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El producto del gen uncI en el operón de la F1 Fo -ATP
sintasa juega un papel de chaperona para ayudar al
ensamblaje del anillo c
Toshiharu Suzuki*†, Yoko Ozaki†, Nobuhito Sone*, Boris A. Feniouk†, y Masasuke Yoshida*†‡
*Proyecto de Regulación de la Síntesis del ATP, ICORP, Japan Science and Technology Corporation, Aomi 2-41, Tokio 135-0064, Japón; y †Laboratorio de
Recursos Químico s , Tokyo Institute of Technology, Nagatsuta 4259, Yokohama 226-8503, Japón.
Editado por H. Ronald Kaback, Universidad de California, Los Ángeles, CA, y aprobado el 30 de octubre de 2007 (recibido para su revisión el 27 de agosto
de 2007)
Los operones bacterianos para la F1 Fo -ATP sintasa suelen incluir
un gen uncI que codifica una pequeña proteína hidrofóbica de
función desconocida. Cuando expresamos un híbrido F 1 Fo (F1 de
Bacillus PS3 termófilo y Fo de Propionigenium modestum que
transloca Na+) en células de Es- cherchia coli, descubrimos que
uncI derivado de P. modestum era indispensable para producir
una enzima activa; sin uncI, las subunidades c- de F1 Fo existían
como monómeros pero no como anillo c11 funcional. Cuando se
expresó uncI a partir de otro plásmido al mismo tiempo, se
produjo F1 Fo activo con c11 -anillo. Un plásmido que sólo
contenía uncI y el gen de la subunidad c produjo el anillo c11 ,
pero un plásmido que sólo contenía el gen de la subunidad c no
lo hizo. La interacción directa de la proteína UncI con las
subunidades c se sugirió a partir de la copurificación de la
proteína UncI marcada con His y las subunidades c, ambas en el
estado del anillo c11 y de los monómeros c. El Na+ indujo la
disociación de la proteína UncI marcada con His del anillo c11 pero
no de los monómeros c. Estos resultados muestran que UncI es
una proteína tipo chaperona que ayuda al ensamblaje del anillo
c11 a partir de los monómeros c en la membrana.
plegado de proteínas | proteínas de membrana | transporte de Na+
F 1La Fo -ATP sintasa (F1 Fo ) se localiza en las membranas de
las mitocondrias y de los tilacoides de los cloroplastos, y en las
memorias citoplasmáticas de las bacterias, y acopla la
síntesis/hidrólisis de ATP con la translocación transmembrana
de H+ o Na+ (1, 2). El F1 Fo está compuesto por dos dominios, el
F1 soluble en agua que tiene sitios de unión de nucleótidos para
la síntesis/hidrólisis de ATP, y el Fo integral de membrana que
media la translocación de H+ a través de la membrana. En el
caso del F1 Fo bacteriano más simple, las composiciones de las
subunidades del F1 y Fo son α 3 β 3 γ 6s y a1 b2 c10–15 ,
respectivamente. En Fo , la
La subunidad c adopta una estructura simple en forma de
horquilla compuesta por dos
hélices transmembrana (3), y las subunidades c multiméricas se
ensamblan en una arquitectura de anillo (c-ring), donde el
número de subunidades c difiere en un rango de 10 -15
dependiendo de las fuentes (4 -7). F1 Fo es una enzima motora
rotativa en la que un rotor compuesto por γsc10–15
gira con respecto a una fracción del estator de α 3 β 3 6ab2 (8, 9).
Cuesta abajo
El flujo de H+ a través de Fo impulsa la rotación del anillo c y, por
tanto, de todo el rotor, lo que induce cambios conformacionales
secuenciales de los sitios catalíticos del dominio F1 que dan lugar
a la síntesis de ATP (10). En
la reacción inversa, la hidrólisis de ATP en el dominio F1 impulsa
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sintetizada por transcripción-traducción in vitro a partir de un
plásmido que contiene el operón unc completo (17). Los autores
especularon que debía ser una ''proteína piloto'' necesaria para
el ensamblaje de F1 Fo . Análisis posteriores confirmaron que el
promotor de unc está situado delante de uncI (18, 19) y, por
tanto, uncI es efectivamente un miembro del operón unc. Sin
embargo, la proteína del producto del gen uncI (UncI) no se
encontró en las células de E. coli en condiciones normales de
crecimiento, y la interrupción del gen uncI mediante inserciones
(20) o deleciones (21) no causó ningún efecto significativo en
las funciones de F1 Fo , aunque el rendimiento del crecimiento
disminuyó. La proteína UncI se detectó posteriormente en
minicélulas de E. coli mediante el uso de vectores de expresión
fuertes (19, 22). El análisis de inmunoblot utilizando un
anticuerpo anti-UncI reveló la presencia de UncI en
preparaciones de Fo y F1 Fo , aunque las cantidades eran muy
inferiores al nivel estequiométrico (23, 24). En consonancia con
su alta hidrofobicidad predicha a partir de la secuencia de
nucleótidos, UncI se purificó mediante extracción con
cloroformo/metanol (22). A pesar de la información acumulada
sobre UncI, su función sigue sin estar clara.
Aunque la F1 Fo de la mayoría de los organismos es una
bomba de H+ altamente específica, en algunas bacterias como P.
modestum, funciona con Na+ (25). En un intento de hacer un
híbrido F F1o (F1 de Bacillus PS3 y Fo de P. modestum) en células
de E. coli, encontramos el papel esencial de uncI para producir el
híbrido activo F1 Fo . Los resultados muestran que UncI es una
proteína similar a una chaperona molecular que ayuda al
ensamblaje del anillo c.
Resultados
El híbrido F1 Fo se expresó en E. coli. Tanto P. modestum como el
Bacillus PS3 termófilo tienen un operón unc bacteriano típico
con nueve genes en el orden de uncIBEFHAGDC (26, 27). El
híbrido F F1o , compuesto por Bacillus PS3 F1 y P. modestum Fo ,
se generó conectando P. modestum uncIBEF' y Bacillus PS3
uncF'HAGDC. En el F F1o s bacteriano, la subunidad b tiene cuatro
dominios: transmembrana, anclaje, dimerización y unió n a 6
(28). La conexión genética para generar el híbrido F 1 Fo se
realizó en la región que codifica el dominio de dimerización
(posición 73-74;
P. modestum) porque se ha supuesto que esta región no tiene
interacción con otras subunidades. Un F1 Fo -deficiente E.
la rotación del
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.070807510
5
coli JM103Δuncimpulsa
se transformó
subunidad γ y,con
por un pTR-hF
tanto, (+i)
1 Fo completo,
un rotor , un que vector de expresión para el híbrido F1 Fo . Análisis SDS/PAGE
bombeo de H+ a través de la membrana en el dominio Fo . mostraron la expresión de F1 Fo en la fracción de membrana del
huésped
E. coli (Fig. 1A, carril 2). El F F expresado [denominado
Estructuralmente
1o
Los estudios revelaron arquitecturas tipo rueda dentada del
anillo c14 del cloroplasto (7) y del anillo c11 de Ilyobactor tartaricus hF1 Fo (+i) de aquí en adelante] tiene una etiqueta de histidina en
(11). En I. tartaricus y Propionigenium modestum F1 Fo s, el anillo el extremo N de la subunidad β y, por lo tanto, pudo ser
purificada hasta la homogeneidad mediante cromatografía de
c11 es muy estable (incluso en solución SDS), y es necesario un
afinidad con ácido Ni-nitrilotriacético (Ni-NTA) después de la
fuerte ácido desnaturalizante, el ácido tricloroacético, para
solubilización con Tritón X-100 (Fig. 1 A, carril 1, y B, carril 9).
romper el anillo (12, 13). Aunque la estructura del anillo c11 es La secuenciación N-terminal de las bandas en el gel confirmó la
muy estable, no puede romperse espontáneamente.
formado por monómeros de la subunidad c; cuando P. modestum uncE
(que codifica la subunidad c) se expresó únicamente en células Contribuciones de los autores: T.S. y M.Y. diseñaron la investigación; T.S., Y.O., N.S. y
de Escherichia coli, no se formó el anillo c11 (14). B.A.F. realizaron la investigación; T.S. analizó los datos; y T.S. y M.Y. escribieron el artículo.
En 1981, Gay y Walker (15, 16) determinaron la estructura de Los autores declaran no tener ningún conflicto
E. coli unc operón para F1 Fo que contenía nueve marcos de de intereses. Este artículo es una
lectura abiertos (uncIBEFHAGDC) en los que uncB, E, F, H, A, presentación directa de PNAS.
G, D y C codifican las subunidades a-, c-, b-, 6-, α-, γ-, β- y s, ‡A quien debe dirigirse la correspondencia es a: Chemical Resouces Laboratories, Tokyo
respectivamente. El uncI codifica una proteína hidrofóbica de Institute of Technology, Nagatsuta 4259, Yokohama 226-8503, Japón. Correo electrónico:
14 kDa que no es un componente de F1 Fo , posiblemente myoshida@ res.titech.ac.jp.
correspondiente al 2007 por la Academia Nacional de Ciencias de EE.UU.

