MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

PRACTICA N° 4 FECHA: 07/05/2022

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: DETERMINACIÓN

CUANTITATIVA DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR DE LA
MUESTRA DE LEVADURA
INTEGRANTES:

NOMBRE: Helen Baya Galan CÓDIGO: BYF5614752

NOMBRE: Luisa Bertha Aduviri Cordova CÓDIGO: BYF7350040
NOMBRE: Katerin Zaida Choque Bautista CÓDIGO: BYF13032037
NOMBRE: Jhulibeth Vega Nuñez CÓDIGO: BYF8704961
PROGRAMA: BIOQUÍMICA Y GRUPO: DOCENTE: Mgr. Kelly E.
FARMACIA Loayza Afonso

1. Resumen
La turbidimetría que mide la absorbancia de la muestra es una técnica analítica utilizada para
determinar la forma en la que se atenúa la luz cuando se traslada mediante una suspensión. Para
esta técnica se realizó la curva de calibración que consiste en la determinación de la absorbancia
de la muestra en este caso de la levadura , mediante el espectrofotómetro con la finalidad de
evaluar la concentración celular.

2. Fundamento teórico
Cuantificar la concentración de microorganismos en una muestra de manera directa. En el campo
de la química clínica la cuantificación de microorganismos es muy importante para conocer el grado
de infección de un microorganismo, sin embargo, no se llevan a cabo como prueba de rutina debido
al tiempo que los métodos consumen.
El recuento en placa es uno de los métodos más utilizados para determinar cuál es el número de
microorganismos viables en un medio líquido. Cuando la concentración es baja se procede a filtrar
la muestra a través de una membrana que será pasada al medio de cultivo, en una placa de Petri.
Los métodos directos se basan en la enumeración directa de las células bacterianas donde
encontramos el Conteo Directo al Microscopio (CDM) y la Epifluorescencia Directa (DEFT),
mientras que el Dispensador de placa (Plate Loop), el Sistema de Conteo en Espiral y Petrifilm
detectan colonias bacterianas.

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-Es la medida de la cantidad de luz absorbida por una disolución. ,
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3. Objetivos

3.1. Objetivo General

Cuantificar la concentración de microorganismos

3.2. Objetivos Específicos

*Determinar el Ph de la solución madre
* Manipular de manera correcta los equipos
*Determinar la curva de calibración en el proceso de turbidimétrico
4. Parte Experimental

4.1. Materiales

Material de vidrio
- Matraz aforado 100 - 50 ml
- Pipeta 10 - 5 ml
- Vaso de precipitado 100 - 50 ml
- Vidrio de reloj
- Varillas de vidrio

Otros materiales
- Espátula
- Piseta

4.2. Equipos

- Balanza analitica
- Espectrofotómetro

5. Procedimiento
5.1. Determinación de la curva de calibración en el proceso turbidimétrico
En el procedimiento es necesario preparar una serie de soluciones de concentración a utilizar,
partiendo de la solución madre de levadura:

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-Preparamos una solución madre de levadura, por falta de hornilla no realizamos la desactivación
de la levadura.
-La concentración de la solución madre de levadura debe ser la adecuada, de tal manera de obtener
la disolución (en forma cuantitativa) de 100 ml de suspensión de levadura para el cual realizamos
las distintas concentraciones:
Concentración 0.1 g/l: A partir de la solución madre tomamos 10 ml y enrasamos con agua
destilada hasta 100 ml y rotulamos.
Concentración 0,2 g/l: Partiendo de esta solución tomamos 10 ml y trasvasamos a otro matraz y
se enraso 100 ml con agua destilada y rotulamos.
Concentración 0,3 g/l: Partiendo de la solución 0,2 tomamos 10 ml y trasvasamos a otro matraz,
se enraso a 100 ml con agua destilada y rotulamos.
Concentración 0,4 g/l: Partiendo de la solución 0,3 tomamos 10 ml y trasvasamos a otro matraz,
se enraso a 50 ml con agua destilada y rotulamos
Concentración 0,5 g/l: Partiendo de la solución 0,4 tomamos 10 ml y trasvasamos a otro matraz,
se enraso a 50 ml con agua destilada y rotulamos.
-Realizamos la calibración del espectrofotómetro a 610 nm y medir la transmitancia de cada una de
las suspensiones, comenzando por la de menor concentración.
- Medimos las concentraciones en las celdas, de las cuales se fueron colocando una a una las
distintas concentraciones incluido a la solución madre,y anotamos las absorbancias.
-Construimos un gráfico de log T (transmitancia) Vs, X (concentración de levaduras en base seca).
Y determinamos el rango de concentración en el cual la curva tiene un comportamiento lineal.

