), hepatic (B) and renal tissue (C). WP: white pulp; RP: red pulp; BV: blood vessel.
Tissues were processed for H&E according to described in methods. x 100 (A); x 200 (B, C)

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EFECTO DE ENALAPRIL SOBRE LA RESTAURACIÓN ERITROPOYÉTICA EN LA ANEMIA MURINA 57
EFFECT OF ENALAPRIL ON ERYTHROPOIESIS RECOVERY IN MURINE ANEMIA

Macroscopic observation in both PHZ-treated

mice revealed severe splenomegaly on day 16.
The histology of the spleen in E-PHZ-treated mice
revealed excessive erythrocytic congestion, red
pulp expansion, presence of hemosiderin, macro-
phages, and plenty of megakaryocytes between
days 14 and 18 (Fig. 2). These changes lead to
loss of red pulp organization. PHZ-treated mice
showed a similar behavior but between days 12
and 16.

FIGURE 2: Morfología del Bazo de los ratones tratados con Enalapril- Fenilhidrazina el día 16. El tejido
muestra islotes eritropoyéticos (flecha), congestión eritrocítica, expansión de la pulpa roja, y megacariocitos
(M). Los tejidos fueron procesados para H&E de acuerdo a lo descripto en materiales y métodos. x 400.
FIGURE 2: Morphology of Spleen in Phenylhidrazine-Enalapril-treated mice on day 16. Tissue shows
erythropoietic islands (arrowheads), erythrocitic congestion, red pulp expansion, and megakarocytes (M).
Tissues were processed for H&E according to described in methods. x 400.

El tejido esplénico de los ratones tratados
con E y FHZ mostró reorganización de la pulpa
roja y morfología similar a lo observado en los
ratones no tratados el día 20 (Fig. 3). La his-
tología renal de los ratones tratados con FHZ y
los tratados con E y FHZ reveló la presencia de
islotes eritropoyéticos sin alteraciones evidentes
en el parénquima celular.
The splenic tissue of E-PHZ-treated mice
showed pulp reorganization and cellular morpho-
logy similar to that in untreated mice on day 20
(Fig. 3). Renal histology of both PHZ-treated mice
and E-PHZ-treated mice revealed the presence of
erythropoietic islands without evident alterations
in the cellular parenchyma.

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FIGURE 3: Morfología del Bazo de los ratones tratados con Enalapril-Fenilhidrazina el día 20. El tejido
muestra reorganización de las pulpas, morfología celular normal. PB: pulpa blanca; PR: pulpa roja. Los
tejidos fueron procesados para H&E de acuerdo a lo descripto en materiales y métodos. x 200.
FIGURE 3: Morphology of Spleen in Phenylhidrazine-Enalapril-treated mice on day 20. Tissue shows
pulps reorganization, normal cellular morphology. WP: white pulp; RP: red pulp. Tissues were processed
for H&E according to described in methods. x 200.

La observación histológica del tejido hepático Histological observation of hepatic tissue in

en los ratones tratados con E y FHZ no mostró
presencia de islotes eritropoyéticos durante la
experiencia. Entre los días 16 y 20 se observó
morfología celular alterada con anormalidades
citoplasmáticas y nucleares en los ratones tra-
tados con E y FHZ (Fig. 4), mientras que los
ratones tratados con FHZ mostraron uniformidad
celular.
E-PHZ-treated mice did not show the presence of
erythropoietic islands during the experience. Bet-
ween days 16 and 20 altered cellular morphology
with cytoplasmatic and nuclear abnormalities in
E-PHZ-treated mice was observed (Fig. 4), while
PHZ-treated mice showed uniform cellularity.

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EFECTO DE ENALAPRIL SOBRE LA RESTAURACIÓN ERITROPOYÉTICA EN LA ANEMIA MURINA 59
EFFECT OF ENALAPRIL ON ERYTHROPOIESIS RECOVERY IN MURINE ANEMIA

FIGURE 4: Morfología del Hígado de los ratones tratados con Enalapril-Fenilhidrazina el día 18. El tejido
muestra morfología celular alterada con anormalidades citoplasmáticas y nucleares. VS: vaso sanguíneo. Los
tejidos fueron procesados para H&E de acuerdo a lo descripto en materiales y métodos. x 200.
FIGURE 4: Morphology of Liver in Phenylhidrazine-Enalapril-treated mice on day 18. Tissue shows
altered cellular morphology with cytoplasmatic and nuclear abnormalities. BV: blood vessel. Tissues were
processed for H&E according to described in methods. x 200.

