Desarrollo de un método cromatográfico para la determinación de Evaluación de las condiciones químicas e instrumentales para la

derivados nítricos residuales del uso de armas de fuego medición y cuantificación de los iones nitratos y nitritos por cromatografía
Luis Parra ,1 Ana Cáceres 1, Ronald Mavarez2,
1
Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias, Departamento de Química. 2Cuerpo de
Investigaciones Científicas Penales y Criminalística (CICPC), Laboratorio de criminalística. Correo:
luisparra-92@hotmail.com
Resumen
En esta investigación se evaluó la distribución de los iones nitrato y nitrito en
cromatografía iónica, para el desarrollo de un método aplicable a muestras con
residuos de arma de fuego. Se evaluaron los parámetros: pH de la fase móvil
(10,6), velocidad de flujo (0,8 mL/min) y volumen de inyección de muestra (50
µL) con la columna Ion Pac AS9-SC. Se logró separar los iones de interés en un
amplio rango de concentraciones, sin interferencias de los otros iones presentes
en la muestra. Se evaluaron los parámetros α, N (1508, y Rs (2,170).
Objetivo General
Desarrollar un método cromatográfico para la determinación de los iones nitratos
y nitritos como residuos del uso de armas de fuego.
Objetivos Específicos
1. Evaluar la distribución de los iones nitratos y nitritos empleando una columna
de intercambio iónico.
2. Optimizar las condiciones químicas e instrumentales para la medición y
cuantificación de los iones nitratos y nitritos por cromatografía iónica.
3. Establecer los parámetros de calidad analítica del método cromatográfico
desarrollado.
4. Determinar la concentración de los iones nitratos y nitritos en prendas de vestir
expuestas al uso de armas de fuego.
Introducción
Los residuos de disparo son partículas microscópicas que salen de la boca del
arma de fuego cuando el proyectil es disparado, y generalmente están formados
por gránulos de pólvora parcialmente quemados (nitritos) o pólvora cruda
(nitratos), así como partículas de elementos químicos tales como plomo, bario,
cobre y antimonio, y otros menos abundantes como hierro, cinc, silicio, azufre,
potasio, aluminio, estaño, magnesio, níquel, cromo, mercurio y titanio.1 Estas
partículas quedan depositadas sobre las manos de la persona que acciona el arma,
en las prendas de vestir y en el arma de fuego, por tanto, su presencia es indicativa
de que se ha producido la descarga de la misma.
En este sentido, para poder llevar a cabo el análisis de sustancias químicas,
producidas por el uso de un arma de fuego, es necesario tomar muestras de las
manos y prendas de vestir del presunto indiciado en el hecho punible, las cuales
son colectadas por los organismos de investigación criminal para ser sometidas
a análisis peritales.
El método convencional ampliamente empleado para la identificación y
determinación de NO3- y NO2- es el colorimétrico basado en la reacción de Griess.
No obstante, este método no distingue entre las especies nitrogenadas, derivados
de la nitrocelulosa, por ello resulta atractivo desarrollar métodos para la
cuantificación de nitritos y nitratos enfocados en la técnica de cromatografía
líquida de alta eficiencia para diferenciar dichas especies.
Por ello, en el presente trabajo se plantea aplicar y validar un método basado en
la técnica de cromatografía líquida de alta eficiencia en el modo iónico para
determinar la concentración de NO2- y NO3- presentes en prendas de vestir
expuestas al uso de armas de fuego.
Parte Experimental
Se emplearon reactivos tanto de grado analítico, como HPLC. Todas las
soluciones estándares se prepararon con nitrato de sodio (Sigma 99%) y nitrito
de sodio (Merck 99,5%) diluyendo con agua desionizada y posteriormente
filtradas y desgasificadas. Se utilizó un cromatógrafo modelo SPD-20, marca
iónica
Para la evaluación de las condiciones químicas e instrumentales para la medición
y cuantificación de los iones nitratos y nitritos en la columna aniónica AS9-SC
se estudiaron los siguientes parámetros: el pH de la fase móvil, la velocidad de
flujo y el volumen de muestra para la cual se inyectó una disolución estándar de
una mezcla de nitratos y nitritos de 5 mg/L. Cabe destacar, que en la evaluación
de dichos parámetros se trabajó a dos niveles, es decir, un nivel bajo y otro alto.
En el caso de la evaluación del pH de la fase móvil se midió a un pH de 8,6 y
10,6. Por otra parte, la velocidad de flujo de la fase móvil a 0,8 mL/min y a 2,0
mL/min y por último se empleó volúmenes de muestra de 50 y 100 µL.
Resultados y Discusión
El desarrollo de un método cromatográfico implica establecer las condiciones
cromatográficas de separación. En este orden de ideas, seguidamente se
discutirán las condiciones fisicoquímicas para la distribución de los iones nitratos
y nitritos en una columna de intercambio iónico Dionex IONPAC AS9-SC
(4×250mm) empleando una fase móvil de 1,8 mM Na2CO3/ 1,7 mM NaHCO3 a
un pH de 10,6 y velocidad de flujo de 1 mL/min, con un volumen de inyección
de muestra de 50 µL y como sistema de detección un detector de conductividad
iónica.
Inicialmente se evaluó el sistema cromatográfico sin la inclusión de una
membrana supresora de iones, y al inyectar una serie de disoluciones estándar de
los iones bajo estudio, no se logró observar una señal diferente a la del blanco de
agua o buffer, por lo que se inyectó una disolución de 100 mg/L de mezcla (NO2-
y NO3-), en cuyo caso solo se observó una pequeña señal correspondiente al ion
NO3-, este hecho se debe a la alta conducción de la fase móvil que implica un
cero, es decir, el restar la señal de fondo, lo que implica reducir la posibilidad de
generar señal de los iones de interés. El uso de una membrana supresora de iones
permita compensar la señal de fondo debida a la fase móvil, sin perder la
sensibilidad del método, según lo reportan varios autores entre los que se
destacan Jackson, P (2001), Gilchrist, y colaboradores (2012), así como
Rodríguez, J. y colaboradores (2011).
Seguidamente, se muestran los cromatogramas para las disoluciones estándar de
nitrato y nitrito de sodio (15mg/L) empleando la membrana de supresión. En este
- -
caso, se aprecian señales tanto para el ion NO2 como para el ion NO3 , además
se observa el pico correspondiente al agua y a un ión desconocido. Bajo estas
condiciones se muestra el factor de capacidad (k`) entre los iones de interés es
0,51 y 0,94 respectivamente (Figura 1).
a)Disolución de Nitrito de sodio
2
1
Detector 2.5
(uS/cm)
0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Tiempo (minutos)
b)Disolución de Nitrato de sodio
301 2
Detector 20
(uS/cm)
10