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5
 A 1 2345678 B A hF o F1 (+i) TFo F1 BhFo F1 (+i) TFo F1
9 10 11 ATPFCCP ATP FCCP ATPFCCPATP FCCP
c1 c1
2,5mM Na+
1 1 1mM 5mM Na+
B. Na+
  Na+
Na+
a a Na+

  5
Na+
5 2 minutos
Ningu
no 5mM 5mM Na+
b b minut Ninguno minut
10%de ACMA

K+
2 min 10%

Ninguno
  1mM Na + 2
deACMA

os 2
minut 5mM K+
os minut
os os
+
5% 20%
ACMA ACMA Ningun
c c 1mM K+ o 1mM 10% ACMA 10% ACMA
K
1 1
C 90 hF o F1 (+i) 90
TFo F1 hFo F1 (+i) TFo F1
D
C DE ATP ATP

ATP
Fluorescencia
80

ATP
ATPFCCP

del verde de
hFo F1 (-i) hFo F1 (- hFo F1 (-i) hFo F1 (- -DCCD Luz
90
90 i)(+I) 80 (100%)
i)(+I)

sodio [-]
-Mo
ATP ATP 2min
+DCCD
hFo F1 (- -DCCD 70 70 +Mo
ATP

ATP

80
FL de Sodio Verde

80
NADH NADH
i) hFo F1 -Mo +Mo
+Mo 60
NADH NADH
600 1000 2000 0 1000 2000 -Pi -Pi
(+i) 70
70 +DCCD de bombeo de H+ al añadir ATP en ausencia de Na+, pero no en
3 minutos -Mo presencia de 1 mM de NaCl (Fig. 2 A, Izquierda). El KCl a 1 mM no
-Pi tuvo ningún efecto. La valoración del Na+
10% 600 1000 2000 1000 2000 -Pi
ACMA +Mo -Mo
Tiempo [seg]
l
hFo F1 (- 60 50% ight §Enun informe de P. modestum F1Fo (12), se observó una banda de anillo c11 en
i)(+I) 500 1500 2500
2min SDS/PAGE justo debajo de la subunidad β, no por encima de la subunidad α como se observa
aquí. La diferencia es resultado del gel utilizado. En este trabajo utilizamos geles de
Fig. 1. Ensamblaje del anillo c11 en el híbrido F1 Fo asistido por uncI gradiente (poliacrilamida al 10-20%). Cuando se utilizaron geles con una concentración
expresado en otro plásmido y actividades del híbrido F 1 Fo así realizado. constante de poliacrilamida, la banda se observó por debajo de la subunidad β.
Las fracciones de membrana preparadas a partir de células E. coli que
expresan los plásmidos indicados (A) y los híbridos F1 Fo s purificados (B) se
sometieron a SDS/PAGE y se tiñeron con CBB (A, carriles 1- 4, y B) o se
tiñeron con anticuerpos anti-subunidad c (A, carriles 5- 8). Carriles 1, 5 y
9 , hF purificada1 Fo (+i) como referencia. Carriles 2 y 6 ,
pTR-hF F1o (+i). Carriles 3 y 7, pTR-hF F1o (-i). Carriles 4 y 8, pTR-hF F1o (-i) ±
pST-I.
Carril 10, hF F1o (-i). Carril 11, hF F1o (-i)(+I). (A) Se aplicaron proteínas de
membrana (7 µ g) en cada carril de los geles. (C) Actividades de bombeo
de H+ de PLs que contienen híbridos F1 Fo s, hF1 Fo (+i), hF1 Fo (-i), o hF1 Fo (-
i)(+I). (D) Actividad de bombeo de Na+ de las PL que contienen hF F (-i) y hF
1o
F1o (-i)(+I). (E) Actividad de síntesis de ATP de vesículas de membrana que
contienen hF F 1o (-i) y hF1 Fo (-i)(+I) . (C-E) Las condiciones experimentales
fueron las mismas que en la Fig. 2. El 50% de la luz en E corresponde a la
mitad de la intensidad de luminiscencia inicial en la cubeta antes de la
adición de NADH.