La semicuantificación de los islotes eritro- The semiquantification of erythropoietic is-

poyéticos en el bazo, riñón e hígado se muestra lands in the spleen, kidney and liver is shown
en la Tabla 1. in Table 1.

Ars Pharm 2008; 49 (1): 25-40.

60 VEUTHEY TV, D’ANNA MC, SÁNCHEZ M, GATTI CJ, ROQUE ME

TABLA I. Islotes Eritropoyéticos en Tejido Esplénico, Renal y Hepático. Ratones tratados con E-FHZ
recibieron Enalapril entre los días 0-9 y Fenilhidrazina los días 10 y 12. Ratones tratados con FHZ
recibieron solución salina entre los días 0-9 y FHZ los días 10 y 12. Los islotes eritroblásticos fueron
semicuantificados de acuerdo a lo descripto en materiales y métodos (n=3).
TABLE I. Erythropoietic islands in Splenic, Renal and Hepatic Tissues. E-PHZ treated mice received
Enalapril between days 0-9 and Phenylhydrazine on days 10 and 12. PHZ-treated mice received sterile
saline solution between days 0-9 and PHZ on days 10 and 12. Erythroblastic islands were semiquantified
according to described in methods. (n=3)

Días del Ratones tratados con FHZ Ratones tratados

protocolo (Solución Salina + FHZ) con E-FHZ
Days of PHZ-treated mice (Enalapril + FHZ)
protocol (Saline Solution + PHZ) E-PHZ-treated mice
(Enalapril + PHZ)
Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón
Spleen Kidney Liver Spleen Kidney
0 + + + + +
10 + + + + +
12 ++ ++ + + +
14 ++ ++ + + +
16 ++++ ++ +++ +++ +
18 + ++ + ++ ++
20 + + + ++ +++

Los islotes eritroblásticos esplénicos pre-
sentaron siempre una distribución difusa y se
observaron en los ratones tratados con E y FHZ
principalmente el día 16 (Fig. 2), disminuyendo
hacia el día 20.
El día 20 se evidenciaron abundantes islotes
eritroblásticos renales en los ratones tratados con
E y FHZ (Fig. 5), mientras que en los ratones
tratados con FHZ ocurrieron entre los días 12 y
18. El tejido esplénico de los ratones tratados
con FHZ mostró la mayor actividad eritropoyé-
tica el día 16, volviendo a los valores basales
el día 18.
Splenic erythroblastic islands always presen-
ted a diffuse distribution and were observed in
E-PHZ-treated mice mainly on day 16 (Fig. 2),
decreasing toward day 20.
Abundant renal erythroblastic islands were
evident in E-PHZ-treated mice on day 20 (Fig.
5), while in the PHZ-treated mice were observed
between days 12 and 18. The splenic tissue of
PHZ-treated mice showed the highest erythro-
poietic activity on day 16 and returned to basal
values on day 18.

Ars Pharm 2008; 49 (1): 25-40.

EFECTO DE ENALAPRIL SOBRE LA RESTAURACIÓN ERITROPOYÉTICA EN LA ANEMIA MURINA 61
EFFECT OF ENALAPRIL ON ERYTHROPOIESIS RECOVERY IN MURINE ANEMIA

FIGURA 5: Morfología del Riñón de los ratones tratados con Enalapril-Fenilhidrazina el día 20. El tejido
muestra islotes eritropoyéticos en nódulos discretos (flecha) cerca de un vaso sanguíneo (VS). G: gloméru-
lo. Los tejidos fueron procesados para H&E de acuerdo a lo descripto en materiales y métodos. x 100.
FIGURE 5: Morphology of Kidney in Phenylhidrazine-Enalapril-treated mice on day 20. Tissue shows
erythropoietic islands in discrete nodules (arrowheads) near to blood vessel (BV). G: glomeruli. Tissues
were processed for H&E according to described in methods. x 100.