SHIMADZU, una columna de intercambio aniónico Dionex AS9-SC 0

(4×250mm), una precolumna Dionex AG9-SC (4mm), membrana supresora 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Dionex (SRS 4-mm) y un detector de conductividad. Tiempo (minutos)
Evaluación de la distribución de los iones nitratos y nitritos
empleando una columna de intercambio iónico
El proceso de separación se inició siguiendo las condiciones establecidas en el 5.0
2
3
manual de la columna Dionex IONPAC AS9-SC (4×250mm), las cuales se
describen seguidamente: fase móvil de 1,8 mM Na2CO3/1,7 mM NaHCO3, 2.5
velocidad de flujo de 1 mL/min, volumen de muestra de 20 µL, con una Detector
1
membrana supresora de iones y una solución regenerante de 50 mN H2SO4, con (uS/cm)
un sistema de detección de conductividad. Las soluciones estándares de cada una 0.0
de las especies de nitrato y nitrito de sodio (NO2- y NO3-) se prepararon partiendo
a una concentración inicial de 1000 mg/L, a partir de ellas se obtuvieron las 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
disoluciones individuales y mezclas para los ensayos. Posteriormente, se realizó Tiempo (minutos)
la medición de dichas disoluciones estándar en un rango de concentración de 15
c) Disolución de Mezcla de nitrito y nitrato de sodio
y 100 mg/L.
Figura 1. Evaluación del efecto del uso de la membrana supresora. Condiciones: fase móvil
de 1,8mM Na2CO3/1,7mM NaHCO3, una velocidad de flujo de 1 mL/min, un loop de 50 µL
y corresponde: a) disolución de nitrito de sodio 15mg/L: 1: desconocido, 2: nitrito; b)
disolución de nitrato de sodio 15mg/L. 1: cloruro, 2: nitrato; c) mezcla de nitrito y nitrato de Figura 3. Evaluación de parámetros de separación con una mezcla de 5 mg/L de nitrato y
sodio15mg/L. 1: cloruro, 2: nitrito, 3: nitrato. nitrito de sodio empleando como fase móvil a pH 10,6 y 8,6, velocidad de flujo de 0,8 y 2,0
mL/min y volumen de muestra de 50 y 100 µL.
En la Figura 1, se observa la separación de los iones de interés (NO2- yNO3-) en
la columna aniónica siendo favorable la utilización de dicha membrana. A fin de En la Figura 3, se observa la separación de la mezcla de los iones NO2- y NO3-
identificar la señal del pico desconocido, se inyectó una disolución estándar utilizando una fase móvil a pH= 10,6 y 8,6, con la cual ambas especies se
correspondiente a siete de los iones más comunes en cuerpos de aguas como lo separaron. Cabe destacar que la fase móvil a pH = 10,6 permitió la separación de
son el F-, Cl-, NO2-, NO3-, Br-, PO4-3 y SO4-2 como se aprecian en la Figura 2, bajo los analitos de manera correcta, disminuyendo aproximadamente en 1,7 minutos
las condiciones de estudio, se logró la separación de los siete iones de acuerdo al el tiempo de análisis, lo que se traduce en una disminución en la cantidad de
tiempo de retención del ion Cl- (2,1 min), y puede afirmarse que el ión reactivos utilizados. Por otra parte, en cuanto al volumen de inyección de muestra
desconocido en la Figura 1 corresponde al mismo. se observó un mejor resultado con un volumen de muestra de 50 µL al observarse
una mejor resolución de dicha separación, por el contrario, con un volumen de
muestra de 100 µL la cantidad es mayor, por lo que no se observó una buena
resolución, lo que demuestra la saturación de la columna al inyectar tal cantidad
