PRACTICA: SISTEMA DEL COMPLEMENTO.

EVIDENCIA DE LA ACTIVIDAD LITICA

Dr. Mario Tapia Barcellandi

GLOSARIO (para efectos de la presente práctica)

 Suero inactivado: Suero en el cual las proteínas del complemento han sido
inactivadas (desnaturalizadas) por calor. Para la inactivación usualmente se incuba
la muestra a 56ºC por 30 minutos. Luego de ese procedimiento no hay actividad
funcional del complemento pero otras moléculas no están afectados como p.e. los
anticuerpos. Para esta práctica se inactivó el suero de una persona del grupo
sanguíneo “O” que siempre tiene anticuerpos naturales contra otros grupos
sanguíneos del sistema ABO.
 Suero normal: Suero de reciente extracción (el mismo día de la práctica) de una
persona del grupo sanguíneo “O”. No se somete al calor. Por ello posee
complemento que puede activarse y anticuerpos anti “A” y anti “B”.
 GR: Suspensión de glóbulos rojos (hematíes) del grupo sanguíneo “A” en
solución salina al 2%.
 Complemento: Es una muestra de suero que contiene proteínas del complemento
sin inactivar. Puede ser suero de origen humano o de origen animal. Para el
ensayo se utilizó suero procedente de cobayos.
 Solución salina: solución de cloruro de sodio al 0.9%. En este caso se suele
utilizar para igualar volúmenes en los tubos.

Activación del complemento 3 vías

https://www.youtube.com/watch?v=OfHridOac2A
7min 15”

Vía clásica
https://www.youtube.com/watch?v=catHtxpbYTY
3min 02”

1
PROCEDIMIENTO
1.- Se rotula tres tubos: 1, 2 y 3.
2.- Se agrega a cada tubo 0.25mL de los siguientes componentes descritos:
Tubo 1: Suero inactivado + GR + Complemento
Tubo 2: Suero normal + GR + Solución salina
Tubo 3: Suero inactivado + GR + Solución salina
3.- Se incuba a 37°C por 30 minutos
4.- Se centrifuga los tubos durante 3 minutos

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Suero Inactivado 0.25 mL 0.25 mL

Suero Normal 0.25 mL
Complemento 0.25 mL
Solución Salina 0.25 mL 0.25 mL
GR "A" 2% 0.25 mL 0.25 mL 0.25 mL

2
 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

PREGUNTAS (4 preguntas)
1.- ¿Qué diferencias encuentra entre los tres tubos del ensayo? ¿Cuál es la
explicación?

2.- Si en el ensayo no se hubiera incubado los tubos a 37°C, habría diferencias?

Vía alterna
https://www.youtube.com/watch?v=FXgthTI19rs
3min 48”

Vía de las lectinas

https://www.youtube.com/watch?v=9w57kCc5Waw
2min 57”

3.- ¿Quienes conforman la C3 y C5 convertasa de las diferentes vías?

4.- ¿Cuáles son los componentes del sistema del complemento que suelen medirse
para evaluar el funcionamiento de todo el sistema?

5.- ¿En qué diferentes situaciones podemos encontrar valores bajos del
complemento?

Canción de la vía clásica

https://www.youtube.com/watch?v=13f2atpp0L8
2min 37”
3
EP DE MEDICINA HUMANA MANUAL DE INMUNOLOGIA GENERAL

ANTICUERPOS ASOCIADOS A UNA

RESPUESTA CRUZADA
Antiestreptolisina O (ASO)

AUTOANTICUERPOS
Factor Reumatoide (FR)

MODULADOR DE LA RESPUESTA INMUNE

Proteina C Reactiva (PCR)
Lic. Esther Valencia Bazalar
Dr. Mario Tapia Barcellandi

La reacción antígeno-anticuerpo es un acoplamiento estructural entre ambas

moléculas. Es una reacción de complementariedad que se da por uniones no
covalentes (como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van Der Walls,
interacciones hidrofóbicas y electrostáticas) entre el antígeno (epítope) y el
anticuerpo (parátope).