La semicuantificación de islotes eritroblásticos Hepatic erythroblastic islands semiquan-

hepáticos en ratones tratados con FHZ mostró com-
promiso eritropoyético hacia el día 16, mientras que
en los ratones tratados con E y FHZ no se evidenció
actividad en este tejido.
Los islotes eritropoyéticos del bazo fueron difusos,
sin embargo, los renales se desarrollaron en focos o
nódulos discretos principalmente cerca de los vasos
sanguíneos. En el hígado, la localización de los islotes
celulares fue principalmente sinusoidal.
tification showed erythropoietic compromise
toward day 16 in PHZ-treated mice while in
E-PHZ-treated mice did not evidence activity
in this tissue.
Observation of the spleen showed diffuse
erythropoietic islands; however, renal erythro-
poietic islands developed in discrete nodules or
foci and were observed mainly near to blood
vessels. In liver the localization of cellular
islands were principally sinusoidal.

DISCUSIÓN
Diversos estudios han descripto interrelaciones
entre la eritropoyesis y el Sistema Renina-Angioten-
sina (SRA)4. Haznedaroglu y col. (1996) propusieron
la existencia de un SRA activo en la médula ósea,
que modularía el crecimiento de colonias hemopo-
yéticas19.
La Angiotensina II tiene un importante efecto
proliferativo, probablemente a través de la activación
directa del receptor de Angiotensina I presente en
DISCUSSION
Several studies have described relations
between erythropoiesis and the Rennin-An-
giotensin System (RAS)4. Haznedaroglu et al
(1996) proposed the existence of an active
RAS in the bone marrow that would modulate
the growth of hemopoietic colonies.
Angiotensin II has an important proliferative
effect probably through the direct activation of

Ars Pharm 2008; 49 (1): 25-40.