BIOQUÍMICA
expresión de todas las subunidades F1 Fo excepto la subunidad a.
La banda de la subunidad a se identificó mediante un análisis de
inmunoblot utilizando un anticuerpo anti-a (datos no
mostrados) debido a la dificultad de la secuenciación N-terminal
de la subunidad a. Como se informó para P. modestum Fo § (12),
se observó una banda de alta masa molecular (≈60 kDa) por
encima de la banda de la subunidad α (indicada por c11 y una
punta de flecha en la figura). La secuenciación N-terminal dio
una secuencia de la subunidad c, y la banda desapareció tratando
la muestra con ácido triclo- roacético antes de la electroforesis
(datos no mostrados), confirmando que esta banda
correspondía al anillo c11 como en el caso de
P. modestum F1 Fo .

El híbrido F1 Fo puede utilizar el Na+ como ion de acoplamiento.

Examinamos las actividades de hF F1o (+i) en las vesículas de
membrana preparadas a partir de células E. coli expresivas (Fig.
2 A y D) y en los proteolipo-somas (PLs) (Fig. 2 B y C). Las
actividades de Bacillus PS3 F1 Fo (TF1 Fo ) se mostraron como
referencias (Fig. 2 A-D, derecha). El hF F1o (+i) mostró actividad
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 Tiempo [seg]

Fig. 2. Actividades del híbrido F F1o (izquierda) en comparación con TF 1

Fo (derecha). (A) Actividad de bombeo de H+ de vesículas de membrana
de E. coli invertidas que contienen el híbrido F F1o [hF1 Fo (+i)] y TF1 Fo . Se
añadió NaCl o KCl a la mezcla de ensayo en las concentraciones indicadas.
La reacción se inició añadiendo 1 mM de K+-ATP y se terminó con FCCP.
El %ACMA muestra la intensidad fluorescente del ACMA, en la que la
intensidad inicial antes de la adición de ATP se calibra como el 100%. (B)
Actividad de bombeo de H+ de las PL que contienen hF1 Fo (+i) y TF1 Fo . Las
condiciones de ensayo fueron las mismas que en A. (C) Actividad de
bombeo de Na+ de las PL que contienen hF F1o (+i) y TF1 Fo . Como se
indica, los PLs reaccionaron con 50 µ M de DCCD durante 1h y se utilizaron
para la medición. La reacción se inició con la adición de 1,3 mM de Na+2 -
ATP, y el aumento de la concentración de Na+ en el interior de los PLs se
monitorizó con un aumento de la fluorescencia verde del sodio a 540 nm. (D)
Actividad de síntesis de ATP de vesículas de membrana que contienen hF1
Fo (+i) y TF1 Fo . El potencial electroquímico de H+ fue generado por
bombas respiratorias de H+ en las vesículas de membrana impulsadas por
la oxidación de NADH. La síntesis de ATP se monitorizó en tiempo real a
35°C mediante la reacción de la luciferasa a 560 nm. Como se indica, se
añadió un antiportador de Na+/H+, monensina (5 µ M), para convertir una
parte del gradiente de H+ en gradiente de Na+. Las trazas indicadas con
''-Pi'' representan controles negativos sin adición de P i . La luz (100%) en D
corresponde a la intensidad de luminiscencia inicial en la cubeta antes de
la adición de NADH.

indicó que aproximadamente la mitad de la actividad de

bombeo de H+ fue bloqueada por el suplemento de 0,2 mM de
NaCl. La inhibición del bombeo de H+ por el Na+ también se
observó para la hF purificada1 Fo (+i) en las PL (Fig. 2B,
izquierda). La aparente inhibición del bombeo de H+ podría
explicarse por el aumento del bombeo de Na+ a medida que el
Na+ está disponible. La actividad de bombeo de H+ de TF 1 Fo ,
por el contrario, no se vio afectada por la presencia de NaCl y
KCl (Fig. 2 A y B, Derecha). La actividad de bombeo de Na+ se
midió directamente con un colorante fluorescente indicador de
Na+, el verde de sodio (Fig. 2C). En presencia de 2,6 mM de
NaCl, hF1 Fo (+i) bombeó Na+ tras la adición de ATP, y esta
actividad se perdió totalmente por incubación previa con
diciclohexilcarbodiimida (DCCD) (Fig. 2C, Izquierda). Dicha
actividad de bombeo de Na+ no se observó en las PL de TF 1
Fo (Fig. 2C, Derecha). Cuando el potencial electroquímico de
H+ fue generado por bombas respiratorias de protones
alimentadas por NADH, hF1 Fo (+i) en las vesículas de la
membrana sintetizaron ATP (Fig. 2D, Izquierda). Las vesículas
mostraron una actividad de síntesis de ATP de
3,4 miliunidades/mg de proteína de membrana en presencia de
2,5 mM de NaCl (sólo fuera de las vesículas). La actividad se
multiplicó por 2,1 mediante la adición de un antiportador de
Na+/H+, la monensina (5 µM), que intercambió H+ en el interior
de la vesícula y Na+ en el exterior, transformando una
magnitud significativa de ΔpH en ΔpNa (Fig. 2D, izquierda).
Las vesículas que contenían TF1 Fo sintetizaron ATP a una tasa
de 17,6 miliunidades/mg de proteínas de membrana, y esta
actividad disminuyó a ≈60% por la monensina,
probablemente debido a la disminución

