Guía Lab. Bio. Molecular y Genética DBIO1071 Práctico 1 - Práctico 3

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas
Laboratorio de Biología Molecular y Genética

DBIO1071
Práctico 1 – Práctico 3
Nombre Estudiante: ______________________

Nombre Docente: ________________________
Sección: ________________________________
Laboratorios de Biología Molecular y Genética DBIO1071
PRESENTACIÓN
Bienvenida/o a la guía de prácticos de la asignatura Biología Molecular y Genética (Código DBIO 1071). En
esta guía, podrás encontrar el material que necesitas dominar para realizar cada práctico, así como las
actividades que deberás realizar en la sesión.
Lo primero que debes dominar es el programa de la asignatura. Durante tu carrera, cada asignatura tiene
un programa de trabajo para todo el semestre, el cual abarca los conceptos (la materia), los procedimientos
(métodos de trabajo y habilidades) y las actitudes que debes desarrollar durante este periodo. También
incluye información sobre la ponderación (o porcentaje) de cada evaluación y sus métodos, y la bibliografía
que debes usar.
Este documento, debes descargarlo desde la plataforma “Classroom”, al igual que otros documentos que
ahí se encuentran. Por ahora te mostramos una tabla resumen de la distribución de actividades prácticas
por unidad.
RESULTADO DE APRENDIZAJE GENERAL DE LA ASIGNATURA
Resuelve problemáticas biomédicas empleando las bases moleculares del flujo, regulación y transmisión de la información
genética en células eucariontes animal.
Unidad Resultado de Aprendizaje Actividades Prácticas
Unidad 1: Distingue los mecanismos de Práctico 1:

Biología Molecular I replicación del ADN que Introducción al Curso
permiten la conservación, Práctico 2:
variación y transmisión de la Extracción de Ácidos Nucleicos
información genética en la Práctico 3:
célula eucarionte animal. Southern Blot, Northern Blot y tipos de PCR y RT-PCR
Práctico 4:
Seminario 1 (paper con PCR, RT-PR o real time)
Práctico 5:
ADN fingerprint I (teórico)
Práctico 6:
ADN fingerprint II (ejercicios)
Unidad 2: Analiza el flujo de la Práctico 7:
Biología Molecular II información genética ADN recombinante I
durante el proceso de Práctico 8:
transcripción, traducción, y ADN recombinante II
regulación en una célula Práctico 9:
eucarionte. Seminario 2 (presentaciones: Utilización de ARNmi, CRISPR,
ChiP)
Práctico 10:
Seminario 2 diseño de transgénicos (KO animal), diseño de
transgénicos (KD vegetal), secuenciación masiva.
Unidad 3: Genética Analiza los mecanismos de Práctico 11:
transmisión hereditaria en Análisis de fenotipos y genotipos (determinación del sexo
condiciones normales y SRY)
patológicas. Práctico 12:
Corpúsculos de Barr y Alelos Múltiples
Práctico 13:
Técnicas de Citogenética
Práctico 14:
Seminario artículo “Karyotype is not dead (yet)”
Práctico 15:
Bioinformática
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Detalle de las evaluaciones y ponderaciones:
Unidad Sesión Evaluaciones y Ponderación de las