62
progenitores hemopoyéticos de la médula ósea,
o a través de la estimulación de células estroma-
les para producir factores de crecimiento20. Por
este motivo, la presencia de inhibidores de la
ECA puede reducir los niveles de Angiotensina
II y como consecuencia, disminuir la actividad
eritropoyética.
La disminución en los valores de Hb y HCT
en los ratones tratados con Enalapril sugiere
inhibición de la eritropoyesis. Nuestros resul-
tados coinciden con los reportados por Cole y
col (2000)21.
Por otro lado, se sabe que la Fenilhidrazina
induce anemia hemolítica aguda en ratones22. La
evaluación de los parámetros hematológicos nos
permitió determinar la instauración, evolución y
recuperación de la anemia hemolítica aguda. En
nuestro estudio, los ratones tratados con FHZ
y con E-FHZ mostraron una evidente dismi-
nución en los valores de aquellos parámetros
hematológicos que son críticos para confirmar
la condición anémica. La marcada destrucción
celular, poiquilocitosis y anisocitosis observada
en extendidos de sangre periférica confirman la
acción hemolítica de la Fenilhidrazina.
En nuestro estudio mostramos un evidente
retraso en la restauración de la eritropoyesis en
los ratones tratados con E y FHZ, con respecto
a aquellos tratados solamente con FHZ. Este
cambio en el rango temporal de la respuesta
eritropoyética podría ser atribuido a la acción
del inhibidor de la ECA, el cual reduce los ni-
veles de Angiotensina afectando la producción
de glóbulos rojos.
El rol de tejidos extramedulares en la recupera-
ción hematopoyética murina ha sido ampliamente
descripto17. Los estudios morfológicos realizados,
nos permitieron evaluar el grado de participación
de diversos tejidos extramedulares en la recupe-
ración eritropoyética cuando la actividad de la
ECA esta inhibida.
La marcada congestión eritrocítica esplénica y
la pérdida de la típica organización de la pulpa
observada en los ratones tratados con FHZ y
E-FHZ, sugiere una participación activa de este
tejido en respuesta a la crisis hemolítica.
La presencia de Hemosiderina puede deber-
se a la excesiva eritrofagocitosis, asociada a
la remoción de eritrocitos dañados producidos
durante la hemólisis, como ocurre durante el
tratamiento con FHZ. De acuerdo con otros
autores, el aumento en los depósitos de hierro
Ars Pharm 2008; 49 (1): 25-40.
VEUTHEY TV, D’ANNA MC, SÁNCHEZ M, GATTI CJ, ROQUE ME
Angiotensin I Receptor on hemopoietic progenitor
cells of bone marrow or through the stimulation
of stromal cells to produce growth factors20. For
this reason, the presence of ACE inhibitors may
reduce Angiotensin II levels and consequently
reduce the hemopoietic activity.
The decrease observed in Hb and HCT levels
in Enalapril-treated mice suggests erythropoiesis
inhibition. Our results are in agreement with those
reported by Cole et al (2000)21.
On the other hand, it is well known that
Phenylhydrazine induces acute hemolytic anemia
in mice22. The evaluation of hematological para-
meters allowed to determine the onset, evolution,
and recovery of acute hemolytic anemia. In our
study, PHZ- and E-PHZ-treated mice showed
an evident decrease in those hematological pa-
rameters that are critical to confirm an anemic
condition. The marked cellular destruction and
poikilocytosis and anisocytosis observed in peri-
pheral blood smears confirm the hemolytic action
of Phenylhydrazine.
We showed in our study an evident delay in
erythropoiesis restoration observed in E-PHZ-
treated mice, compared with those treated only
with PHZ. This change in the time range of the
erythropoietic response could be attributed to the
action of ACE inhibitors, which reduces Angio-
tensin II levels affecting red cell production.
The role of extramedullar tissues in hematopoie-
tic recovery in mice has widely been reported17.
Morphological studies performed, allowed us to
assess the degree of extramedullar involvement
of the different tissues in erythropoietic recovery
when the ACE activity was inhibited.
Marked splenic erythrocytic congestion and
loss of pulp typical arrangement observed in
PHZ- and E-PHZ-treated mice suggest an active
participation of this tissue in the response to
hemolytic crisis. The presence of Hemosiderin,
may be the result from excessive erythrophago-
cytosis associated to the removal of altered red
blood cells produced by hemolysis, as it occurs
in the treatment with PHZ. According to other
authors, the increase in iron deposits is commonly
associated to extramedullar erythropoiesis23.
It is known that the increase in splenic macro-
phages occurs as the result of an intense activity
caused by the excessive number of altered blood
cells23. In our study, we observed the presence
of macrophages and megakaryocytes in the
splenic tissue of both groups treated with PHZ
EFECTO DE ENALAPRIL SOBRE LA RESTAURACIÓN ERITROPOYÉTICA EN LA ANEMIA MURINA
EFFECT OF ENALAPRIL ON ERYTHROPOIESIS RECOVERY IN MURINE ANEMIA
está normalmente asociado a la eritropoyesis
extramedular23.
Es sabido que el aumento en los macrófagos
esplénicos ocurre como resultado de la intensa
actividad fagocítica, causada por el excesivo