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en ΔpH (Fig. 2D, derecha). La actividad de hidrólisis de ATP de
hF1 Fo (+i) en PLs fue de 1,2 unidades/mg de F1 Fo en ausencia de c11
Na+. Esta actividad se multiplicó por 4 con la adición de 5 mM
de NaCl (valor aparente de Km para Na+ = 0,7 mM a 42°C),

como se ha informado (12, 29). Estos resultados sugieren que 
hF1 Fo (+i) es muy similar a la auténtica P. modestum F1 Fo en su
dependencia del Na+ (29, 30). 
uncI es necesario para la formación del anillo c11 en el híbrido F1 Fo .
a
Para determinar la función de uncI, eliminamos el gen uncI del 
plásmido pTR-hF1 Fo (+i) y generamos un plásmido de expresión b
pTR- hF1 Fo (-i). Además, generamos un plásmido de expresión
pST-I que contenía únicamente el gen uncI. Las fracciones de

membrana de las células E. coli transformadas por pTR-hF F1o
(+i)
, por pTR-hF F1o (-i), y por pTR- hF1 Fo (-i) ± pST-I se c1
analizaron con SDS/PAGE (Fig. 1 A). Todas ellas produjeron F
F1o s como se demostró por la aparición de las bandas de las Fig. 3. c11 -formación de anillos asistida por uncI sin participación de otras
subunidades α- y β en el SDS/PAGE de las fracciones de membrana subunidades de F1 Fo . SDS/PAGE de fracciones de membrana preparadas a
(carriles 2- 4). El análisis de inmunoblot con anticuerpos anti-c partir de células que ex- presan pTR-IHis c (carril 2), pTR-c (carril 3) y pTR-c
+ pST-IHis (carril 4). Carril 1, hF purificada1 Fo (+i) como referencia. Las
reveló que el anillo c11 estaba presente en las fracciones de
proteínas de membrana (7 µ g) se aplicaron a
membrana de las células que expresaban pTR-hF F1o (+i) (carril
6) y pTR-hF1 Fo (-i) + pST-I (carril 8) pero no en las de las
células
(carril
que c 7), expresaban pTR-hF F (-i)
quemientras 1 en cada
carril de los geles. Las bandas de c11 -anillo y c-monómero se indican con
-monómero existía en todos los casos. Los etiqueta His en el extremo C, y pTR-IHis c para la expresión de la
híbridos F F1o s se purificaron hasta la homogeneidad y se proteína UncIHis y la subunidad c (Fig. 3). Las fracciones de
analizaron con SDS/ PAGE. En el análisis SDS/PAGE (Fig. 1B), la membrana de las células que expresan pTR-IHis c contenían el
banda de la subunidad c apareció en la posición del monómero anillo c11 (carril 2), mientras que las de las células que albergan
en el caso del F1 Fo producido a partir de pTR-hF1 Fo (-i) pTR-c no contenían el anillo c11 (carril 3). La banda del monómero
[denominado hF1 Fo (-i)] (carril 10) pero en la posición del anillo c también era débil en el carril 3. Parece que en ausencia de
c11 en hF1 Fo (+i) (carril 9) y en F1 Fo producido a partir de pTR- interacciones con UncI y otras subunidades de F1 Fo ,
hF1 Fo (-i) ± pST-I [denominado hF1 Fo (-i)(+I)] (carril 11). Dado
que los F F1o s tenían una etiqueta de histidina en los extremos N
de las subunidades β y se purificaron mediante cromatografía
de afinidad con Ni-NTA, las subunidades c que se presentan
como un monómero en SDS/PAGE deberían ser componentes
del hF1 Fo (-i). Aunque no se sabe si estas subunidades c existen
como monómeros o como oligómeros vagamente asociados en
hF F1o (-i), en adelante las llamaremos "monómeros" para
simplificar. La comparación del análisis de inmunoblot (Fig. 1 A,
carriles 6 y 8) con la tinción de proteínas del F F1o s purificado
(Fig. 1B, carriles 9 y 11) sugirió que los monómeros c en las
fracciones de membrana de las células que expresan pTR-hF1 Fo
(+i)
y las que expresan pTR- hF1 Fo (-i) + pST-I estarían libres, lo
que indica que no se incorporaron al complejo F1 Fo y se
eliminaron durante los procedimientos de purificación. Se
observó que hF F1o (-i) perdió una cantidad significativa de
subunidad a (Fig. 1B, carril 10). Estos resultados indican
claramente que uncI, ya sea en el mismo operón unc o en un
transcrito diferente, es necesario para el ensamblaje del anillo
c11 . Cabe señalar que el ADN genómico de la cepa JM103Δunc
carece de todos los genes estructurales de F1 Fo pero tiene un
gen uncI propio. Sin embargo, de los resultados descritos
anteriormente se desprende que el gen uncI de E. coli no puede
complementar el gen uncI de P. modestum.

El híbrido F F1o que no contiene el anillo c11 es inactivo. Los F F1o

s purificados se incorporaron a liposomas y se midieron las
actividades. hF1 Fo (-i) fue inactivo en el bombeo de H+ (Fig. 1C),
el bombeo de Na+ (Fig. 1D) y la síntesis de ATP (Fig. 1E). Por el
contrario, hF1 Fo (-i)(+I) mostró buenas actividades en todas las
mediciones. De hecho, su actividad de bombeo de H+ fue mayor
que la de hF F1o (+i) (Fig. 1C). La actividad de bombeo de Na+ de
hF F1o (-i)(+I) fue sensible a la inactivación de DCCD, y la síntesis
de ATP fue activada hasta 5,1 miliunidades/mg de proteínas de
membrana por monensina (Fig. 1 D y E).

UncI puede ayudar al ensamblaje del anillo c11

independientemente de otras subunidades de F1 Fo . Se hicieron
tres tipos de plásmidos: pTR-c para la expresión de la subunidad
c, pST-IHis para la expresión de la proteína UncIHis con una
20778 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0708075105 Suzuki et al.
puntas de flecha. Cabe señalar que la expresión de UncI a partir de pST-
IHis es más débil que la de pTR-I His c debido a un promotor de
transcripción más débil.

La subunidad c recién sintetizada es inestable. Como se

esperaba a partir del resultado de hF1 Fo (-i)(+I), se formó c11 -
anillo incluso cuando un gen para la subunidad c y el gen uncI
estaban en plásmidos diferentes (pTR-c y pST-IHis ), aunque la
cantidad fue relativamente pequeña (carril 4). Estos resultados
sugieren que la proteína UncI puede ayudar al ensamblaje de los
monómeros c en el anillo c11 sin la participación de otras
subunidades de F1 Fo .

La proteína UncI interactúa directamente con la subunidad c.