de muestra. Por otro lado, la velocidad de flujo de la fase móvil más adecuada es
la de 0,8 mL/min, aunque el tiempo de retención de los analitos es un poco mayor
comparado con la velocidad de flujo de 2,0 mL/min, pero se obtiene una mejor
separación de picos. A continuación, en la Tabla 2 se observan los parámetros
cromatográficos como lo son: tiempo de retención, factor de retención, numero
Figura 2. Cromatograma de disoluciones estándar de mezcla de siete iones comunes en
de platos teóricos, factor de selectividad y resolución de la columna.
cuerpos de aguas con una fase móvil de 1,8mM Na2CO3/1,7mM NaHCO3, una velocidad de Los resultados de resolución (Rs) demuestran un adecuado grado de separación
flujo de 1 mL/min, volumen de muestra de 50 µL y corresponden a: 1)F-(4mg/L), 2)Cl- de los dos analitos ya que presentan valores por encima de 1,5 reportados en la
(4mg/L), 3)NO2-(50mg/L), 4)NO3-(50mg/L), 5)Br-(10mg/L), 6)PO4-3 (50mg/L), 7) SO4- literatura, del mismo modo los resultados en cuanto número de platos teóricos,
2
(50mg/L) con membrana supresora.
son altos por ende mejor es la separación; por otra parte cabe destacar que se
Una vez establecida la distribución de los iones nitrito y nitrato se realizó el obtienen asimetría de picos menor al 1,5.
estudio preliminar para la optimización de los siguientes parámetros
Tabla 2. Parámetros cromatográficos para la separación de NO2- y NO3-a una
cromatográficos: volumen de inyección (V.iny), velocidad de flujo (V.f) y pH, y
concentración de 5 mg/L utilizando una columna aniónica AS9-SC, fase móvil
así establecer su contribución a dos niveles (bajo y alto), que seguidamente se
1,8 mM Na2CO3/1,7 mM NaHCO3, velocidad de flujo de 0,8 mL/min y un
listan V.iny. de 50 y 100 µL, Vf de 0,8 y 2,0 mL/min) y finalmente el pH de la
volumen de muestra de 50 µL.
fase móvil que se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Efecto de la variación del pH de la fase móvil estudiadas. Aniones Tiempo Factor Numero Factor de Resolución
de de de platos selectividad (Rs)
retención retención teóricos (α)
Composición de la FM mM Na2CO3/ mM NaHCO3 (min) (k`) (N)
1,8/1,7 2,0/0,90 1,8 /1,7 1,8 /1,7 1,8 /1,7 NO2- 2,8126 0,48 1118,703
-
pH 10,6 7,1 4,3 6,2 8,6 NO3 3,5293 0,86 1898,080 1,25 2,170
Señal Presente Ausente Ausente Ausente Presente
Una vez encontradas las condiciones de separación para los iones nitritos y
En la Tabla 1, se observan las fases móviles estudiadas (pH) y el resultado nitratos, se evaluaron las muestras de una prenda vestir expuesta a residuos de
obtenido por las mismas, en los que dichos resultados evidencian que a bajos pH, disparo, como se muestra en la Figura 4, donde se observan picos
la fase móvil es muy fuerte, por tanto, los iones de interés salen con la misma. La correspondientes a los iones de interés, así como la presencia de iones SO4-2, Cl-
evaluación de los dos niveles, es decir, un valor alto y otro bajo para el caso del y PO4-3, los cuales son comunes en los detergentes utilizados en el lavado de las
pH de la fase móvil, se dificulta puesto que empleando la misma combinación prendas de vestir.
(Na2CO3/NaHCO3) de sales y variando su concentración, y por ende el pH,
resultó imposible observar señal para los iones nitrito y nitrato a pH inferior a 5.0
1

