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INSTITUTO POLITCNICO

NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE
CIENCIAS BIOLGICAS
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO POR
CONJUGACIN EN Escherichia coli
GRUPO: 5QV2
SECCIN: 1

EQUIPO: 3

INTEGRANTES:
CARDOSO HERRERA LESLYE HIRLEY
CELAYA BARRAGN ADRIN ISAI
CERN MARTNEZ EMILIA TERESA
FECHA DE ENTREGA: 18/10/2016

INTRODUCCIN:

La conjugacin es el proceso por el cual el DNA se transfiere de una bacteria


donadora a una receptora por un mecanismo que involucra el contacto entre las
clulas.
Clula receptora (F-): Es aquella en la que el plsmido F est ausente.
El plsmido F es el factor responsable de la fertilidad en las clulas donadoras (F+)
y puede encontrarse en uno de tres posibles estados (figura 1):

Figura 1. Tipos de clulas con factor F.

Cruza F+ x F-: El factor F contiene un origen de replicacin y cierto nmero de


genes requeridos para la conjugacin (figura 2), ya que algunos de estos genes
codifican los pili sexuales (tabla 1), que son prolongaciones delgadas de la
membrana celular. Toda clula que contiene el factor F produce los pili sexuales,
que hacen contacto con un receptor de una bacteria y une las dos clulas.
Entonces, el DNA se transfiere desde la clula F + a la clula F-. La conjugacin
slo se produce entre una clula que posee el factor F y una bacteria que carece
de l. La transferencia se inicia cuando una de las cadenas del DNA del factor F
forma una muesca en el sitio de origen (oriT). Un extremo del DNA roto se separa
del crculo y pasa a la bacteria receptora. La replicacin se produce en la cadena
rota, alrededor del plsmido circular y en reemplazo de la cadena transferida.
Dado que el plsmido de la clula F + siempre se rompe en el sitio oriT, este sitio
siempre ingresa en la bacteria receptora en primer lugar, seguido por el resto del
plsmido. As, la transferencia de material gentico tiene una direccin definida.
Una vez dentro de la bacteria receptora la cadena simple se replica y produce una
copia del plsmido F circular y bicatenario. Si el factor F completo se transfiere a la
clula receptora F-, est clula se transforma en una clula F+.

Figura 2. Regiones del plsmido F: la replicacin se inicia en el sitio


oriV, el sitio oriT indica el origen de la transferencia de informacin
gentica. Las secuencias de insercin IS3 e IS2 controlan la insercin
del cromosoma bacteriano y la escisin de ste.

Tabla 1. Funcin de los diferentes genes tra en la conjugacin bacteriana.


Gen
Funcin
Codifican para Biosntesis y ensamblaje del pili F.
traA, traB, traC, traE, traF, traG,
traH, traJ, traK, traL, traU, traV
Codifica para una protena que interviene en la
traD
traG, traN
traM
traY
traS (membrana interna),
traT (membrana externa)

conjugacin.
Estabilizacin de la agregacin.
Seala el punto de corte en la cadena.
Corta la cadena que ser transferida.
Exclusin de la superficie.
Limitan la capacidad de una F+ para actuar como receptora.

Cruza Hfr x F-: En las cepas Hfr (alta frecuencia de recombinacin) el factor F
est integrado al cromosoma bacteriano. Las clulas Hfr se comportan como
clulas F+, forman pili sexuales y se conjugan con las clulas F -. En la conjugacin
entre clulas Hfr y F-, el factor F integrado se rompe y el extremo de la cadena rota
se mueve hacia la bacteria F -. En las clulas Hfr, el factor F se une al cromosoma
bacteriano, de modo que el cromosoma lo sigue hasta la clula receptora. La
cantidad de cromosoma bacteriano que se transfiere depende del tiempo en el que
ambas clulas permanecen en la conjugacin. Una vez dentro de la clula
receptora la cadena del DNA donante puede producirse un entrecruzamiento entre
la cadena y el cromosoma original de la clula F -. La clula F- casi nunca se
convierte en F+ o Hfr porque el factor F se rompe en la mitad durante el comienzo