Los resultados anteriores sugieren una posibilidad de
interacción de la proteína UncI con la subunidad c.
Las células de E. coli que expresan pTR-IHis c contenían c11 -
anillo (Fig. 4A, carril 2) como se muestra arriba, que fue
solubilizado por Tritón X-100 (Fig. 4 A, carril 3). Las proteínas
solubilizadas se aplicaron a una columna de Ni-NTA y, tras
lavar la columna, las proteínas retenidas en ella se eluyeron con
el tampón de alto contenido en imidazol. El eluido contenía
varias bandas de proteínas en SDS/PAGE (Fig. 4 A, carril 4). A
partir de la secuenciación de aminoácidos N-terminal, se
identificó una banda de proteína de 15-kDa como UncIHis y dos
bandas por debajo de ella como productos proteolizados de
UncIHis . Las bandas de ≈60 kDa y de 7 kDa dieron la
secuencia de la subunidad c, y el tratamiento con ácido
tricloroacético al 10% convirtió la banda de ≈60 kDa en la
de 7 kDa (Fig. 4 A, carril 5). Por lo tanto, correspondían
ciertamente a c11 -anillo y c-monómero. El hecho de que el anillo
c11 y el monómero c se copurificaran con UncIHis corrobora la
interacción directa entre UncI y la subunidad c, ya sea en el
estado de anillo c11 o de monómero c. UncI ayuda al ensamblaje
del anillo de las subunidades c a través de una interacción
directa proteína-proteína.

El Na+ induce la disociación de UncI del anillo c11 . En este

trabajo, todos los procedimientos experimentales, a menos que
se indique lo contrario, se llevaron a cabo en condiciones en las
que se omitió estrictamente el Na+. Para conocer el efecto del
Na+ en la interacción UncI-c-subunidad, la columna Ni-NTA, en
la que se cargaron proteínas de membrana solubilizadas con
Triton X-100 procedentes de células que expresaban pTR-IHis c,
se lavó con un tampón de lavado que contenía Na+. A
continuación, las pro- teínas se eluyeron con el tampón de alto
contenido en imidazol, y el eluido se analizó directamente por
SDS/PAGE con tinción de plata. Como se observa, el eluído
contenía sólo el monómero c (Fig. 4B, carril 7), lo que indica que
el anillo c11 ya había sido eliminado de la columna durante el
lavado con el tampón de lavado que contiene Na+. En un
experimento de control en el que la columna se lavó con un
tampón de lavado (sin Na+), el eluido contenía c11 -anillo y c-
monómero (Fig. 4B, carril 6 ), como se observó en el anterior

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 A1 2 3 4 5B 67 C UncI
nc11
c1 8 9 10 11
1
c1 c11  Otros
1 Otras
 