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6. Flujograma ilustrativo del procedimiento

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-Es la medida de la cantidad de luz absorbida por una disolución. ,
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Fuente: Elaboración Propia

7. Cálculos de las concentraciones obtenidas en la práctica

Curva de calibración de las concentraciones de la solución madre de la levadura

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Fuente: Elaboración propia

Curva de calibración
Concentración X Absorbancia Y

0,1 0,065

0,2 0,064

0,3 0,044

0,4 0,019

0,5 -0,003

Solución madre absorbancia: 2,315

Datos: y= 2,315 m= -0,226 x= ?
b= 0,0875

y=mx+b
x=(y-b)/m
X= 2,315-0,0875/-0,226
X= -9,86 moles

8. Cuestionario
¿Qué métodos de determinación cuantitativa de concentración celular existen? Explique
detalladamente?.
-Conteo en placa de petri: Se prepara un caldo de cultivo, el cual posteriormente se vierte en las
placas de petri. Dependiendo del tipo de sembrado, puede que la muestra se encuentre incorporada
en el agar o puede que la muestra se disperse sobre el agar gelificado.Es de suponerse que cada
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célula o grupo de células presentes en la muestra se reproducirá en sus múltiples alrededores para
producir "colonias de células" separadas en el agar. Cada colonia es llamada unidad formadora de
colonias .
-Conteo por filtración:Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en
casos de lagos y arroyos relativamente puros. En esta técnica se necesitan al menos 100 mL de
agua que atraviesan una membrana delgada de un filtro, con poros tan pequeños que no permitan
el paso de bacterias, de esta forma éstas son retenidas en la superficie del filtro.Posteriormente el
filtro es transferido a una caja de petri que cuenta con un caldo nutritivo, en la cual las colonias
surgen de las bacterias en la superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este método
son distintivas cuando ocupan un medio diferencial.
-Determinación directa por microscopio :Las células se pueden contar en un frotis teñido, como
es el caso del Método de Breed, colocando en la preparación un volumen conocido de la suspensión
de células sobre un área conocida del portaobjetos. Después de haber fijado y teñido el frote, es
posible contar con un microscopio las bacterias.
Como no es práctico recorrer toda el área, se cuenta el número de células en unos cuantos campos
microscópicos seleccionados al azar. Si el diámetro del campo microscópico se mide con
micrómetro objetivo, se puede calcular fácilmente el área, entonces el número de campos en 1 cm²
se multiplicará por el promedio del número de células por campo y después por 100 ,el resultado
será igual al número de células por mililitro.

-Método de turbidez:En el espectrofotómetro, un haz de luz es transmitido a través de la

suspensión bacteriana a un detector sensible a la luz. Mientras incremente el número de bacterias,
menor será la luz captada por el detector. Este cambio en la luz se registrará en la escala del
instrumento como el porcentaje de transmisión. También se registra una expresión logarítmica
llamada absorbancia , un valor derivado del porcentaje de transmisión que puede ser reportado.
-Determinación del peso seco en las células:Es el método más directo para las mediciones
cuantitativas de la masa celular y probablemente el más fácilmente realizable y reproducible,
aunque se debe aplicar solo en suspensiones celulares muy densas y las células deben ser lavadas
muy bien para removerles todo material extra. Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos. En
este proceso, el fungus es removido del medio de crecimiento, filtrado para remover material
extraño, drenado en un secador y después es pesado.

¿Puede utilizarse la curva patrón realizada en esta práctica para determinación de otros
microorganismos?
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Es necesario más de un millón de células por ml para que una muestra pueda ser leída en el
espectrofotómetro, por lo que la turbidimetría no es un método útil para medir la concentración de
líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias y levaduras.

Que tipo de ventajas y desventajas existen en los métodos turbidimétricos y el de

determinación de la masa seca?
Método Turbidimétrico

•Ventajas: El método turbidimétrico puede realizarse tanto en el rango de luz visible, como el de
ultravioleta dando un gran espectro de acción, también se puede trabajar con densidades
microbianas bajas, de microorganismos de tamaño de unos cuantos nanómetros y es un método
rápido, también permite la valoración cuantitativa sin separar el producto de la solución.