de la transferencia de la cadena, dejando una parte de F al comienzo y otra parte


al final de la cadena que va a transferirse. Para convertirse en F+ o Hfr la clula
receptora deberecibir un factor F completo, que supone la transferencia completa
del cromosoma bacteriano. Esto sucede rara vez, porque la mayora de las
bacterias que se conjugan se separan antes de que la transferencia del
cromosoma se haya completado.
Cruza F x F-: Las clulas que contienen un plsmido F y algunos genes
bacterianos se denominan F. Por ejemplo, si un factor F se integra a un
cromosoma adyacente a los genes lac, el factor F puede tomar los genes lac
cuando se escinde y convertirse en F lac+. Durante la conjugacin entre una
clula F lac+ y una clula F-, el plsmido F se transfiere a la clula F-, lo que
implica que cualquiera de los genes del plsmido F, incluso los provenientes del
cromosoma bacteriano, pueden transferirse a las clulas F receptoras. Este
proceso se denomina sexduccin. Produce diploides parciales o merocigotas, que
son clulas que poseen dos copias de algunos genes, una en el cromosoma
bacteriano y otra en el plsmido F recin introducido.

Tabla 2. Resultados de las diferentes cruzas en la conjugacin.


Donadora

Receptora

Transconjugante

F+

F-

F+

Hfr

F-

F-

F-

F o F

Bacterifago M13:

Es un virus compuesto por una molcula de ADN monocatenario circular.

La protena de recubrimiento menor P3 permite que el fago se una a un


receptor presente en la punta de los pilli del hospedador Escherichia coli.

Las bacterias infectadas continan vivas (ciclo no ltico); aunque su


velocidad de crecimiento decrece.

Figura 3. Esquema del bacterifago M13.

OBJETIVOS:

Cuantificar la transferencia de material gentico por medio de la conjugacin


en bacterias Gram
Establecer las diferencias entre las transconjugantes que se obtienen a partir
de clulas donadoras Hfr y F y con receptoras Rec+ y Rec-.

RESULTADOS:
Tabla 3. Resultados de la cuenta viable de las diferentes cepas utilizadas.
Cepa
Equipo
Dilucin
No. De colonias
Titulo (UFC/ml)
-4
-5
3
10
10
I, I
470, 547
5.08108

JC4046

CSH62

RC712
KL323

4
5
6
1
2
3
4
1
2
5
6
3
4

10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4

10-5
10-5
10-5
10-5
10-5
10-5
10-5
10-5
10-5
10-5
10-5
10-5
10-5

205, 213
464, 440
96, 97
203, 173
560, 487
I, I
I, I
26, 47
I, I
706, 692
240, 213
123, 119
132, 99

I= incontables.
ND= No determinado

EJEMPLO DE CLCULO PARA CUENTA VIABLE


UFC
1
1
=( Nm de colonias )

mL
alcuota
dilucin

96+ 97+37+ 9
1
2.22
1
UFC
0.1
=
mL
104

UFC
=1.0710104 =1.07 x 107
mL

)(

42, 35
116, 127
37, 9
11, 9
391, 240
ND, 157
ND, 27
6, 13
751, 722
0, 0
107, 126
17, 18
16, 12

2.3107
5.21107
1.09107
1.8107
7.6107
1.57108
2.7107
4.18106
7.36108
6.99107
3.12107
1.25107
1.17107

Tabla 4. Ttulo de revertantes para cada cepa utilizada por los diferentes
equipos de la seccin.
Equipo
Cepa
Medio
# colonias
Ttulo de revertantes
1
CSH62
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
RC712
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
2
CSH62
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
RC712
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
3
JC4046
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
CSH62
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
KL23
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
4
JC4046
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
CSH62
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
KL23
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
5
JC4046
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
RC712
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
6
JC4046
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0
RC712
G8
0
0
G9
0
0
G10
0
0