Notas
Biología Molecular I Práctico 1 Control 1 (60%) + Seminario 1 (40%)
Práctico 2
Práctico 3 30% (ponderación en el
Practico 4 componente práctico)
Práctico 5
Práctico 6
Biología Molecular II Práctico 7 Control 2 (60%) + Seminario 2 (40%)
Práctico 8
Práctico 10 componente práctico)
Genética Práctico 11 Prueba (60%) / poster o cápsula
Práctico 12 (40%)
Práctico 13
Práctico 15 componente práctico)
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PRÁCTICO 1: TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Conceptuales Técnicas de biología molecular asociadas a replicación (PCR, RT-PCR, ADN
recombinantes, etc.
Procedimentales Distinción de técnicas de biología molecular asociadas a replicación y sus
aplicaciones biomédicas
Actitudinales Demuestra capacidad argumentativa y autocrítica en el desarrollo de las
Recursos
tareas.
Participa activamente en instancias que favorecen el trabajo en equipo.
Demuestra respeto hacia el docente y sus compañeros en instancias de
trabajo grupal.
Demuestra autonomía en el aprendizaje.
Demuestra honestidad y responsabilidad en el desarrollo de las
actividades formativas y sumativas de evaluación.
INTRODUCCIÓN
El campo de la Biología Molecular estudia las macromoléculas y los mecanismos macromoleculares que
se encuentran en los seres vivos, tales como la naturaleza molecular del gen y los mecanismos de
replicación de los genes, de las mutaciones y de la expresión génica. La disciplina llamada Biología
Molecular surgió de la convergencia de los trabajos de genetistas, físicos y químicos estructurales en
un problema común: la estructura y la función del gen.
La colaboración entre físicos y biólogos proporcionaron pruebas que los genes no eran proteínas, sino
que ácido desoxirribonucleico (ADN). A esos trabajos se le sumó el conocimiento de la química
estructural para estudiar la estructura macromolecular. Se utilizó cristalografía de rayos X como un
medio para investigar la estructura molecular del ADN. Los rayos X bombardean una molécula dejando
imágenes únicas en placas fotográficas, debido a la difracción de los rayos X por la molécula.
El período clásico de la Biología Molecular se inició en 1953, con James Watson y Francis Crick quienes
reconocieron la necesidad de utilizar la cristalografía para dilucidar la estructura del ADN. Watson y
Crick colaboraron para construir un modelo de la estructura de doble hélice del ADN, con sus dos
cadenas helicoidales unidas por enlaces de hidrógeno. La técnica de cristalografía de rayos X se utilizó
ampliamente en estudios de la estructura del ADN, realizados por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin
en el Kings College de Londres.
Con esta información en la mano, la Biología Molecular cambió su enfoque hacia la forma de la
estructura de la doble hélice ayudando a la elucidación de los mecanismos de replicación genética y a
su función, las claves para entender el papel de los genes en la herencia. La investigación posterior se
basó en la idea de que el gen era una molécula de información. La secuencia lineal de bases de ácido
nucleico a lo largo de una cadena de ADN proporciona la información codificada para dirigir el orden
lineal de los aminoácidos en las proteínas. El código genético llegó a ser caracterizado como la relación
entre un conjunto de tres bases del ADN ("un codón") y uno de los veinte aminoácidos.
Se desarrollaron técnicas moleculares para investigar los problemas no resueltos y se llevó esas técnicas
a otras áreas de la Biología. En el último tiempo, la Biología Molecular ha avanzado hacia sus aspectos
genómicos. El genoma es una colección de pares de base de ácidos nucleicos dentro de las células de
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un organismo. El número de pares de bases varía ampliamente entre especies. Por ejemplo, la bacteria
Haemophilus influenzae (el primer genoma en ser secuenciado), causante de infecciones respiratorias,
tiene aproximadamente 1,9 millones de pares de bases en su genoma, mientras que el Homo sapiens
porta más de 3 mil millones de pares de bases en su genoma. La historia de la genómica es la historia
del desarrollo y uso de nuevos métodos experimentales y computacionales para la producción, el
almacenamiento y la interpretación de la información contenida en la secuencia. Frederick Sanger tuvo
un papel fundamental en esta historia de la genómica, ya que desarrolló técnicas de secuenciación
tanto para proteínas como para ácidos nucleicos. En 1975 se hizo conocido el Método de Secuenciación
de Sanger, para ácidos nucleicos. Kary Mullis, inspirado en parte por las metodologías de secuenciación
de Sanger quien desarrolló la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en1985. A mediados de 1980,
tras el desarrollo de técnicas de secuenciación, el Departamento de Energía de los Estados Unidos (DoE)
originó un proyecto para secuenciar el genoma humano (inicialmente como parte de un plan más
amplio para determinar el impacto de la radiación en el genoma humano inducida por las bombas de
Hiroshima y Nagasaki). El proyecto resultante del Genoma Humano (PGH), recibió la mayor parte de la
atención pública.
A la fecha cientos de genomas han sido secuenciados, como el del gato, el ratón, el arroz. Uno de los
resultados más impactantes de los proyectos de secuenciación fue el número total de genes en los
genomas. El genoma humano contiene 20.000 a 25.000 genes, el gato contiene 20.285 genes, el ratón
24.174, y el arroz 32.000 a 50.000. Los datos obtenidos contrastaban con las suposiciones iniciales de
que el número de genes correlaciona con la complejidad del organismo. Los éxitos de la genómica han
fomentado una serie de disciplinas incluyendo la genética del comportamiento, la biología del
desarrollo, la biología celular y evolución.
TÉCNICAS Y APLICACIONES
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La técnica de PCR se basa en la capacidad del ADN polimerasa para sintetizar una nueva hebra de ADN
complementaria a la cadena molde. Debido a que el ADN polimerasa puede añadir un nucleótido sólo
sobre un grupo 3'-OH preexistente, se necesita de un partidor (primer o cebador) al cual se puede
añadir el primer nucleótido. Este requisito hace que sea posible delinear una región específica de la
secuencia de molde que el investigador quiere amplificar. Al final de la reacción de PCR, la secuencia
específica se acumulará en miles de millones de copias denominados amplicones. PCR es una
herramienta relativamente simple y de bajo costo que se puede utilizar para centrarse en un segmento
de ADN y copiarlo en miles de millones de veces más. PCR se utiliza todos los días para diagnosticar
enfermedades, identificar las bacterias y los virus, para encontrar a los delincuentes utilizando
muestras de las escenas del crimen, determinación de paternidad y de muchas otras maneras.
Huella dactilar de ADN (ADN Fingerprint)

Cualquier tipo de microorganismo puede identificarse por examen de secuencias de ADN únicas para
esa especie. Pero ¿cómo se puede identificar los individuos dentro de una especie? Sólo una décima
parte de ADN (aproximadamente 3 millones de bases) difiere de una persona a otra. Los científicos
pueden utilizar estas regiones variables para generar un perfil de ADN de un individuo, utilizando
muestras de sangre, de huesos, de cabello y otros tejidos del cuerpo. Los científicos forenses escanean
13 regiones de ADN, o loci, que varían de persona a persona y utilizan los datos obtenidos para crear
un perfil de ADN de ese individuo. Hay una probabilidad muy baja de que otra persona tenga el mismo
perfil de ADN para un conjunto particular de 13 regiones. Los científicos encuentran esos marcadores
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en una muestra de ADN mediante el diseño de pequeñas piezas de ADN (sondas) que buscan y se unen
a una secuencia de ADN complementaria en la muestra. Una serie de sondas unidas a una muestra de
ADN crea un patrón distintivo para un individuo. Por ejemplo, los científicos forenses comparan estos
patrones de ADN para determinar si la muestra del sospechoso coincide con la muestra de la evidencia.
Clonamientos
La clonación es la creación de un organismo que es una copia genética exacta de otro. El término
clonación describe una serie de procesos diferentes que se pueden utilizar para producir copias
genéticamente idénticas de una entidad biológica. El material copiado, que tiene la misma composición
genética al original, se conoce como un clon. Los investigadores han clonado una amplia gama de
materiales biológicos, incluyendo genes, células, tejidos y organismos enteros. En la naturaleza, algunas
plantas y organismos unicelulares, tales como bacterias, pueden producir descendencia genéticamente
idéntica a través de un proceso llamado reproducción asexual. En la reproducción asexual, un nuevo
individuo se genera a partir de una copia de una sola célula del organismo padre. Los clones naturales,
también conocidos como los gemelos idénticos, se producen en los seres humanos y otros mamíferos.
Estos gemelos se producen cuando un óvulo fertilizado se divide, creando dos o más embriones que
portan ADN casi idéntico. Los gemelos idénticos tienen casi la misma composición genética, pero son
genéticamente diferentes de cualquiera de los padres. Existen tres tipos diferentes de clonación
artificial: la clonación de genes, la clonación reproductiva y la clonación terapéutica.
1. La clonación de genes: produce copias de genes o segmentos de ADN. El procedimiento consiste en