8,5. A continuación en la Figura 3 se muestran las fases móviles a pH = 10,6 y

8,6, en las que se observó la separación de los iones de interés. 2.5
Detector
5
2

4
3

a) pH = 8,6 b) pH = 10,6 (uS/cm)0.0

30 1 2
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
1

Detector 5 Detector 20 Tiempo (minutos)

(uS/cm)
0 (uS/cm)
10
-5

-10 0
Figura 4. Evaluación de la prenda de vestir expuesta al uso de armas de fuego.
Condiciones: fase móvil de 1,8mM Na2CO3/1,7mM NaHCO3, una velocidad de flujo de 1
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
Tiempo (minutos)
6.0 7.0
Tiempo (minutos) mL/min, un loop de 50 µL y corresponde: 1) cloruro, 2) nitrito, 3) nitrato, 4) fosfato y 5)
sulfato.
c) Velocidad de flujo de 0,8 mL/min d) Velocidad de flujo de 2,0 mL/min Conclusiones
 Se observó la separación y detección de los iones nitrato y nitrito en una
columna aniónica AS9-SC siendo necesaria la utilización de una membrana
1
supresora.
15 2
 Se llevó a cabo la evaluación preliminar de los parámetros a optimizar la
Detector
10 separación de los iones evaluando el pH de la fase móvil, el volumen de
(uS/cm) inyección y la velocidad de flujo obteniendo una adecuada separación en
5 un tiempo de análisis corto.
0
 Se determinaron los parámetros de calidad del método preliminar
empleando las condiciones adecuadas para dicha separación.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Tiempo (minutos)  Se aplicaron las condiciones para la separación de los iones nitratos y
nitritos en prendas de vestir expuestas al uso de armas de fuego.
e) Volumen de muestra 50 L f) Volumen de muestra 100 µL
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(uS/cm)
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