 2UncIa
a 

UncIHis b H+
 
compendios
c1 c1
c1
Fig. 4. Asociación de la proteína UncI con la subunidad c y liberación del
anillo c11 de UncI por Na+. (A) Análisis SDS/PAGE de los componentes
unidos a UncI His . Carril 1, hF1 Fo (+i). Las fracciones de membrana de las
células que expresan pTR-IHis c (carril 2) se solubilizaron con Tritón X-100.
Las proteínas solubilizadas se aislaron por ultracentrifugación (carril 3) y
se cargaron en una columna Ni-NTA. Después de lavar la columna, se
eluyeron las proteínas (carril 4), y el eluido se trató además con ácido
tricloroacético al 10% (carril 5). Todos los tampones no contenían Na+.
nc11 , agregado c11 -anillo; 2UncI His , dímero UncI His ; digeridos, productos
proteolíticos de UncIHis . Las proteínas en el gel se tiñeron con azul brillante
de Coomassie (CBB). (B) Efecto del Na+ en la interacción entre UncI His y la
subunidad c. El eluido de la columna Ni-NTA se sometió directamente a
SDS/PAGE sin procedimientos de concentración previos, y las proteínas se
tiñeron con tinción de plata. UncIHis sólo se tiñó débilmente con plata. Carril
6, el mismo que el carril 4. Carril 7, la columna Ni-NTA cargada se lavó con
el tampón de lavado que contiene Na+ (que contiene 100 mM de NaCl) y se
eluyó. (C) Detección de UncI en hF1 Fo (-i)(+I). Las fracciones de membrana
de las células que expresan pTR-hF1 Fo (-i) ± pST-I se solubilizaron y se
cargaron en una columna Ni-NTA. La columna se lavó con el tampón de
lavado (sin Na+) (carriles 8 y 10) o con el tampón de lavado que contiene
Na+ (carriles 9 y 11). El hF1 Fo (-i)(+I) se eluyó, se hizo reaccionar con
tetrametilrho- damina maleimida para marcar los residuos de cisteína en
UncI, y se sometió a un análisis SDS/ PAGE. Las proteínas se visualizaron
mediante tinción CBB (carriles 8 y 9) o mediante fluorescencia (excitada a
302 nm, emisión a > 400 nm) (carriles 10 y 11). Las proteínas UncI se
indican con puntas de flecha. A diferencia del gel de la Fig. 1B, la banda de
UncI era visible incluso con la tinción CBB porque el etiquetado con colorante
fluorescente aumentaba la sensibilidad de UncI a la tinción CBB.
(Fig. 4 A, carril 4). La banda de UncIHis era débil porque sólo se
teñía débilmente con plata. Estos resultados sugieren que el Na+
induce la disociación de UncI del anillo c11 pero no del
monómero c.
Como se muestra en la Fig. 1B (ver carriles 9 y 11), la proteína
UncI no se encontró en el híbrido purificado F F1o , y está claro
que UncI no es un componente estable de la enzima madura. Sin
embargo, se ha informado de una asociación débil y
subestequiométrica de UncI a F F1o para E. coli F1 Fo (23, 24).
Para analizar dicha interacción UncI-F1 Fo , aprovechamos el
hecho de que el híbrido F1 Fo no tiene
residuo de cisteína, pero UncI tiene tres. hF1 Fo (-i)(+I) se adsorbió
a la columna de Ni-NTA a través de la etiqueta His en las
subunidades β, y
la columna se lavó con un producto libre de Na+ o con un
producto que contenía Na+.
tampón de lavado. A continuación, las proteínas unidas se
eluyeron con el tampón de alto contenido en imidazol y se
analizaron por SDS/PAGE tras tratarlas con un colorante
fluorescente reactivo a la cisteína, la tetrametilrho- damina
maleimida. En el gel de tinción de proteínas, la banda de UncI se
vio débilmente en la hF1 Fo (-i)(+I) no expuesta al Na+, pero
apenas se vio en la hF1 Fo (-i)(+I) expuesta al Na+ (Fig. 4C, carriles
Suzuki et al.
UncI
c1 I- I-cʼ11 Na+c11
c1
subunid
subunid ades ATP
ades
ADP
Na+
Complejo inactivoComplejo activo
Fig. 5.
monómeroUn modelo de ensamblaje del anillo c asistido por UncI. UncI se une al
11
(o algún estado no ensamblado de) la(s) subunidad(es) c en las
membranas, ayuda a su ensamblaje en el anillo c11 , y deja el anillo c 11
cuando el Na+ se une al anillo c11 . Otras subunidades se asocian con el
anillo c11 y se forma el F1 activo F o . Sin UncI, se forma un complejo F1 Fo
inactivo. En este complejo, las subunidades c no se ensamblan en el anillo c 11
y se pierde alguna fracción de la subunidad a. c' 11 indica un estado
intermedio de formación del anillo c11 .
y se conserva en la mayoría de las bacterias, lo que indica su
importancia. Este trabajo revela un papel esencial de la proteína
UncI para el ensamblaje en anillo de las subunidades c de P.
modestum Fo (Fig. 5). En la mitocondria F1 Fo , se ha demostrado
que algunas proteínas, como la ATP10 de la levadura (31, 32), la
ATP23 (33, 34) y la OXA1 (35), desempeñan un papel similar al
de una chaperona para ayudar al ensamblaje de Fo , aunque el
mecanismo detallado no se conoce bien. Aunque no hay
homología de secuencia con las proteínas eucariotas, la proteína
UncI también desempeña un papel de chaperona; se asocia con
los monómeros de la subunidad c, ayuda al ensamblaje del anillo
y se disocia del anillo c ensamblado. Dado que la chaperona
molecular no es un componente final de la proteína madura
(complejo), debe abandonar su proteína cliente en algún
momento, ya sea utilizando la energía de la hidrólisis del ATP,
por otro(s) factor(es), o simplemente por
asociación/disociación reversible. La UncI se disocia del anillo c
pero no de los monómeros c en presencia del ion Na+,
"catalizando" así una reacción hacia adelante, ensamblando el
anillo. Dado que el Na+ es un ion transportador para P.
modestum Fo , la unión del Na+ al anillo c sería la responsable de
BIOQUÍMICA
esta reacción. Este trabajo también reveló que las subunidades c
que no forman el anillo funcional pueden incorporarse al
complejo F1 Fo , aunque el F1 Fo resultante es inactivo en las
reacciones de acoplamiento. Queda por estudiar si este F1 Fo
inactivo es un complejo sin salida o puede ser un precursor de
un F1 Fo activo. Posiblemente relacionado con este hallazgo, una
pequeña cantidad de proteína UncI permanece unida en el hF1
Fo (-i)(+I) purificado, especialmente en el F1 Fo no expuesto al
Na+. Esta UncI podría estar asociada a una pequeña población
de anillos c o de monómeros c residuales en el complejo. La
proteína UncI se ha encontrado en el F1 Fo maduro de E. coli
(23), y una posibilidad de interacción entre
8 y 9). En consecuencia, la intensidad de fluorescencia de la
banda de UncI fue 1,4 (±0,1) veces más débil en la hF1 Fo (-i)(+I)
expuesta al Na+ que en la hF1 Fo (-i)(+I) no expuesta al Na+ (Fig.
4C, carriles 10 y 11). Aunque la cantidad de UncI asociada
disminuyó por el Na+, una pequeña cantidad de UncI aún
permanecía en la preparación F F1o .
Discusión Desde que se encontró el gen uncI hace 26 años (15,
16), su función ha sido esquiva. Ocupa la primera posición en el
PNAS | 26 de diciembre de 2007 | vol. 104 | no. 52 |
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operón unc UncI y Fo subunidades distintas de la subunidad c (24) no se
elimina
por este trabajo.
Una propuesta de la función de UncI como factor esencial para
ensamblar el anillo c planteará preguntas inmediatas: ¿por qué
un mutante de E. coli que carece del gen uncI puede crecer por
fosforilación oxidativa y por qué el F1 Fo aislado del mutante es
totalmente activo (20, 21)? Es posible que la función de
chaperona de UncI esté restringida sólo en el caso de P.
modestum Fo . Sin embargo, el fenotipo no esencial del gen uncI
de E. coli podría explicarse por otra proteína similar a la
chaperona para las proteínas de membrana en E. coli, YidC. Un
análisis reciente del proceso de integración en la membrana de
la subunidad c de E. coli demostró que la subunidad c recién
traducida es dirigida por las partículas de reconocimiento de
señales a las membranas y se integra en ellas gracias a la ayuda
de YidC (36). Se demostró además que YidC tenía la capacidad
de ayudar a la formación de anillos de