insertar un gen de un organismo, a menudo referido como "ADN extraño", en el material genético de
un portador llamado vector. Los ejemplos de vectores incluyen bacterias, células de levadura, virus o
plásmidos, que son círculos de ADN pequeños transportados por bacterias. Después de que el gen se
inserta, el vector se coloca en condiciones de laboratorio que incitan a multiplicar, lo que resulta en
que el gen está siendo copiado muchas veces.
2. La clonación reproductiva: produce copias de animales enteros. Para ello, los investigadores extraen
una célula somática madura tal como una célula de la piel o una célula de la ubre de un animal que se
desea copiar. A continuación, se transfiere el ADN de las células somática del animal donante a un
óvulo, u ovocito, que se le ha removido el núcleo. Posteriormente, el huevo puede desarrollarse en el
tubo de ensayo en fase inicial de un embrión y luego se implanta en el útero de una hembra de animal
adulto. En última instancia, la hembra adulta da a luz a un animal que tiene el mismo constituyente
genético que el animal que donó la célula somática. Este animal joven es referido como un clon. Un
ejemplo de aplicación de este tipo de clonación es crear clones para construir animales de poblaciones
de especies en peligro, o incluso posiblemente extintas.
3. La clonación terapéutica: produce células madre de embriones para experimentos encaminados a

la creación de tejidos para reemplazar tejidos dañados o enfermos. Implica la producción de células
madre embrionarias con el mismo ADN que la célula donante. Estas células madre se pueden utilizar
en experimentos dirigidos a la comprensión de la enfermedad y el desarrollo de nuevos tratamientos
para la enfermedad. Hasta la fecha, no hay evidencia de que embriones humanos se hayan producido
para la clonación terapéutica. La fuente más rica de células madre embrionarias es un tejido formado
durante los primeros cinco días después de que el óvulo ha comenzado a dividirse. En esta etapa de
desarrollo, llamado blastocisto, el embrión consiste en un grupo de aproximadamente 100 células que
pueden convertirse en cualquier tipo de célula. Las células madre se obtienen de embriones clonados
en esta etapa del desarrollo, lo que resulta en la destrucción del embrión mientras que todavía está en
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el tubo de ensayo. Los investigadores esperan usar las células madre embrionarias, que tienen la
capacidad única para generar prácticamente todos los tipos de células en un organismo, para crecer
los tejidos en el laboratorio, para cultivar tejido sano y poder sustituir tejidos dañados o enfermos.
Además, puede ser posible obtener más información acerca de las causas moleculares de la
enfermedad mediante el estudio de células madre embrionarias (Figura 1).
Figura 1: Clonación reproductiva y terapéutica. Las células de un tejido adulto se utilizan para la clonación reproductiva o para
generar células ES personalizadas (También denominada clonación terapéutica). (Extraído de Iwasa y Marshall, 2020).
ADN recombinante:
Es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación
e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal,
bacteria u hongo) o un virus produzcan una proteína que naturalmente no produce. Estas técnicas se
emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala, ya que podemos hacer que una
bacteria produzca una proteína humana y lograr una superproducción. Como las bacterias se
multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de proteínas, es posible lograr
una sobreproducción de la proteína deseada. A esto justamente se dedica la biotecnología, es decir a
la utilización de organismos vivos o de sus productos con fines prácticos. El desarrollo de la tecnología
del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas de investigación:
1) El conocimiento de las enzimas de restricción
2) La replicación y reparación de ADN
3) La replicación de virus y plásmidos
4) La síntesis química de secuencias de nucleótidos
5) Un ejemplo de esta tecnología al servicio de la medicina es el caso de la insulina humana, que
actualmente es producida por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados
biorreactores. La insulina humana hecha en bacterias presenta una estructura completamente
idéntica a la de la molécula natural. En estudios químicos y farmacológicos, disponibles
comercialmente la insulina humana recombinante ha demostrado ser indistinguible de la
insulina pancreática humana (Figura 2).
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Figura 2: Producción de insulina humana mediante ADN recombinante (Extraído de Iwasa y Marshall, 2020)
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Terapia Génica:
Es una técnica para la corrección de genes defectuosos responsables del desarrollo de enfermedades.
Los investigadores pueden utilizar uno de varios métodos para corregir los genes defectuosos:
1) Un gen normal se puede insertar en una ubicación específica dentro del genoma para
reemplazar un gen no funcional. Este enfoque es más común.
2) Un gen anormal puede ser remplazado por un gen normal a través de la recombinación
homóloga.
3) El gen anormal podría ser reparado a través de mutación inversa selectiva, que devuelve el gen
a su función normal.
Una partícula portadora denominada vector debe ser utilizada para administrar el gen terapéutico a
las células blanco del paciente. Actualmente, el vector más común es un virus que ha sido alterado
genéticamente para transportar ADN humano normal. Los virus han desarrollado una forma de
encapsular y entregar sus genes a las células humanas de una manera patógena. Los científicos han
tratado de tomar ventaja de esta capacidad y manipular el genoma del virus para eliminar genes
patógenos e insertar genes terapéuticos.
Ejemplo de terapia génica es la utilizada en Francia para la enfermedad β-talasemia perteneciente a un