La reactividad cruzada se da cuando un anticuerpo (o población de anticuerpos)

se unen a epítopes de otros antígenos. Esto puede ser causado por la baja avidez
o especificidad del anticuerpo o por (múltiples) antígenos distintos que tienen
idénticos o muy similares epítopes.

ANTICUERPOS DIAGNOSTICOS ASOCIADOS A UNA RESPUESTA

CRUZADA
Antiestreptolisina O (ASO):

El estreptococo beta hemolítico del Grupo A, Streptococcus pyogenes, coco

grampositivo es el causante de la faringitis, escarlatina o complicaciones –
inmunes– más serias (como la fiebre reumática y la glomerulonefritis post-
estreptocócica).

En la complicación inmune de la glomerulonefritis post-estreptocócica se

postulan varios mecanismos como responsables del daño inmune contra el
glomérulo:
* Depósito de inmunocomplejos circulantes que contienen componentes
antigénicos del germen.

1
EP DE MEDICINA HUMANA MANUAL DE INMUNOLOGIA GENERAL

* Formación de complejos inmunes in situ resultantes del depósito de

componentes antigénicos del germen en la membrana basal y subsiguiente unión
de anticuerpos.
* Formación de complejos inmunes promovidos por anticuerpos frente a
componentes glomerulares que tienen reacción cruzada con antígenos del
germen (mimetismo molecular).
* Alteración de antígenos renales normales que desencadena reactividad
autoinmune.

La evidencia disponible sugiere que el mecanismo patogénico más importante es

la formación de complejos inmunes in situ debido a depósito de componentes
antigénicos del germen dentro del glomérulo.

Los posibles antígenos nefritógenos del estreptococo beta hemolítico del Grupo
A son: el receptor de plasmina asociado a nefritis (NAPIr), una enzima
glucolítica que tiene actividad gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa y la
exotoxina B pirogénica estreptocócica (SPE B) que es una proteinasa cisteína
catiónica.

Entonces, determinar si el estreptococo beta hemolítico del Grupo A está

causando una patología en una persona afectada es transcendental. Para ello, un
recurso diagnóstico es determinar la presencia de los anticuerpos contra la
estreptolisina O (antiestreptolisina O –ASO–), que se encuentran comúnmente
en casi todas las personas pero a títulos bajos debido a que las infecciones
estreptocócicas son comunes. Sin embargo, un título alto o creciente de ASO,
indica una infección reciente por Streptococcus pyogenes y el consiguiente
peligro de una complicación inmune (que no siempre se da).

La determinación de ASO en títulos altos en una persona contribuye en el

diagnóstico de una enfermedad estreptocócica reciente o alerta sobre el peligro
potencial de generar una complicación inmune en el afectado.

Un método rápido de detección de ASO es mediante el uso de partículas de látex

(aglutinación de látex para ASO) en donde se enfrenta la muestra del paciente
(suero problema) con una suspensión de partículas de látex que tienen adosadas
en su superficie la estreptolisina O. De haber títulos altos de anticuerpos
antiestreptolisina O en el paciente se producirá una reacción de aglutinación
visible macroscópicamente.

Entonces, la determinación de los niveles de ASO nos permiten evidenciar

indirectamente la presencia del estreptococo beta hemolítico del Grupo A que
está relacionado, en algunas personas, al posible riesgo de una complicación
inmune, dejando en claro que no son estos anticuerpos los causantes del

2
EP DE MEDICINA HUMANA MANUAL DE INMUNOLOGIA GENERAL

trastorno inmunológico (son solo diagnósticos) sino que la complicación se debe

a los mecanismos anteriormente planteados.

ASO
https://www.youtube.com/watch?v=VkBacgRbvPw&t=300s
Ver de 0 – 1min 54seg y de 5min 40seg – 9min 32seg

AUTOANTICUERPOS

Factor Reumatoide (FR):

El factor reumatoide (FR) es un conocido biomarcador de autoinmunidad

relacionado con varias enfermedades inflamatorias crónicas, principalmente la
Artritis Reumatoide (AR), aunque también puede verse en el Síndrome de
Sjogren y con menor frecuencia en otras enfermedades.