número de células sanguíneas alteradas23. En
nuestro estudio, observamos la presencia de ma-
crófagos y megacariocitos en el tejido esplénico
de ambos grupos tratados con FHZ, sugiriendo
la participación hemopoyética y eritrofagocítica
de este órgano.
Los cambios en el parénquima celular esplé-
nico asociados a la actividad eritropoyética que
ocurrieron entre los días 12 y 18 en ratones
tratados con FHZ, se relacionan con la semicuan-
tificación de los islotes eritropoyéticos y sugieren
la participación esplénica en la restauración de
la anemia hemolítica17.
En los tejidos hemopoyéticos, las células eri-
troides están ubicadas cerca de los macrófagos
estromales formando los islotes eritroblásticos
por medio de interacciones con moléculas de
adhesión. Estos islotes son considerados unidades
anatómicas que contienen un macrófago central
rodeado por eritroblastos en varios estadios de
maduración24. Además, los islotes eritropoyéticos
pueden ser difusos o pueden desarrollarse en
nódulos discretos23.
La respuesta esplénica en los ratones tratados
con FHZ y con E-FHZ fue similar. Sin embargo,
en los ratones tratados con FHZ, se evidenciaron
cambios morfológicos asociados a la actividad
eritropoyética más tempranos, que los observados
en los ratones tratados con E y FHZ. La reorgani-
zación de las pulpas esplénicas y la disminución
en el número de islotes eritroblásticos en los
ratones tratados con FHZ desde el día 16, indican
una disminución en la actividad eritropoyética
y recuperación de la anemia. A su vez, en los
ratones tratados con E y FHZ, estos cambios se
vieron alrededor del día 20, coincidiendo con el
retardo en la recuperación observada a través de
los parámetros hematológicos.
La disminución de islotes eritropoyéticos re-
nales y la ausencia de cambios en el parénquima
celular observados en los ratones con FHZ, sugiere
poca participación de este tejido y confirma la
restauración de la condición anémica el día 16.
Otra evidencia que surge de nuestros estudios
morfológicos, es el incremento en el número
de islotes eritropoyéticos renales los días 18 y
20 en los ratones tratados con E y FHZ. Los
63
suggesting the hemopoietic and erythrophagocytic
involvement of this organ.
The changes in the splenic cellular parenchy-
ma associated to erythropoietic activity observed
between days 12 and 18 in PHZ-treated mice
are in agreement with the semiquantification of
erythropoietic islands and suggest splenic invol-
vement in hemolytic anemia recovery17.
In hematopoietic tissues, erythroid cells are
closely associated to stromal macrophages for-
ming erythroblastic islands by means of interac-
tions with adhesion molecules. Such islands are
considered anatomic units that contain a central
macrophage surrounded erythroblasts at various
maturation stages24. In addition, erythropoietic
islands may be diffused or may develop in dis-
crete nodules23.
The splenic response in PHZ- and E-PHZ-trea-
ted mice was similar. However, in PHZ-treated
mice the morphological changes associated to
erythropoietic activity were evident earlier than
in those observed in E-PHZ-treated mice. The
reorganization of splenic pulps and the decrease
in the number of erythroblastic islands observed
in PHZ-treated mice since day 16 indicate a
decrease in erythropoietic activity and anemia
recovery. Instead, in E-PHZ-treated mice these
changes were observed around day 20, in coin-
cidence with the delayed recovery observed by
hematological parameters.
The decrease of renal erythropoietic islands
and the absence of cellular parenchyma changes
observed in PHZ-treated mice suggest a poor
involvement of this tissue and confirm the res-
toration of anemic condition on day 16.
Other evidence arising from our morphological
studies is the increase in the number of renal
erythropoietic islands on days 18 and 20 in E-
PHZ-treated mice. The islands observed in this
tissue were located mainly near blood vessels, a
key localization for a quick and effective release
of cells to peripheral circulation. This increase
occurs in simultaneous form with the decrease in
splenic erythropoietic activity. This observation
could suggest a renal erythropoietic contribution
to the recovery post-hemolysis volemia, and would
explain the delay in hematological recovery.
Several authors showed hepatic erythropoiesis
in mice treated with PHZ25,18. Our study shows
the presence of erythropoietic islands in hepatic
tissue of PHZ-treated mice but not in E-PHZ-
treated mice.
Ars Pharm 2008; 49 (1): 25-40.
64
islotes presentes en este tejido se localizaron
principalmente cerca de los vasos sanguíneos,
un sitio clave para una rápida y efectiva libera-
ción de células a la circulación periférica. Este
aumento transcurre en forma simultánea con la
disminución en la actividad eritropoyética es-
plénica. Esta observación podría sugerir que el
tejido renal contribuye en la restauración de la
volemia post-hemólisis, y explicaría el retardo
en la recuperación hematológica.
Varios autores mostraron eritropoyesis hepática
en ratones tratados con FHZ25,16. Nuestro estudio
muestra la presencia islotes eritropoyéticos en el