grupo de enfermedades hereditarias más comunes en el mundo. El trastorno es causado por una
mutación recesiva que conduce a la no producción o reducción de la producción de β-globina, que
constituye 2 de las 4 cadenas de globina de la hemoglobina humana. Se observa como una menor
cantidad de glóbulos rojos maduros y anemia. La terapia génica para β-talasemia usa vectores
lentivirales para transducir el gen de la β-globina humana en células purificadas de sangre y de médula
del paciente.
OTRAS TÉCNICAS
Electroforesis
Esta técnica separa fragmentos de ADN según su tamaño relativo. Los fragmentos de ADN se colocan
en un gel de agarosa, que se encuentra inmerso en un compartimiento con una solución tampón
conductora. Una corriente continua se pasa entre los electrodos de cada extremo del compartimiento.
Los fragmentos de ADN presentan carga negativa, por lo que en presencia de un campo eléctrico son
atraídos hacia el polo positivo.
La matriz de agarosa actúa como un colador molecular a través del cual los fragmentos más pequeños
de ADN se mueven más fácilmente que los más grandes. De esta forma, los fragmentos más pequeños
migrarán más lejos que los más grandes. Los fragmentos del mismo tamaño permanecen juntos y
migraran en la misma posición o "banda" de ADN.
Los fragmentos de ADN en el gel no pueden ser observados a simple vista porque el ADN no posee
color, una vez finalizada la electroforesis el gel se sumerge en una solución (bromuro de etidio o ADN
Bio-Safe) para teñir las bandas de ADN. Esta técnica también es de utilidad para la separación de
proteínas en donde se utilizan geles de poliacrilamida.
Southern blot
Es una técnica de laboratorio utilizada para detectar una secuencia específica de ADN en una muestra
de sangre o tejido. Una enzima de restricción se utiliza para cortar una muestra de ADN en fragmentos
que se separan mediante electroforesis en gel. Los fragmentos de ADN son transferidos del gel a la
superficie de una membrana. La membrana se expone a una sonda de ADN marcada con un marcador
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radiactivo o químico. Si la sonda se une a la membrana, entonces la secuencia de la sonda está presente
en la muestra (Figura 3).
Figura 3: Esquema representativo de cada uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern blot. Obtención del ADN
genómico y digestión con enzimas de restricción, electroforesis, transferencia, hibridación específica con una sonda y
detección de la secuencia de interés (Extraído de Salazar et al., 2016).
Northern blot
Es una técnica que se utiliza para la detección de secuencias de ARN específica desde una muestra de
sangre o tejido. Las moléculas de ARN en una muestra se separan por tamaño mediante electroforesis
en gel de agarosa. Los fragmentos de ARN del gel son transferidos a una membrana. La membrana se
expone a una sonda de ADN marcada química o radioactivamente. Si la sonda se une a la membrana,
entonces la secuencia complementaria de ARN está presente en la muestra. Con esto entonces estamos
detectando un gen. Una sonda es una secuencia de ADN o ARN de cadena simple que se utiliza para
encontrar su secuencia complementaria en el genoma de una muestra. La sonda se coloca en contacto
con la muestra bajo condiciones que permitan que la secuencia de la sonda se hibride con su secuencia
complementaria. La sonda está marcada con un marcador radiactivo o químico que permite
visualizarla. De manera similar, se utilizan anticuerpos marcados para sondear una muestra para
detectar la presencia de una proteína específica.
Dot blot
Es una técnica de biología molecular para detectar biomoléculas por cromatografía. Corresponde a una
simplificación de los métodos Northern blot, Southern blot o Western blot.
En esta técnica una gota de la muestra a analizar, la cual contiene la molécula para ser detectada se
aplica directamente sobre una membrana, observándose una mancha (blot). El dot blot sólo puede
confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula, la cual puede ser detectada posteriormente con
sondas de ADN, ARN o anticuerpos (Figura 4).
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Figura 4: Esquema de la visualización del dot blot y slot blot. El tipo de soporte que se utiliza durante el proceso de fijación de
los ácidos nucleicos en una membrana o filtro es lo que determina la forma en que se visualiza esta técnica molecular. A)
Soporte que se utiliza para realizar un dot blot, en que los orificios están en forma de puntos. B) Soporte que se utiliza para
realizar un slot blot, en que los orificios se encuentran en forma de líneas. (Extraído de Salazar et al., 2016).
Hibridación in situ (HIS)

Es una técnica de laboratorio que consiste en marcar una hebra sencilla de ARN o ADN denominada
sonda y permitir que se empareje con su secuencia complementaria en el ARN o el ADN presente en
una muestra de tejido o de cromosomas. La sonda está marcada con una sustancia trazadora química
o radiactiva por lo que su unión puede ser visualizada.
Bibliografía
1. Alberts, B., Lewis, J., y Roberts, K. (2011). Introducción a la biología celular. (5° ed.). Médica
Panamericana. Disponible en Proyecto Bibliografía Digitalizada.
2. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., y Walter, P. (2010). Biología molecular
de la célula. (5° ed.). Ediciones Omega S.A. Disponible en Proyecto Bibliografía Digitalizada.
3. Iwasa, J. y Marshall, W. (2020). Karp. Biología celular y molecular: conceptos y experimentos.
(7ª Ed.) McGraw-Hill. Disponible en Libros Electrónicos Access Medicina
4. Klug, W., Cummings, M. y Spencer, Ch. (2006). Conceptos de genética. (8ª Ed.) Pearson Prentice
Hall. Disponible en Proyecto Bibliografía Digitalizada.
5. Lodish, H. F., Berk, A. y Darnell, J. E. (2002). Biología celular y molecular. (4ª Ed.) Médica
Panamericana.
6. Salazar A., Sandoval A. y Armendáriz J. (2016). Biología Molecular. Fundamentos y aplicaciones
en las ciencias de la salud, 2e McGraw Hill/Interamericana Editores. Disponible en Libros
Electrónicos Access Medicina.
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PRÁCTICO 2: EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

recombinantes, etc.
Recursos
tareas.
trabajo grupal.
Elección del método de extracción