Se conoce que el factor reumatoide es un anticuerpo, generalmente del tipo IgM,

que está dirigido contra la fracción constante (Fc) de las inmunoglobulinas G
(IgG). Es decir, por alguna causa desconocida, en algunos sujetos la IgM tendría
como blanco sus propias IgG catalogándose como un autoanticuerpo.

Para la determinación del factor reumatoide se empleará la técnica de

aglutinación en látex. Para ello se utiliza una suspensión de partículas de látex,
con inmunoglobulinas G humanas absorbidas en sus superficies, que es
enfrentada a la muestra del paciente (muestra problema). La presencia de
aglutinación macroscópica revela que la reacción es positiva.

Pruebas de laboratorio en reumatologia 3min 28seg

https://www.youtube.com/watch?v=UV6MGb_iO54

FR LÁTEX 4min 15seg

https://www.youtube.com/watch?v=3DSJHfEG81I

MODULADORES DE LA RESPUESTA INMUNE

Proteína C Reactiva (PCR):

La Proteína C reactiva fue descubierta originalmente por Tillett y Francis en

1930 como una substancia, en el suero de pacientes con inflamación aguda, que
reaccionaba con el polisacárido C del neumococo. Inicialmente se pensaba que
la Proteína C reactiva podía ser una secreción patógena (paraproteína) ya que se

3
EP DE MEDICINA HUMANA MANUAL DE INMUNOLOGIA GENERAL

encontraba en cantidad muy elevada en pacientes con diversas enfermedades

entre las que se incluían los carcinomas. El descubrimiento de su síntesis en el
hígado cerró ese debate.

La PCR es producida por el hígado y por las células grasas (adipocitos). Se trata
de un miembro de la clase de reactantes de fase aguda que aumentan los niveles
de manera rápida durante los procesos inflamatorios que ocurren en el cuerpo.
La niveles de PCR se pueden elevar cientos o miles de veces el valor normal,
durante una inflamación aguda (incluidas las infecciones), generalmente dentro
de las seis horas de iniciado el estímulo llegando a sus picos a las 48 horas.

Estudios epidemiológicos sugieren que la inflamación de las placas

ateromatosas, presentes en el endotelio de las arterias coronarias, es un
fenómeno que precede a las anginas e infartos cardiacos o cerebrales. Si la PCR
se eleva marcadamente en los fenómenos inflamatorios sería un claro marcador
de riesgo cardiovascular.

Para la determinación de la PCR se empleará la técnica de aglutinación en látex.

Para ello se utiliza una suspensión de partículas de látex, con anticuerpos contra
la PCR absorbidas en sus superficies, que es enfrentada a la muestra del paciente
(muestra problema). La presencia de aglutinación macroscópica revela que la
reacción es positiva y que los niveles de PCR se encuentran por encima de los
valores normales.

PROTEINA C REACTIVA 10min 59seg

https://www.youtube.com/watch?v=BOJotjrD7EQ

4
EP DE MEDICINA HUMANA MANUAL DE INMUNOLOGIA GENERAL

ENSAYO

Material
 Reactivo de látex ASO
 Reactivo de látex FR
 Reactivo de látex PCR
 Suero control positivo (SCP)
 Suero control negativo (SCN)
 Muestra problema (MP)
 Tarjetas de aglutinación fondo negro
 Mezcladores (mondadientes)
 Cronómetro

Procedimiento
 Colocar una gota del SCP, SCN y MP en cada círculo de la tarjeta
 Homogenizar el reactivo de látex respectivo y agregar una gota a cada círculo
 Mezclar los inmunoreactivos dentro de cada circulo
 Balancear suavemente por 2 minutos (con cronometro) o el tiempo que se
indique para cada prueba.
 Resultado Negativo: suspensión homogénea
 Resultado Positivo: aglutinación

5
P10. Discusión Grupal: Disquisiciones éticas en una opción de
tratamiento para un problema de inmunodeficiencia (VIH) y de la
estrategia comunicacional en Viruela simia

VIH
La transmisión perinatal del VIH se ha reducido considerablemente desde el
descubrimiento de la zidovudina en 1993. Sin embargo, aún no se ha
encontrado un tratamiento factible en los países en desarrollo debido al alto
costo y los estándares médicos necesarios para implementar el protocolo.
Esto presenta una pregunta ética: si se debe usar un placebo o un control
activo para probar nuevos tratamientos.