tejido hepático de ratones tratados con FHZ pero
no en ratones tratados con E y FHZ.
De acuerdo con otros autores que han descripto
que el Enalapril podría inducir alteraciones he-
páticas, en nuestras condiciones experimentales
hubo signos de injuria tisular bajo la examinación
microscópica hepática en los ratones tratados
con E y FHZ26-28. Finalmente, creemos que la
ausencia de islotes eritropoyéticos hepáticos
en este grupo, podría deberse a la injuria en el
parénquima, indicando una carencia de actividad
eritropoyética en este tejido.
Nuestros resultados muestran que bajo las con-
diciones descriptas, la inhibición de la ECA por
Enalapril afectó el rango temporal de respuesta a
la anemia hemolítica aguda inducida por FHZ, y
que cada tejido se comporta en forma diferente
en la recuperación de la volemia post-hemólisis.
En el presente estudio, demostramos que la re-
cuperación eritropoyética depende de la acción
coordinada de varios órganos extramedulares y
confirmamos el rol del bazo en la recuperación
del eritrón. Otros autores han descripto previa-
mente la presencia de actividad eritropoyética en
el tejido esplénico y hepático29,30.
Si bien la participación del tejido renal en la
recuperación hemopoyética de ratones anémicos no
ha sido descripta hasta el presente, es importante
destacar la presencia de islotes eritropoyéticos
en este tejido bajo la inhibición farmacológica
de un eje regulatorio de la eritropoyesis. La
eritropoyesis renal podría ocurrir por migración
de células precursoras desde médula ósea más
que por la activación de células madre.
Nuestro estudio muestra que la inhibición
de la ECA retarda la restauración eritropoyética
de la anemia inducida por FHZ, destacando el
importante rol de la eritropoyesis extramedular
en estos procesos. Sin embargo, estudios futu-
Ars Pharm 2008; 49 (1): 25-40.
VEUTHEY TV, D’ANNA MC, SÁNCHEZ M, GATTI CJ, ROQUE ME
In agreement with other authors that have
described that Enalapril could produce hepatic
alterations, in our experimental conditions, injury
signs were observed upon hepatic microscopic
examination in E-PHZ-treated mice26-28. Finally, we
believe that the absence of hepatic erythropoietic
islands in this group could be due to parenchyma
injury indicating a lack of erythropoietic activity
in this tissue.
Our results show that under the experimental
conditions described, the inhibition of ACE by
Enalapril affected the time range response to
PHZ-induced acute hemolytic anemia and that
each tissue behaves differently in the recovery
of post-hemolysis volemia. In the present stu-
dy, we demonstrated that erythropoietic tissue
recovery depends on the coordinated actions of
several extramedullar organs and we confirmed
the role of the spleen in the recovery of the
erythron. Other authors have previously reported
the presence of erythropoietic activity in splenic
and hepatic tissues29,30.
Although the involvement of renal tissue in
the hemopoietic recovery of anemic mice has not
been described yet, it is important to highlight the
presence of erythropoietic islands in this tissue
under pharmacological inhibition of a regulatory
axis of erythropoiesis. Renal erythropoiesis may
occur by migration of precursor cells from the
bone marrow rather than by activation of stem
cells.
Our study shows that ACE inhibition delays the
erythropoietic restoration of PHZ-induced anemia,
emphasizing the important role of extramedullar
erythropoiesis in these processes. However, further
studies will be necessary in order to explain renal
erythropoietic activity, because the presence of
islands has not been reported yet in kidney in
the studied conditions.
ACKNOWLEDGEMENTS
This research was supported by the Secretaría
General de Ciencia y Tecnología de la Universi-
dad Nacional del Sur (Grant 24/B116) and by the
Agencia de Promoción Científica y Tecnológica
(FONCYT) (Grant-908). Tania Veuthey and Ma-
ría Cecilia D`Anna are Research Fellow of the
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas
y Técnicas (CONICET).
EFECTO DE ENALAPRIL SOBRE LA RESTAURACIÓN ERITROPOYÉTICA EN LA ANEMIA MURINA 65
EFFECT OF ENALAPRIL ON ERYTHROPOIESIS RECOVERY IN MURINE ANEMIA

ros serán necesarios para explicar la actividad

eritropoyética renal dado que la presencia de
islotes aún no ha sido reportada en riñón en las
condiciones estudiadas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue subsidiado por la Secretaría

General de Ciencia y Tecnología de la Univer-
sidad Nacional del Sur (Grant 24/B116) y por la
Agencia de Promoción Científica y Tecnológica
(FONCYT) (Grant-908). Tania Veuthey y Ma-
ría Cecilia D´Anna son becarias doctorales del
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas
y Técnica (CONICET).
This research was supported by the Secretaría
General de Ciencia y Tecnología de la Universi-
dad Nacional del Sur (Grant 24/B116) and by the
Agencia de Promoción Científica y Tecnológica
(FONCYT) (Grant-908). Tania Veuthey and Ma-
ría Cecilia D`Anna are Research Fellow of the
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas
y Técnicas (CONICET).

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