Tabla 4. RESULTADOS DE LOS TTULOS BACTERIANOS PARA LAS CRUZAS


REALIZADAS EN LOS MEDIOS G8, G9 Y G10.
CEPA EQUIPO MEDIO DILUCI NMERO DE
TTULO
N
COLONIAS
(UFC/mL)
-1
JC4046 (F) X
G8
10
915,934
1.21x105
RC712 (F-)
5
10-2
387,393
5.4 x102
-3
(Rec+)
10
32,36
8 x101
0
10
G9
52,63
10-1
4,1
0
10
9,7
-1
10
0,0
G10
6
G8
10-1
I, I
4.82 x105
10-2
472,510
10-3
41,38
1.68 x103
0
10
0
G9
152,197
10-1
0,4
0
10
G10
0
10-1
0
-1
JC4046 X KL23
3
G8
10
I,I
9.65x105
-2
(F x F Rec -)
10
I,I
0
-3
10
88,105
0
100
G9
0,0
100
4

G10
G8

10-1
10-2
10-3
100

G9

0,0
I,I
I,I
140,138

1.4 x106

100
G10

Tabla 5. RESULTADOS DE LOS TTULOS BACTERIANOS PARA LAS CRUZAS


REALIZADAS EN LOS MEDIOS G8, G9 Y G10.

CEPA EQUIPO MEDIO


CSH62 X
RC712

Hfr x F Rec+

G8

G9

G10
2

G8

G9

G10
CSH62 X KL23

Hfr x F - Rec-

DILUCI
N
100
10-1
100
10-1
10-2
10-1
10-2
100
10-1
100
10-1
10-2
10-1
10-2

NMERO DE
COLONIAS
312,280
3,6
306,280
50,18
1,0
580,524
25,40
44,40
0,0
924,1280
58,46
1,1

TTULO
(UFC/mL)
2.73 x103
2.96 x103
5.31 x 104

4.2 x10 2
1.04 x104
6.53 x104

G8

100

549,770
56,63
0,0

G9

100

0,0

G10

0,0
0,0
0,0

G8

100
10-1
100

G9

100

0,0

G10

100
10-1

0,0
0,0

Tabla 6. Frecuencia de recombinacin para los distintos marcadores a seguir en las


diferentes cruzas.
TTULO DE
Cruza
MARCA
MEDIO
TTULO DE FRECUENCIA
TRANSCONJUGANTES
DONADORAS
DOR
DE
RECOMBINACIN

Hfr x FRec+

F`x FRecF`x FRec+

His

G8

2 .73 X 10

Trp

G9

2 .96 X 10

Pro

G10

5 .3 X 10

His

G8

9.65X105

5.08109

1.89X10-4

His
Trp

G8
G9

4.82 x105
1.68 x103

1.07 x108
1.07 x108

4.47 x10-3
1.56 x10-5

1 .51 X 10
7

1. 8 X 10

1. 6 X 10

2 .9 X 10

EJEMPLO DE CLCULO PARA FRECUENCIA DE RECOMBINACIN:


(Ttulo de las donadoras)(Factor de dilucin)= (5.08108)(10) = 5.08109
5

FM=

Ttulo de transconjugantes
9.65 x 10
Ttulo de donadoras enla mezcla de conjugacin 5.08 109

4
= 1.89 X 10

Tabla 7. Resultados de la prueba de gota en las diferentes


cepas donadoras, receptoras y cruzas utilizadas.
Equipo
Cepa
Resultado
1
CSH62 (Hfr)
+
RC712 (Rec+)
+
Hfr x F
+
2
CSH62 (Hfr)
RC712 (Rec+)
Hfr x F3
JC4046 (F)
+
KL323 (Rec-)
F x F
4
JC4046 (F)
KL323 (Rec-)
F x F
+
5
JC4046
RC712 (Rec +)
-