Los defensores de un control con placebo argumentan que un control con

placebo es el único método que proporciona evidencia definitiva de eficacia y
efectos secundarios, especialmente importantes dados los escasos recursos
financieros presentes en los países en desarrollo. Los críticos, sin embargo,
argumentan que el uso de un estudio controlado con placebo cuando existe
un tratamiento eficaz estaría poniendo en peligro la salud de las personas en
los países en desarrollo.

¿Cuál sería su posición respecto a esta pregunta desde el punto de vista ético
en ensayos clínicos en gestantes en las que se incluya como control un grupo
placebo?
VIRUELA SIMIA
Al 14 de julio del 2022, se habían reportado 11 188 casos confirmados de
viruela símica de 66 países, áreas y territorios a nivel mundial: 80 % en la
Región de Europa, 18 % en la Región de las Américas, 2 % en la Región de
África, <1 % en la Región del Mediterráneo Oriental y <1 % en la Región del
Pacífico Occidental. Se han informado tres (3) muertes en Nigeria y dos (2) en
la República Centroafricana.

En las Américas 1.981 casos confirmados de 15 países. En el Perú a esa fecha

se reportan 112 casos confirmados. En los países la transmisión se viene
dando predominantemente en varones HSH.

El CDC indica que la transmisión de este virus es por: contacto directo con la
erupción infecciosa, costras o fluidos corporales secreciones respiratorias
durante el contacto cara a cara prolongado o durante el contacto físico íntimo,
como besos, caricias o sexo tocar artículos (como ropa o ropa de cama) que
previamente tocaron la erupción infecciosa o los fluidos corporales las
embarazadas pueden transmitir el virus al feto a través de la placenta.
Además, hay nueva información sobre la presencia del virus en diferentes
fluidos.

En este contexto es necesario un mensaje comunicacional apropiado y

pertinente para la población en general evitando la estigmatización de los
grupos de riesgo.

¿Cuál sería su posición respecto al riesgo beneficio de informar a la población

basado la evidencia actual disponible de los mecanismos de transmisión para
orientar las medidas de prevención considerando también la posibilidad de
estigmatización?
Referencias:

1.- Gu S. M. (2006). The ethics of placebo-controlled studies on perinatal HIV

transmission and its treatment in the developing world. Penn bioethics journal,
2(2), 21–24. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17146906/

2.- Peiró-Mestres Aida, Fuertes Irene, et al

Frequent detection of monkeypox virus DNA in saliva, semen, and other clinical
samples from 12 patients, Barcelona, Spain, May to June 2022.
https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-
7917.ES.2022.27.28.2200503
 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA
INFECCIÓN POR VIH

Lic. Pilar Alva Betalleluz

E l virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un virus RNA perteneciente a

la familia retroviridae que se caracteriza por su transmisión sexual, sanguínea
y congénita. Hay dos tipos de virus descritos: VIH-1 y VIH-2, siendo el VIH-1 el más
común.
El tamizaje de los anticuerpos contra VIH tiene por objetivo el diagnóstico de la
infección por este virus; sin embargo dicho diagnóstico no implica necesariamente
el desarrollo clínico del SIDA. A pesar de que los métodos de tamizaje son muy
sensibles, la ausencia de anticuerpos contra el virus no descarta totalmente la
infección viral, ya que en un primer momento va a existir replicación viral sin que
haya expresión serológica de los anticuerpos contra el VIH; esta etapa se denomina
“período de ventana” y puede prolongarse por varias semanas.
Las principales pruebas de tamizaje utilizadas para la detección de anticuerpos
anti-VIH incluyen inmunocromatografía, el ELISA y la Quimioluminiscencia.

HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN POR VIH

PERFIL CELULAR E INMUNOLÓGICO
 MARCADORES DE INFECCIÓN POR VIH

Actualmente existen variadas y excelentes pruebas serológicas por lo cual el

diseño del algoritmo para realizar el diagnóstico de la infección por VIH siempre
debe de seleccionar las pruebas más sensibles para el tamizaje. Por otra parte,
deben de seleccionarse aquellas pruebas más específicas para confirmación del
diagnóstico, las cuales generalmente son realizadas en los Centros de Referencia.