Suzuki et al. PNAS | 26 de diciembre de 2007 | vol. 104 | no. 52 |

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 delante del codón de parada de uncI en el paso de la PCR (denominado uncI His
). Los fragmentos amplificados de uncI y uncIHis se digirieron con EcoRI y PstI
c-monómeros (37). Por lo tanto, es probable que YidC tenga una y se introdujeron en el plásmido pSTV28 (Takara) previamente digerido con
función superpuesta con UncI y pueda complementar la ambas enzimas de restricción. Los plásmidos resultantes se denominaron pST-I
deficiencia de UncI. Esta función de YidC podría ser específica y pST-IHis . De la misma manera, el producto de la PCR de uncE se introdujo en
para el anillo c de E. coli y no puede ayudar al ensamblaje del pTrc99A (Amersham
anillo c de P. modestum11 como se ha implicado en este trabajo.
Por último, aparte de la cuestión de la UncI, cabe señalar que El plásmido
pTRN-ASDS es un derivado de pTR19-ASDS (10). En el plásmido, su sistema de
el mismo dominio F1 derivado de un Bacillus termófilo puede regulación del operador lac no funciona por mutación desconocida y, por tanto, el gen
introducido se expresa fuertemente sin un inductor, el isopropil-β-tiogalactopiranósido.
acoplarse con el anillo c11 en el híbrido, así como con el anillo c10
en el TF1 Fo original. También se ha observado un resultado
análogo en otro híbrido F1 Fo , compuesto por E. coli F1 y P.
modestum Fo (38). Parece que las subunidades γ y s de los
Bacillus termófilos
F1 puede conseguir ligar un anillo c con un radio ligeramente
mayor a
hacer un cuerpo de aparato de rotor que sea lo suficientemente
robusto para transmitir el gran par de rotación entre Fo y F1 .
Materiales y métodos
Vectores de expresión para el híbrido F 1 Fo . Un fragmento de ADN, que
contiene uncIBE y la mitad 5' de uncF, fue amplificado por PCR a partir de
ADN genómico de P. modestum. Se amplificó por PCR un fragmento de
ADN que contenía la mitad 5' de uncF y uncHA' a partir de un plásmido de
expresión para Bacillus PS3 F1 Fo (TF1 Fo ), pTR19-ASDS (denominado pTR-TF1
Fo en este trabajo) (10). Los dos fragmentos poseen la misma secuencia de
nucleótidos en el borde (región de la subunidad b) y, por lo tanto, los
fragmentos se conectaron mediante amplificación por PCR sin un cebador
adicional. El fragmento resultante compuesto por P. modestum uncIBEF' y
Bacillus PS3 unc'FA' fue digerido con EcoRI y KpnI y sustituido por la
región correspondiente de pTRN-ASDS¶ (sitios EcoRI y KpnI) para obtener
un plásmido de expresión, pTR- hF1 Fo (+i) . También se hizo pTR-hF F1o (-i) ,
en el que se eliminó el gen uncI de pTR- hF1 Fo (+i), para comprobar el
papel de uncI.

Preparación de las vesículas de membrana y del híbrido F1Fo. El plásmido1 pTR-

o
hF F (+i) se utilizó para la transformación de una cepa de E. coli deficiente
en F1 Fo , JM103Δ(uncB- uncD) (en adelante, JM103Δunc) (39). Las
transformantes se cultivaron aeróbicamente en medio 2×YT suplementado con
100 µ g/ml de ampicilina durante 21 h. En el caso de las transformantes que
albergaban el plásmido derivado de pSTV28 (mencionado más adelante), se
suplementó también con 30 µ g/ml de cloranfenicol para mantener el
plásmido en las células. Las células (≈30 g) cosechadas de un cultivo de 12
litros se lavaron dos veces con tampón PA3 [10
mM de tampón Hepes/KOH (pH 7,5) que contiene 5 mM de MgCl 2 y 10% de
glicerol] y se utilizó para la preparación de vesículas de membrana invertida
como se describe en la ref. 40 excepto la disrupción celular por sonicación
en lugar de la prensa francesa. Las vesículas de membrana se utilizaron para
los análisis de F1 Fo . La purificación del híbrido F1 Fo se llevó a cabo de la
siguiente manera. Las vesículas de membrana (≈15 mg de proteínas por ml,
16 ml) se lavaron con 16 ml de tampón Hepes/KOH 10 mM (pH 7,5) y, a
continuación, se solubilizaron en tampón Hepes/KOH 10 mM (pH 7,5) que
contenía un 1% de Triton X-100 en presencia de un inhibidor de proteasas
(Complete EDTA-free; Roche) durante 30 min en hielo con mezclas
ocasionales. Tras una centrifugación (153.000 × g, durante 20 minutos, a
4°C), el sobrenadante se diluyó 4 veces con el tampón M [tampón de
fosfato de potasio 20 mM (KP i )i (pH 7,5) que contenía 100 mM de KCl]
complementado con 20 mM de imida- zol. El sobrenadante diluido se mezcló
con 12 ml de Ni-NTA Superflow (Qia- gen) y se agitó tranquilamente durante
30 minutos en hielo. La resina se vertió en una columna adecuada y se lavó
con 3 vol del tampón M complementado con 0,05% de Tritón X-100 y 20 mM
de imidazol. F1 Fo se eluyó con el tampón M complementado con 0,05% de
Triton X-100 y 200 mM de imidazol. El F1Fo de la elución se mezcló con 50
mM de MgCl2 y 2,7% de PEG 6000, se incubó en hielo durante 15 minutos y
se recogió por ultracentrifugación (153.000 × g, durante 20 minutos, a 4°C).
El pellet obtenido se disolvió en un pequeño volumen de tampón Hepes/KOH
10 mM (pH 7,5) que contenía 0,05% de Triton X-100. Tras una breve
centrifugación, el sobrenadante se congeló mediante N líquido 2 y se
almacenó a -80°C hasta su uso. Las PL que contenían el híbrido purificado F
F1o en la membrana se prepararon mediante el método de congelación-
descongelación utilizado para el TF 1 Fo (10).

Vectores de expresión para uncI y la subunidad c. Los genes uncI y uncE

(subunidad c) se amplificaron individualmente1 opor PCR a partir de pTR-hF F
(+i). Para la purificación con Ni-NTA del producto del gen uncI, se introdujo

una secuencia de nucleótidos que codifica una etiqueta His (6 residuos)