La extracción de ácidos nucleicos es el primer paso para la mayoría de los estudios en biología molecular
y para las técnicas del ADN recombinante. En la actualidad, se dispone de múltiples metodologías de
extracción, lo que permite que los biólogos moleculares puedan seleccionar la técnica que más se
ajuste a sus necesidades. La elección del método de extracción suele realizarse en función de los
siguientes criterios:
• Tipo de ácido nucleico que se va a extraer: ADN de cadena sencilla (ssADN), dsARN, ARN total,
ARN mensajero (ARNm), ARN de interferencia (ARNi) o ARN ribosomal (ARNr).
• Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plantas, procariotas o virus.
• Fuente del ácido nucleico: cultivo celular, tejido (por lo general biopsia), sangre (leucocitos),
expectoración, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.
• Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído: según el uso que vaya a tener el ácido
nucleico, los requerimientos de rendimiento, pureza y tiempo de extracción variarán de
acuerdo con la metodología que se vaya a aplicar, como retrotranscripción, PCR, clonación,
Northern blot, Southern blot, entre otros.
En el área médica, el ADN genómico suele extraerse para pruebas de PCR cualitativa o Southern blot,
diagnóstico, determinación de variantes alélicas o clonación en vectores. En cambio, el ARN se extrae
para realizar una reacción de retrotranscripción y luego una PCR que determine los niveles de expresión
génica en condiciones y momentos determinados. El ADN mitocondrial, por su parte, se extrae para
diagnóstico de enfermedades mitocondriales o para análisis evolutivo; sin embargo, el aislamiento de
este ADN conlleva un proceso específico.
Fuente del ácido nucleico

En teoría, el ADN/ARN puede obtenerse de cualquier célula/virus que lo contenga; sólo los eritrocitos
maduros no se consideran una fuente de ADN/ARN, ya que son anucleados. Las fuentes posibles de
material para la extracción de los ácidos nucleicos son: leucocitos (sangre), suero, plasma, biopsia,
orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido amniótico, esputo, semen, raspado bucal,
folículo capilar, etc. Por acuerdos éticos se prefieren las muestras no invasivas frente a cualquier tipo
de biopsia o toma invasiva de líquido.
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Cuadro 1: Selección del ácido nucleico a extraer. Se marca con una “X” la elección recomendada del
ácido nucleico y fuente de este según la enfermedad de interés. Las patologías se han agrupado en
alteraciones genéticas, enfermedades multifactoriales y enfermedades adquiridas o infecciosas.
(Extraído de Salazar et al., 2016).
Selección del tipo de muestra ADN Leucocitos Biopsia Suero, Mucosa Suero, Suero, LCR, suero,
plasma oral biopsia biopsia biopsia,
orina,
expectoración
ADN ARN ADN ARN ADN ARN ADN ARN ADN
VIRAL bacteriano
Alteraciones Distrofia musc. X X
genéticas Duchenne
monogénicas Anemia celular X X
falciforme
Hipercolesterolemia X X
Def. de X X
alfaaminotripsina
Enfermedades Diabetes X* X**
poligénicas o Cirrosis X* X**
multifactoriales Cáncer X* X**
Artritis reumatoide X* X**
Enfermedades VHB X
adquiridas VHC X
VIH X
Tuberculosis X
Aspergillus X
* Si se busca la mutación génica implicada en el desarrollo de la patología, se recomienda la extracción de ADN de leucocitos.
** Si se investigan los niveles de expresión génica en determinado momento se optaría por una biopsia como fuente de ARNm
Con independencia del tipo de muestra utilizada para la obtención de ácidos nucleicos, las técnicas de
extracción son minuciosas e involucran los siguientes pasos: lisis de la célula, separación, purificación,
precipitación, lavado y disolución. Durante el proceso de extracción y en particular en la extracción del
ARN, que es una molécula más lábil ya que es de cadena sencilla, debe considerarse el uso de material
nuevo, estéril, libre de ADNsas y ARNsas, y el uso de guantes para impedir la degradación de la muestra
con nucleasas provenientes del ambiente (pelo, sudor, saliva, polvo), así como para impedir cualquier
contaminación con ácidos nucleicos exógenos. Todo el proceso debe realizarse en frío; así, con los
reactivos y las muestras a 4 °C antes y durante el proceso, se conserva la muestra congelada hasta justo
antes de iniciar la extracción.
Las técnicas comunes de extracción de ácidos nucleicos son muy diversas e incluyen procesamientos
químicos y físicos que las diferencian; cada una presenta ventajas y desventajas, que se agrupan en el
Cuadro 2.
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Cuadro 2: Ventajas y desventajas de diversos métodos de extracción de ácidos nucleicos. De las

diversas técnicas disponibles para la extracción de ácidos nucleicos, algunas como la extracción por
cloruro de cesio se consideran ideales para ADN plasmídico. Algunas otras, como la extracción fenol-
cloroformo, se emplean para cualquiera de los ácidos nucleicos (se realizan ligeras modificaciones para
la extracción de ARN). (Extraído de Salazar et al., 2016).
Método Ventajas Desventajas