Las técnicas confirmatorias más utilizadas son: Western-Blot, inmunoensayos

lineales (LIA), radioinmunoprecipitación (RIPA) e inmunofluorescencia indirecta.
 En base a las pruebas actuales para tamizaje de VIH el Ministerio de Salud
(MINSA) ha establecido un algoritmo para el diagnóstico de VIH en adultos.

RM N°1024-2020/MINSA (10 de diciembre del 2020)

 PRUEBA DE ELISA

ELISA es un acrónimo de “enzyme-linked immunosorbent assay”. La prueba ha

sido reconocida como una herramienta útil para el inmunodiagnóstico, así como para
estudios seroepidemiológicos. El enzimo inmunoanálisis ha reemplazado a muchas
técnicas tradicionales en el diagnóstico clínico e investigación biológica.
Esta prueba se basa en los fenómenos biológicos: alta especificidad del
anticuerpo por un antígeno y la amplificación por reacciones químicas llevadas a cabo
por enzimas. Por tanto, este procedimiento consiste en una reacción inmunológica y
en una reacción enzimática indicadora para demostrar la presencia o ausencia de
reacciones antígeno-anticuerpo.
La prueba de ELISA es dependiente del hecho que un antígeno o anticuerpo
puede ser inmovilizado en fase sólida, reaccionando posteriormente con el reactivo a
determinar en la muestra problema. A continuación, se añaden anticuerpos marcados
con enzima, y luego se agrega el respectivo sustrato; su hidrólisis, determinada a
simple vista por un cambio de color o por medición de su absorbancia, indicará la
presencia de reacciones antígeno-anticuerpo. Los resultados de la prueba de ELISA
se reportan como Reactivo o No Reactivo.
Interpretación:
 Un resultado NO REACTIVO indica que la muestra analizada no contiene anti-
VIH o que el nivel de anticuerpos anti-VIH está por debajo del límite de
sensibilidad de la prueba.
 Un resultado REACTIVO significa que la muestra probablemente contiene
anticuerpos contra VIH.
VIDEO SABER Diagnóstico serológico del VIH 2min43seg
https://www.youtube.com/watch?v=rlNs7jK08Ks

Pruebas Diagnósticas para la detección de VIH

https://youtu.be/KwzGrIaKZfI

Los cuatro tipos del test de ELISA 5min23seg

https://www.youtube.com/watch?v=5DzP9CLiVPA

Test de ELISA indirecto 3ra generación para diagnóstico de VIH 6min14seg

Hacer la corrección de que es un método sandwich
https://www.youtube.com/watch?v=MZzNQrf6Wtk

Prueba de ELISA Sandwich 4ta generación para diagnostico de VIH 6min26seg

https://www.youtube.com/watch?v=ec1lLQaDAss
 PRUEBAS INMUNOCROMATOGRÁFICAS
La inmunocromatografia es un inmunonsayo en que las reacciones antígeno-
anticuerpo toman lugar en dos puntos sobre una membrana. Las principales ventajas
de la técnica son la rapidez, su fácil ejecución y la necesidad de mínimos
requerimientos de equipamiento. Existen pruebas inmunocromatográficas para
detectar antígenos o anticuerpos o ambos.
La inmunocromatografía para detectar anticuerpos contra VIH se basa en la
migración de una muestra (suero o sangre completa) a través de una membrana de
nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona del conjugado (S) , el cual está
formado por un antígeno VIH marcado con oro coloidal(detector) . Si la muestra
contiene el anticuerpo éste se unirá al conjugado formando un complejo inmune, el
cual migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. De lo contrario, migrarán el
conjugado y la muestra por separado. La zona de captura está formada por un
segundo antígeno VIH . Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por
la unión del antícuerpo (muestra) y conjugado quedarán retenidos y la línea se
coloreará (muestras positivas). En caso contrario las muestras son negativas. La
zona control está formada por un anticuerpo que reconoce al reactivo de detección.
Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al conjugado
libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control de
que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas
y negativas.