F x FJC4046
RC712 (Rec +)
F x F-

+
+
+
-

DISCUSIN
Para realizar la cuenta viable se diluyo cada cepa a 10 -4 y 10-5 para obtener cajas
con una buena proporcin de colonias aisladas que pudiramos cuantificar, estas
diluciones se sembraron por dispersin en cajas de agar luria por duplicado, un
medio rico para que las bacterias se desarrollasen, despus de la incubacin se
observ el crecimiento, se cont el nmero de colonias observado y se calcul el
ttulo de donadoras y receptoras, cada equipo desarrollo los clculos de las cepas
que sembraron. Los resultados obtenidos en la cuenta viable se muestran en la
tabla 3, esta nos ayuda a ver el crecimiento normal de cada cepa de E. coli y
calcular la frecuencia de recombinacin de cada una de las transconjugantes
obtenidas en el proceso de conjugacin que se llev a cabo. Como se trabaj en
las mismas condiciones y con las mismas cepas se esperaba que los resultados
fueran muy parecidos entre s, en el ttulo de donadoras y receptoras, lo cual no
sucedi. En la cepa donadora JC4046 F se observ que hay un aumento de 20
veces en el quipo 3 con respecto al equipo 4 y uno de 10 veces mayor con
respecto al 5; esto no muestra concordancia ya que la mala distribucin del
espatulado, o un error en las diluciones pudo haber provocado este ttulo mayor,
las diluciones de 10-4 presentan colonias incontables, que de una manera no
determinada provocan el aumento en las diluciones subsecuentes. Estos
aumentos de ttulos ocurren nuevamente en el equipo 3 en la cepa donadora Hfr y
en el quipo 2 con la receptora RC712 F - Rec+. Estos resultados de cuenta viable,
no se pueden considerar confiables, porque hay variaciones entre cada equipo en
las cepas donadoras y la receptora RC712, en el caso de la receptora KL323 los
ttulos tienen resultados muy similares y la variacin no es mayor a 10 veces, por
lo tanto se pueden considerar los ms confiables y que esta cepa fue cuantificada
de manera adecuada.
La seleccin de revertantes, fue realizada para comprobar que el genotipo de cada
cepa correspondiera al especificado. Cada medio utilizado era selectivos de
acuerdo al marcador a seguir para cada cepa receptora, el medio G8 sigue al
marcador Histidina, el G9 a la Prolina y el G10 al Triptfano y ya que adems
estos medios contienen Estreptomicina y nuestras cepas donadoras son sensibles
a esta, ninguna donadora ni receptora podra desarrollarse en esos medios, si
esto ocurre posiblemente la cepa habra sufrido una mutacin espontnea en
algunos de los marcadores cromosomales pudiendo sintetizar un aminocido que
antes no pudiera y con ello crecer en uno de nuestros medios selectivos,
dependiendo en que cepa y medio creciera dependera el nmero de revertantes
que se observaran, para detectar esta mutacin no se diluy la muestra y se