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 maleimida de tetrametilrhodamina (Molecular Probes) y 0,05% de Triton X-
100 durante 30 min a temperatura ambiente. En todos los SDS/PAGE de
Pharmacia) para obtener el plásmido pTR-c. Para la expresión simultánea este trabajo se utilizó un gel de poliacrilamida en gradiente (10 -20%).
de uncI y uncE, se amplificó uncI por PCR, se digirió con EcoRI y BamHI, y se Todos los datos mostrados en el presente estudio se midieron al menos por
introdujo aguas arriba de uncE en pTR-c para obtener pTR-IHisc. Las triplicado.
secuencias de nucleótidos de las regiones amplificadas por PCR se
verificaron por secuenciación. Los procedimientos para el cultivo de AGRADECIMIENTOS. Agradecemos a nuestros colegas los doctores T.
JM103Δunc transformado con los plásmidos, la preparación de la membrana Hisabori, N. Mitome,
y la solubilización de la membrana con Triton X-100 fueron los mismos P. Kahar y M. Fujikawa por sus útiles discusiones; y a J. Suzuki, T. Kamita y A.
que los descritos anteriormente para el híbrido F1 Fo , pero cuando el A600 Tatsuguchi por su excelente asistencia técnica.
alcanzó 1, se añadieron al cultivo 2 mM de isopropil-β-tiogalactopirano. A
continuación, se continuó el cultivo durante 3 h. La cromatografía en
columna de Ni-NTA se realizó como se describe para el híbrido F F1o excepto
que (i) la columna de Ni-NTA se lavó con 10 vol. de lecho del tampón de
lavado [tampón KPi de 20 mM (pH 7,5), KCl de 100 mM, imidazol de 30
mM y Tritón X-100 de 005% de Tritón X-100] y se eluyó con el tampón de
alto imidazol [tampón KPi 20 mM (pH 7,5), 100 mM de KCl, 200 mM de
imidazol y 0,05% de Tritón X-100]; (ii) el eluido de la columna de Ni-NTA se
concentró con un concentrador centrífugo de 100 kDa (Ultra YM-100;
Amicon) en lugar de la precipitación con PEG. En los experimentos para
comprobar el efecto del Na+ en la interacción UncI-c-subunidad, la columna
Ni-NTA cargada se lavó con 5 volúmenes de lecho del tampón de lavado
que contenía Na+ [tampón KPi de 20 mM (pH 7,5), KCl de 10 mM, NaCl de
100 mM, imidazol de 30 mM, Triton X-100 al 0,05%] y posteriormente con 5
volúmenes de lecho del tampón de lavado (sin Na+). A continuación, las
proteínas se eluyeron con el tampón de alto imidazol.

Procedimientos analíticos. La actividad de bombeo de H+ impulsada por la

ATPasa se ensayó con el apagado de la fluorescencia de la 9-amino-6-cloro-
2-metoxiacridina (ACMA) (ex- citación a 410 nm, emisión a 480 nm) a 32°C
como se describe en la ref. 10. Se añadieron vesículas de membrana
invertidas o PLs a la mezcla del ensayo a una concentración final de 0,2 mg
de proteína de membrana por ml o 20 µ g de Fo F1 por ml. Para evaluar la
sensibilidad al Na+, se añadió NaCl o KCl a la mezcla de ensayo a la
concentración indicada. La reacción se inició añadiendo 1 mM de K+-ATP y
se terminó con 0,25 µ g/ml de cianuro de carbonilo p-trifluorome-
thoxyphenylhydrazone (FCCP). La actividad de bombeo de Na+ impulsada
por la ATPasa se midió por el método de von Ballmoos y Dimroth (41) con
algunas modificaciones como sigue. La L-α-fosfatidilcolina de soja (300 mg, tipo
II-S; Sigma) se sus- pendió mediante una mezcla suave en 10 ml de tampón
PA3 suplementado con 30 µ g/ml de verde de sodio (Molecular Probes) y se
sonicó con una punta grande durante 30 s. El híbrido purificado F1 Fo o TF1
Fo (1 mg) se mezcló con 500 µ l de los liposomas de verde de sodio, se rotó
durante 5 min a 25°C, se congeló con N2 líquido y se descongeló en un
escritorio. Tras la sonicación en baño de agua (45 s), los PL se sometieron a
una columna de filtración de gel de cartucho NAP5 (Amersham Pharmacia)
previamente equilibrada con tampón PA3 para eliminar el verde de sodio
exterior. Así, los PLs preparados se utilizaron para la mea-
de la DCCD. Cuando se indicó, los PLs reaccionaron con 50 µM de DCCD en el
tampón PA3 durante 1 h a temperatura ambiente antes de su uso. La
actividad de bombeo de Na+ se midió a 32°C en un tampón Hepes/KOH 50
mM (pH 7,5) que contenía 100 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 4 mM de
fosfoenolpiruvato, 0,1 mg/ml de piruvato quinasa y 0,22 ng/ml de FCCP en
el
presencia de PLs (la concentración final de lípidos es de 3,3 mg/ml). La
reacción se inició con la adición de 1,3 mM de Na2 -ATP. El aumento de la
concentración de Na+ en el interior de los PLs se monitorizó mediante un
aumento de la fluorescencia del verde de sodio (excitación a 488 nm y
emisión a 540 nm).
La actividad de síntesis de ATP de las vesículas de membrana se midió a
35°C en el tampón PA3 complementado con 2,5 mM de KPi , 0,5 mM de
ADP, 2,5 mM de NaCl, vesículas de membrana (85 µg y 53 µg de proteínas
de membrana/ml para las vesículas que contenían el híbrido F1 Fo y TF1 Fo ,
respectivamente), y 1/10 vol de la solución CLSII que contenía
luciferina/luciferasa (kit de bioluminiscencia de ATP; Roche). Si se indicaba, se
añadía a la solución un antiportador de Na+/H+, la mo- nensina, a una
concentración final de 5 µ M. La reacción se inició añadiendo 1,7 mM de
NADH para generar un gradiente de potencial electroquímico de H+ a
través de la membrana. La producción de ATP se monitorizó en tiempo real
mediante la luz de la reacción de la luciferasa a 560 nm. Las cantidades de
ATP sintetizadas se calibraron con una cantidad definida de ATP al final de
la medición. La actividad que sintetizó 1 µ mol de ATP por minuto se definió
como 1 unidad. Las actividades de ATPasa se analizaron en un tampón
Hepes/KOH 50 mM (pH 7,5) que contenía 100 mM de KCl, 5 mM de MgCl 2 , 0,2
µ g/ml de FCCP, 0,8 mM de K+-ATP y el sistema de regeneración de ATP (10)
y, en el caso de las vesículas de membrana, 2,5 mM de KCN para evitar la
oxidación del NADH por la cadena respiratoria de E. coli. Se midieron las
tasas medias de hidrólisis en un periodo de tiempo de 3 a 6 minutos tras el
inicio de las reacciones a 42°C. La actividad que hidrolizó 1 µmol de ATP
por minuto se definió como 1 unidad. Las concentraciones de proteínas se
determinaron mediante el kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce, con
BSA como estándar. El marcaje por fluorescencia de UncI en la prepa- ración
F1Fo se realizó en 100 mM Mes/KOH (pH 6,5) con 1% de SDS, 1 µ g/ml de

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BIOQUÍMICA

Suzuki et al. PNAS | 26 de diciembre de 2007 | vol. 104 | no. 52 |

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