Interpretación:
 NEGATIVO: sólo se observa la línea control. (C), indica que la muestra analizada
no contiene anti-VIH o que el nivel de anticuerpos anti-VIH está por debajo del
límite de sensibilidad de la prueba.
 POSITIVO: se observa la línea control (C) y la línea Test (T), significa que la muestra
probablemente contiene anticuerpos contra VIH.



Prueba inmunocromatográfica de VIH 5min13seg

https://youtu.be/z1SXn3kKgR8

 PRUEBA DE WESTERN BLOT

La inmunoelectrotransferencia, immunoblotting o Western Blot es una técnica que

permite detectar o identificar antígenos a partir de una mezcla compleja, pero su
principal aplicación en inmunología clínica es la detección de anticuerpos específicos
para antígenos conocidos.
En la inmunoelectrotransferencia se utilizan geles analíticos, como el gel de
poliacrilamida con SDS (dodecil sulfato de sodio), para separar las proteínas en
función de sus tamaños moleculares. A continuación, el grupo de proteínas separadas
se transfiere del gel separador a una membrana de soporte como la nitrocelulosa, por
acción capilar o por electroforesis, de forma que la membrana adquiere una réplica
del conjunto de macromoléculas separadas presentes en el gel. En la siguiente etapa
se añade la muestra biológica y la detección de anticuerpos se realiza con un
anticuerpo secundario marcado (conjugado).
Interpretación:
La presencia de anticuerpos específicos contra los componentes antigénicos del VIH
revelará un patrón de reactividad compuesto por bandas de precipitación coloreadas
de acuerdo al sustrato cromógeno utilizado en la etapa final (revelado).
La tira de Western blot se deberá interpretar de acuerdo al criterio de la OMS:
 La presencia de 2 bandas de la envoltura (gp42, gp120 o gp160) indicará un
Western blot POSITIVO
 La ausencia de bandas, un resultado NEGATIVO
 Cualquier otro patrón de bandas indicará un resultado INDETERMINADO.
Diagnóstico VIH 9’58” (flujogramas)
https://youtu.be/X8bi0WsT4sM

PRUEBA DE CARGA VIRAL

Prueba rápida de carga viral VIH 2min33seg

https://www.youtube.com/watch?v=TV2UTSLZXhg
 HIV 1/2 Ab PLUS COMBO RAPID TEST

El Ensayo Rápido OnSite HIV Plus Ab Plus es un inmunoensayo de

flujo lateral para la detección y diferenciación simultánea de
anticuerpos de HIV-1 e HIV-2 (IgG, IgM, IgA) en suero humano,
plasma o sangre completa.

 Prueba basada en el doble antígeno de 3ª generación para

aumentar la sensibilidad en la detección temprana
 Requiere sólo 20 μl de muestra
 Utilizar suero, plasma o sangre completa
 Resultados disponibles en un plazo de 15 minutos para
permitir una acción rápida en el punto de atención
 Desempeño validado con BBI low titre panel y Chinese FDA
HIV Ab Panel
 PROCEDIMIENTO

Agregar 20 uL de suero
o plasma

Agregar 2 gotas de
diluyente

Dejar en reposo por

20 minutos y leer

NEGATIVO POSITIVO INVÁLIDO

 HIV Ag/Ab 4TH GEN. RAPID TEST

El Ensayo Rápido de Gen 4 de Gen / Ab de OnSite para el VIH es

un inmunoensayo de flujo lateral para la detección cualitativa de
anticuerpos (IgG, IgM, IgA) a anti-HIV-1 (incluyendo O) y 2 virus y
antígeno p24 de HIV-1 en humanos suero, plasma o sangre
completa.

 Prueba de VIH de cuarta generación para detectar p24

además de IgG e IgM para detección temprana
 Requiere sólo 5 μl de muestra
 Utilizar suero, plasma o sangre completa
 Resultados disponibles en un plazo de 15 minutos para
permitir una acción rápida en el punto de atención
 Desempeño validado con BBI low titre panel y Chinese FDA
HIV Ab Panel
 PROCEDIMIENTO

Dejar en
reposo por 15
minutos y

Agregar una gota de Agregar una gota de

muestra diluyente

NEGATIVO POSITIVO INVÁLIDO