sembr de la cepa original en los medios por dispersin en duplicado, despus de


la incubacin, en el caso de esta seccin no se observ ninguna revertante (tabla
4) en los medios G8, G9 y G10 por lo que se omiti el proceso de clculo de
frecuencia de reversin.
Para realizar la conjugacin, cada quipo desarrollo una cruza sealadas en la
tabla 5, se agreg 0.5 ml de la donadora a 4.5 ml de la receptora, para que fuera
observable el nmero de transconjugantes en cada caja, se incub una hora a
37C esto para que se llevara a cabo el proceso de conjugacin, donde el
contacto entre las clulas es esencial para la transferencia cromosmica (W. Klug.
M. Cummings y C. Spencer, 2006). En este tiempo permitimos que las donadoras
que poseen el plsmido F+ produzcan su pili que funciona por retraccin para
atraer a la clula receptora y de esta forma mantener las superficies celulares del
donador y receptor juntas, siendo en este momento cuando la transferencia de
DNA puede suceder (Curtiss, Marvin y Hohn. 1969). Se evit el movimiento para
lograr que las bacterias se mantuvieran el mayor tiempo posible unidas y pasados
los 60 minutos la conjugacin se detuvo al resuspender las clulas en el vortex,
para observar a las transconjugantes se realizaron diferentes diluciones, esto
porque en algunos casos para observar bien el gradiente formado es necesario
una mayor dilucin, que en algunas cruzas donde slo se observaran crecimiento
en una o dos cajas, el nmero de transconjugantes ser menor y por lo tanto no se
necesita diluir, para poder cuantificarlas. Posteriormente se sembraron por
dispersin en los medios selectivos nuevamente por duplicado, para contar las
colonias y calcular los ttulos. En la primera cruza de F F - Rec+ se observa un
crecimiento en gradiente, lo cual slo se explica con la formacin de la donadora
F a una Hfr temporal, ya que slo se esperara el paso del marcador cromosomal
de his+ y el crecimiento de esta en el medio G8 que es selectivo para his+ pero se
observa crecimiento en gradiente en los otros medios, esto porque la F pasa a ser
una Hfr temporal y al ser la receptora una Rec + se recombina el material gentico
del plsmido con el cromosoma de la bacteria y se pueden expresar otros
marcadores cromosomales, dependiendo de la cantidad que hayan pasado de una
clula a otra. En el caso del equipo 5, el marcador de pro+ no paso y por eso se
observa que en este medio no hubo crecimiento, este fenmeno de Hfr temporal
tiene una frecuencia de 10 -7 as que es probable que haya sucedido en esta
cruza. En la siguiente cruza de F F - Rec- la receptora no posee la protenas
Rec de recombinacin lo cual no permite que la haya, la bacteria donadora posee
en su plsmido un marcador cromosomal de his+, antes mencionado que permite
que la transconjugante solamente se desarrolle en el medio G8 que no posee his,
al crecer solo en este medio indica que la transconjugante adquiri el plsmido, ya
que antes de adquirirlo era auxtrofa a histidina, cuando lo adquiere es capaz de
sintetizar histidina lo cual la convierte a una clula prototrofa, en los dems
medios no poda crecer ya que no adquira los dems marcadores de triptfano
(G9) y prolina (G10). La cruza Hfr F - Rec+ se observ el gradiente caracterstico
de esta donadora, el origen de la transferencia viene determinado por el punto de