Fenol-cloroformo
(ADN) e
• Buen rendimiento • El producto purificado requiere ser
isotiocianato de • Permite el aislamiento de todo
precipitado con alcaloides
tipo de ácido nucleico
guanidina/fenol- • El fenol es tóxico y caustico
cloroformo (ARN)
Cloruro de cesio
(ADN plasmídico) • Excelente método para obtención • Laborioso y prolongado
de ADN plasmídico • BrEt es cancerígeno
• Alta pureza de los ácidos • Requiere eliminación de CsCI

• Indispensable el uso de material
nucleicos especializado
• Requiere muy pocas
manipulaciones, lo que elimina el
riesgo de contaminaciones con
ARNasas
Cromatografía • La recuperación del ácido nucleico
por exclusión de • Tiempos de separación cortos y
purificado es ineficiente (pérdida de
tamaño (ADN o bien definidos muestra)
ARN)
• Alta sensibilidad
• Reproducible
Salting-out (ADN) • Reactivos inocuos • Requiere una cantidad grande de muestra
• Material económico para obtener cantidades adecuadas de
ADN
Chelex (ADN) • Previene la degradación del ADN • Se obtiene ssDNA, el cual no puede usarse
por sus agentes quelantes para RFLPs
• No hay pérdidas considerables de
ADN
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Actividad 1: Extracción de ADN.
1. Agregar ¼ del plátano y agua destilada a un mortero o licuadora según disponibilidad. Moler con
un tenedor y luego con el pistilo mezclar y continuar moliendo hasta formar una pasta homogénea.
2. Paralelamente en un vaso precipitado, pese 3 gramos de detergente líquido, 2 gramos de NaCl y
agregue 10 ml de agua destilada (si es necesario agregue más agua en pequeñas porciones). Se
revuelve hasta que el detergente este completamente disuelto en el agua.
3. Agregar dos espátulas del homogenizado de plátano a la solución del paso 2, adicione a esta
mezcla buffer de lisis hasta completar 20 ml, revuelva por 5 minutos.
4. Poner el papel filtro en un embudo sobre otro vaso precipitado o tubo y filtre la mezcla formada
en el paso 3.
5. Llenar un tubo de ensayo con 5 ml de etanol muy frio. Luego agregue lentamente el filtrado
obtenido en el paso 4. Se formarán 2 fases líquidas, espere de 3 a 5 minutos y verá el ADN
precipitar (blanco/transparente), puede sacarlo de la solución con una varilla de vidrio.
Posteriormente al desarrollo de la Actividad 1, responda las siguientes preguntas:
1. De acuerdo con sus conocimientos de Biología celular, ¿por qué es necesario moler el plátano (o
la fruta que utilizaron)?
2. ¿Por qué es necesario filtrar?
3. Explique el efecto del detergente.
4. Explique el efecto de la sal.
5. ¿Por qué la molienda y filtración se realizan a temperatura ambiental?
6. Si usted tuviera que asegurar la separación del ADN desde los nucleosomas, ¿qué procedimiento
casero utilizaría?
7. ¿Cuál es el efecto del etanol frío en la separación del ADN?
8. El ADN que usted observa al final de su experiencia ¿es ADN codificante, no codificante o ambos?
Explique.
Bibliografía
4. Salazar A., Sandoval A. y Armendáriz J. (2016). Biología Molecular. Fundamentos y
aplicaciones en las ciencias de la salud, 2e McGraw Hill/Interamericana Editores. Disponible
en Libros Electrónicos Access Medicina.
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PRÁCTICO 3: PCR Y TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

recombinantes, etc.
Recursos
tareas.
trabajo grupal.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, polimerase chain reaction)

Se considera una de las técnicas más sensibles y específicas de las pruebas moleculares. En 1986, el
doctor Kary Mullis desarrolló esta técnica en los laboratorios de CETUR Corporation, en Estados Unidos,
lo que le hizo valedor del premio Nobel en 1993. La idea se fundamentó en la necesidad de obtener un
gran número de copias de fragmentos específicos de ácido desoxirribonucleico (ADN) de manera rápida
y económica, los cuales no podían obtenerse por otros métodos hasta ese momento. Esta técnica se
basa en una replicación exponencial in vitro de una molécula de ADN genómico (gADN) o ADN
complementario (cADN), mediante ciclos repetidos, que constan de tres temperaturas. En cada uno de
los ciclos las moléculas se duplican hasta que los reactivos se agotan.
La longitud del producto amplificado la delimitan los iniciadores, también llamados primers, partidores
u oligonucleótidos, de cuyo diseño adecuado depende el éxito de la PCR. Los iniciadores deben ser
específicos, no formar estructuras secundarias ni hibridaciones inespecíficas entre ellos u otra parte de
la cadena.
Componentes de la reacción de PCR.