•Desventajas: Las suspensiones con las que se trabajan no deben tener una absorbancia mayor a
0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer.

Determinación de la masa seca

• Ventajas: La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos
de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales o sólidos en
suspensión volátiles . Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración.

• Desventajas: La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no

sólo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros
extracelulares y materia orgánica absorbida. Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a
degradar son insolubles.

¿Qué es longitud de onda analítica y como se determina?

El espectrofotómetro es un instrumento empleado para medir la absorbancia de una muestra en
función de una longitud de onda determinada. Consta de las siguientes partes:

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Componentes de un espectrofotómetro
Fuente: Helena Montes Arenas

La longitud de onda es la que se utiliza para realizar la medida, es decir, la longitud de onda a la
que el analito va a absorber la luz. Estos componentes están constituidos por materiales que dejan
pasar de forma selectiva las longitudes de onda deseadas, absorbiendo el resto. Todo este proceso
se da en los selectores de longitud de onda.
La longitud de onda óptima de absorción de un analito se determina en el espectro de absorción.
El espectro de absorción es un gráfico como el que aparece en la siguiente figura, que muestra la
cantidad de radiación que una sustancia absorbe a diferentes longitudes de onda. Son únicos para
cada sustancia, y a menudo se utilizan como la "huella digital" de la sustancia.

Representación de la absorbancia frente a la longitud de onda del azul de metileno

Fuente: Helena Montes Arenas

Esta longitud de onda se obtiene midiendo la absorbancia de disoluciones que contiene al analito a
diferentes longitudes. Posteriormente se representa la absorbancia frente a la longitud de onda y
se obtiene la longitud de onda de máxima absortividad Es la medida de la cantidad de luz absorbida por una
disolución. , que corresponde con el punto máximo de absorción del analito. Ese valor de longitud de
onda es con el que se trabaja para llevar a cabo el análisis cuantitativo del analito.

¿Cuál es el procedimiento para calibrar el espectrofotómetro a utilizarse en la práctica?

-Encendemos el espectrofotómetro y configuramos para leer absorbancia
-Seleccionamos longitud de onda y marcamos 610 nm y elegimos leer absorbancia
-Luego calibramos con agua destilada, es decir presionamos el botón amarillo al momento del
calibrado y leemos la absorbancia, para el caso del agua destilada, esta siempre es cero.

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-Y empezamos a medir las concentraciones previamente preparadas, en este caso realizamos el

calibrado para cada muestra ya que por falta de material no se inactivó la solución de levadura.

9. Bibliografía (EN FORMATO APA)

● Arenas, H. M. (07 de 2018). Valoraciones Fotométricas. Obtenido de Depósito de

Investigación Universidad de Sevilla: https://idus.us.es/bitstream/handle/11441/82151
● Yuri, Martinez. (2019, 2 diciembre). Labo2. PESO HÚMEDO, PESO SECO,
TURBIDIMETRÍA. Peso seco, peso húmedo, turbidimetría. Geraadpleegd op 7 mei 2022,
van https://es.slideshare.net/yuricomartinez/labo2-peso-hmedo-peso-seco-turbidimetra

● Teoría y Práctica. (2019). ESPECTROFOTOMETRÍA. Métodos espectrofotométricos,

2019(Métodos espectrofotométricos), 1–25.
https://aulavirtual.agro.unlp.edu.ar/pluginfile.php/43546/mod_resource/content/3/Espectrofo
tometr%C3%ADa%202019%20versi%C3%B3n%20final.pdf

• (Mosquera, 2021) Mosquera, J. (2021, 21 de julio). Turbidimetría: Qué es y cómo se

mide . Cromtek. https://www.cromtek.cl/2021/07/21/turbidimetria-que-es-y-como-se-mide/
• Químico, TPL (2017, 27 de agosto). Incubadora de
Laboratorio . Tlaboratorioquimico.com. https://www.tplaboratorioquimico.com/laboratorio-
quimico/materiales-e-instrumentos-de-un-laboratorio-quimico/incubadora-de-
laboratorio.html
• Químico, TPL (2015, 22 de marzo). Centrífuga de
Laboratorio . Tlaboratorioquimico.com. https://www.tplaboratorioquimico.com/laboratorio-
quimico/materiales-e-instrumentos-de-un-laboratorio-quimico/centrifuga-de-laboratorio.html

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