integracin en el cromosoma del factor F, y la direccin de transferencia por la


orientacin del factor F cuando se integra (W. Klug. M. Cummings y C. Spencer,
2006). Los ttulos van disminuyendo del medio G10 al medio G8, esto por lo antes
mencionado, por el mapa gentico de E. coli y el gradiente sealado para la cepa,
el primer marcador en pasar en la transferencia es el de prolina, el medio G10 es
selectivo para pro+ tiene un orden de transferencia ms temprano por lo tanto
tiene un mayor crecimiento en G10, en G9 solo se desarrollaran aquellas que
hayan adquirido el marcador trp+, este se transfiere en menos tiempo que la
histidina y por lo tanto su recombinacin ser mayor, por eso es que en G9 se
observa mayor crecimiento que en G8. Aquellos marcadores cromosomales
prximos al origen de transferencia se transferirn primero, al no durar el
suficiente tiempo el proceso de conjugacin no todos los marcadores pasaran ni
en la misma proporcin por eso es que la clula permanecer siendo F -. En la
ltima cruza, Hfr x F - Rec- la receptora no posee las protenas Rec de
recombinacin lo que disminuye la capacidad de la receptora de incorporar el
material gentico transferido por la donadora Hfr ya que no hay quien proteja a la
cadena sencilla de DNA de las nucleasas y protenas de exclusin, ni la escolte al
sitio de recombinacin homloga sustitutiva, por lo tanto al entrar el DNA, este es
degradado por la nucleasas, por lo que no es incorporado al cromosoma de la
donadora, y, por lo tanto, no es expresado, por lo que no se observ crecimiento
en ninguno de los medios de seleccin en la prueba de transconjugantes, y si se
hubiera observado, sera con menor frecuencia que la receptora, esto podra
deberse a que la presencia de la protena Rec BCD, tambin de recombinacin
que puede presentare en menor proporcin en la clula, a pesar de ser una
donadora Rec-, esta tambin es capaz de llevar a cabo la recombinacin
homloga sustitutiva, sin embargo, estas protenas como se observ en los
resultados, no estuvieron presentes, por lo que la cepa F - solo posea protenas
Rec A. Se realiz la prueba de gota por vaciado de las cepas donadoras
receptoras y tranconjugantes, utilizando el fago M13, siendo este un fago
filamentoso con DNA que infectan solamente clulas donadoras, pues penetran
tras la fijacin de pelos o fimbrias sexuales y adems tienen la propiedad de
liberarse de la clula sin causar la muerte de la clula hospedadora (M. Madigan.
J. Martinko y J. Parker, 2004) por lo tanto, las clulas Hfr y F y las trasconjugantes
que como resultado tuvieran alguna de estas donadoras, debieron haber dado
positivo a esta prueba y conforme a los resultados obtenidos, el equipo 1 para la
donadora CSH62 (Hfr), el equipo 3 para la donadora (F), la donadora JC4046 (F)
y por ltimo, la transconjugante de la cruza de F x F- del equipo 4 y 5 dieron
positivo a esta prueba y corresponda los resultados esperados.
Para terminar se realiz el clculo de la frecuencia de recombinacin para cada
uno de los marcadores y se obtiene que para la cruza Hfr x F - Rec+ el marcador
con mayor frecuencia de recombinacin fue el triptfano de 1.6x10 -2, mientras que
Histidina fue el menor con 1.51x10 -5 siendo el de triptfano 30 veces mayor que el

de Histidina; para la cruza F`x F - Rec+ fue Histidina el marcador que tuvo una
mayor frecuencia de recombinacin de 4.47x10 -3.

CONCLUSIONES

Se cuantific la transferencia de material gentico por medio de


conjugacin en bacterias Gram (-) mediante el clculo de la frecuencia de
recombinacin.
Las transconjugantes obtenidas de la cruza Hfr X Rec+ son F-/Pro+,Trp+,
His+.
Las transconjugantes de la receptora Rec+ fue capaz de incorporar el
material gentico transferido a su cromosoma, mientras que Rec- no lo
hizo.
Las transconjugantes obtenidas de la cruza F X F- Rec- son F,His+,
independientemente de que posean las protenas Rec, ya que el plsmido
se transfiere de manera completa y no es necesaria la incorporacin al
cromosoma para que se expresen los genes transferidos.
De la cruza F X F- Rec+, la F forma una clula Hfr dando como resultado
un crecimiento en gradiente, siendo importante la protena Rec+.
Las cepas donadoras de Escherichia coli infectada por el fago M13, puede
continuar creciendo mientras libera partculas vricas. Las receptoras F- no
son infectadas.
En la cruza Hfr x F- Rec+ el marcador con mayor frecuencia de
recombinacin fue Histidina, al igual que en la cruza F`x F - Rec+.

BIBLIOGRAFA:

Fernndez, J. Gentica. Ed. Ariel. Espaa. pp 132-137.

Klug, S. W. Cummings, R. M. y Spencer, A.C. Conceptos de gentica.


Octava edicin. Ed. Pearson Educacin. Mxico. pp 155-164.

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/09GeneticaBacteriana_23096.p
df
Visitado: 15/10/16 a las 17:52 hrs.
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/27_micro.htm
Visitado: 15/10/16 a las 18:15 hrs.

Madigan, M. T. Martinko, J. M. y Parker, J. Brock. Biologia de los


Microorganismos. 10 edicin. Ed. Prentice-Hall. Madrid. pp. 517-518

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