Para que se lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa se requiere una cadena de gADN o
cADN que sirva de molde, una enzima ADN polimerasa, Mn+2 o Mg+2 necesarios como cofactores para
la enzima, dNTP o desoxinucleótidos y oligonucleótidos para el inicio de la síntesis. Estos reactivos se
mezclan y se someten en el termociclador a los ciclos de amplificación.
Esquema convencional de PCR

1. Inicio de la desnaturalización
Es necesaria una temperatura de 95°C para la desnaturalización de la doble cadena de ADN, en el caso
del ADN genómico, o el rompimiento de estructuras secundarias, en el cADN. Esta temperatura se
mantiene por 5 min al inicio de la PCR (Figura 5).
2. Ciclos de amplificación
Un ciclo típico de PCR convencional consta de las tres temperaturas siguientes:
• 95°C: desnaturalización por unos 30 segundos.
• 55 a 60°C: alineación por 30 a 40 segundos.
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• 72°C extensión, según la longitud del producto que se va a amplificar, considerando la adición
de 1000 nucleótidos en 60 segundos.
Este ciclaje de temperatura se repite de forma continua por 30 a 35 ocasiones. Cada temperatura
cumple con una función específica.
3. Desnaturalización
Se realiza a 95°C y tiene como objetivo desnaturalizar la doble cadena de ADN, lo que permite el acceso
de los primers a la cadena molde en sus secuencias complementarias. Esta temperatura se mantiene
por 30 segundos.
4. Alineación
En esta fase, la temperatura se encuentra en un rango entre 55 y 65°C, en el cual la mayoría de los
iniciadores hibridan; así, se genera la energía cinética necesaria para que los iniciadores busquen en las
cadenas de ADN su secuencia complementaria y formen los puentes de hidrógeno con la cadena molde,
dejando el extremo 3′OH disponible y listo para la adición de los nucleótidos consecutivos por la ADN
polimerasa.
5. Extensión
Se produce a la temperatura óptima para el funcionamiento de la ADN polimerasa empleada, por lo
que la temperatura para la PCR dependerá de la enzima a utilizar. En el caso de la Taq polimerasa, la
temperatura óptima es de 72°C.
Figura 5: Esquema convencional de un PCR. Los ciclos del PCR constan de los pasos de desnaturalización, alineación y extensión
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6. Amplificación final
Una vez terminados los ciclos designados para la PCR, la reacción se somete a un ciclo más de
temperatura de extensión (72°C) y se mantiene por 5 min, lo que permite que la polimerasa termine la
extensión de los productos de PCR que quedaron incompletos.
7. Almacenamiento temporal
Durante la programación de los ciclos de la PCR se programa también un ciclo final de 4°C por varias
horas, lo que permite conservar los productos de PCR a baja temperatura hasta que se retiren los tubos
de reacción del equipo evitando así su posible degradación.
Fases de la PCR
Fase exponencial: en esta fase los reactivos se encuentran en concentraciones adecuadas todavía, lo
que asegura que exactamente el doble de producto de PCR se acumule en cada ciclo (si se asume 100%
de eficiencia de reacción). En este punto la reacción es precisa y específica (Figura 6).
Figura 6: Fases de una reacción en cadena de la polimerasa. La reacción de PCR consta de tres fases, según la concentración
de los reactivos y los productos de PCR que cambien a lo largo de la totalidad de los ciclos que se deje correr la reacción
Fase lineal: este punto de la reacción es altamente variable, ya que el consumo de los reactivos que
participan en la reacción ha disminuido notablemente su concentración inicial y por tanto la dinámica
de reacción se enlentece, mientras algunos productos de PCR pueden empezar a degradarse.
Fase de saturación o plateau: éste es el punto de detección en gel para la PCR en punto final. La
reacción se detiene y los productos de PCR no se sintetizan más. Si los ciclos del PCR se prolongan
después de este punto, los productos de PCR tenderán a degradarse.
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Técnicas de Hibridación
La hibridación de ácido nucleico comprende varias técnicas relacionadas basada en la observación de
que dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla con secuencia de bases complementaria
pueden formar un hibrido de doble cadena. Considérese una situación en la que se tiene una mezcla
de cientos de fragmentos de ADN de longitud y composición general de bases idénticas que sólo
difieren unos de los otros por su secuencia de bases. Por ejemplo, asúmase que uno de los fragmentos
de ADN constituye una porción del gen para la globina beta y el resto contiene genes no relacionados.
La única manera de distinguir entre el fragmento que codifica el polipéptido globina beta y todos los
demás es realizar un experimento de hibridación molecular con moléculas complementarias como
sondas.
Southern blot
Esta técnica la desarrolló Edwin Southern en 1975, es una estrategia estándar para analizar ADN
previamente digerido con enzimas de restricción y se utiliza para determinar la presencia de un gen o
fragmentos del ADN específicos en una mezcla de ácidos nucleicos extraídos con anterioridad.
Se basa en la aplicación de dos procesos fundamentales: la desnaturalización o separación de las
cadenas complementarias del ADN y la hibridación o unión de dos cadenas complementarias. Este
fundamento es compartido por todas las técnicas de hibridación.
Procedimiento
Primero se aísla el ADN de cualquier célula del organismo excepto de glóbulos rojos, ya que carecen de
núcleo. Para el análisis molecular de un paciente, el ADN puede obtenerse de linfocitos. Sin embargo,
la extracción puede hacerse también de otras fuentes: cultivos celulares, células de líquido amniótico,
vellosidades coriónicas o cualquier órgano biopsiado. Una vez extraído el ADN, se digiere con enzimas
de restricción (una o dos) y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de agarosa, de
acuerdo con su carga/masa. En algunas ocasiones se utilizan geles de acrilamida cuando los fragmentos
que se van a separar son muy pequeños. En este procedimiento electroforético, las muestras se
someten a un campo eléctrico; como los fragmentos de ADN tienen carga negativa se mueven hacia el
electrodo positivo y los fragmentos más pequeños migran con más rapidez.
Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse mediante su tinción con bromuro de etidio u otro
compuesto intercalante. En este momento el procedimiento no es informativo, debido a que el
fragmento de interés se encuentra inmerso en millones de fragmentos creados por las enzimas de
restricción. Con posterioridad, el ADN se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, mediante un
proceso químico, generalmente por tratamiento con álcalis. A continuación, los fragmentos se
transfieren del gel a un soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa o de nailon. Las membranas
de nailon presentan algunas ventajas; mayor capacidad de unión de ácidos nucleicos (400 ug/cc2),
mayor resistencia y vienen cargadas positivamente o con carga neutra. Existen diferentes métodos para
la transferencia, como la capilaridad, el vacío o la electrotransferencia. Es importante señalar que la
finalidad de la transferencia es crear una réplica de lo que se tenía en el gel, ahora en un soporte mucho
más sólido, como es una membrana (figura XX). Por último, para identificar uno o más fragmentos entre
millones, se utiliza una sonda específica marcada con alguna molécula reportera (por ejemplo,
“radiactividad”, 32P-dCTP). La sonda se pone en contacto con la membrana y en aquellos lugares en
donde la sonda encuentre su secuencia complementaria se pegará, proceso conocido como
hibridación. La sonda emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante un proceso de revelado con
placas de rayos X, la emisión de la sonda corresponderá únicamente al fragmento de interés (Figura 7)
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Esta técnica ha sido de gran utilidad para identificar genes asociados con enfermedades de transmisión
genética, e identificar mutaciones, como rearreglos, deleciones y dosis génica en caso de portadores.
Figura 7: Determinación de la ubicación de los fragmentos de ADN específicos en un gel mediante una transferencia Southern.
(Extraída de Iwasa y Marshall, 2020)
Marcaje de las sondas

Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general con fósforo 32 (32P) o enzimáticamente
(biotina, digoxigenina, etc). Una ventaja de los sistemas enzimáticos es que, una vez marcada la sonda,
su vida media es muy larga (meses), mientras que el marcaje radiactivo es más corto (para 32P, de 15
días). Las sondas pueden marcarse en un extremo o a lo largo de toda la cadena. Para marcar en un
extremo puede utilizarse la enzima polinucleótido cinasa (que introduce un único nucleótido marcado
en el extremo 5′ de la sonda) o la enzima transferasa terminal (que introduce varios nucleótidos
marcados en el extremo 3′ de la sonda).
El marcaje en toda la sonda se realiza por el procedimiento de nick traslation (Figura 8). En este método
se combinan dos actividades enzimáticas:
Actividad ADNsa 1, que suprime un nucleótido al azar de una de las dos cadenas de la sonda.
Actividad de ADN polimerasa, que, a partir del hueco dejado en la cadena de ADN por la ADNsa 1, va
incorporando nuevos nucleótidos por complementariedad (entre los que están marcados), tomando
como molde la otra cadena de ADN intacta.
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Figura 8: Marcaje de una sonda del ADN por nick translation. En el primer
paso de la reacción, la enzima ADNsa 1 produce una pequeña rotura (nick)
en una de las cadenas del ADN. A partir de ésta, la ADN polimerasa 1 añade
nucléotidos al extremo 3′ OH generados. Dicha enzima tiene, además,
actividad de exonucleasa 5′-3′, que libera nucleótidos del 5′ del nick. La
eliminación de nucleótidos del extremo 5′ y la adición de nuevos
nucleótidos al extremo 3′ provoca el movimiento del nick a lo largo del ADN
(nick translation). La sustitución de uno o más de los nucleótidos que van a
ser incorporados de nuevo por nucléotidos marcados radiactivamente
origina la formación de moléculas marcadas (sondas) (Extraído de Salazar
et al., 2016).
Northern Blot
Es una técnica que se utiliza para la detección de secuencias de ARN específica desde una muestra
de sangre o tejido. A diferencia del Southern blot, con esta técnica no se utilizan enzimas de
restricción, ya que las moléculas de ARN son más pequeñas y para su análisis no requieren su
fraccionamiento.
Las moléculas de ARN se separan por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. Los
fragmentos de ARN del gel son transferidos a una membrana. La membrana se expone a una sonda
de ADN marcada química o radioactivamente. Si la sonda se une a la membrana, entonces la
secuencia complementaria de ARN está presente en la muestra. Con esto entonces estamos
detectando un gen (Figura 9).
Esta técnica es una herramienta muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica
(ARNm) y de su regulación, ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la abundancia
de especies del ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar condiciones clínicas
normales o patológicas.
Figura 9: Pasos en la transferencia de ARN mediante

Northern Blot.
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Bibliografía
4. Salazar A., Sandoval A. y Armendáriz J. (2016). Biología Molecular. Fundamentos y
aplicaciones en las ciencias de la salud, 2e McGraw Hill/Interamericana Editores. Disponible
en Libros Electrónicos Access Medicina.
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Guía Lab. Bio. Molecular y Genética DBIO1071 Práctico 1 - Práctico 3

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Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas

Laboratorio de Biología Molecular y Genética

Nombre Estudiante: ______________________

RESULTADO DE APRENDIZAJE GENERAL DE LA ASIGNATURA

Unidad 1: Distingue los mecanismos de Práctico 1:

Detalle de las evaluaciones y ponderaciones:

Unidad Sesión Evaluaciones y Ponderación de las

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Cuadro 2: Ventajas y desventajas de diversos métodos de extracción de ácidos nucleicos. De las

Método Ventajas Desventajas

de ADN plasmídico • BrEt es cancerígeno

• Alta pureza de los ácidos • Requiere eliminación de CsCI

Salting-out (ADN) • Reactivos inocuos • Requiere una cantidad grande de muestra

• Material económico para obtener cantidades adecuadas de

por sus agentes quelantes para RFLPs

• No hay pérdidas considerables de

Actividad 1: Extracción de ADN.

Posteriormente al desarrollo de la Actividad 1, responda las siguientes preguntas:

PRÁCTICO 3: PCR Y TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, polimerase chain reaction)

Componentes de la reacción de PCR.

Esquema convencional de PCR

Marcaje de las sondas

Figura 9: Pasos en la transferencia de ARN mediante

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