¿Qué veremos hoy?

Elementos de genómica estructural y tipos de genomas. Técnicas básicas en el estudio

del genoma.

¿Cómo está formado el genoma?

El DNA se encuentra formado por bases nitrogenadas,
las cuales son formas de escribir la información
genética hereditaria de la especie humana. Tenemos
la Adenina y la Guanina que son las bases purinas, las
cuales se caracterizan por tener dos anillos. Las bases
pirimidinas, que tienen un solo anillo, son la Citosina,
Timina y en el caso del RNA Uracilo.
A la estructura básica de las bases nitrogenadas lo
llamamos nucleótido, el nucleótido está formado por
una base (cualquiera de ellos) unido a una pentosa,
que es un azúcar de 5 carbonos (enlace β-
glucosídico); en el carbono 5 está el grupo fosfato. El
grupo fosfato suele darle una carga neta negativa a la
molécula, ya que ese encuentra ionizado con un pH
neutro.
En el caso del RNA la pentosa es cambiada por una
ribosa, que tiene grupos hidroxilos tanto en el
carbono 2 como en el carbono 3En el ADN es una
desoxirribosa, a la cual le falta un oxigeno en el
carbono 2 dejando solo el H.
Azucares
• RNA contiene D-ribosa
• DNA contiene D-desoxirribosa
La ribosa tiene tanto en el carbono 2 como en el
3 tienen grupos hidroxilos (OH), mientras que en
el ADN esta la desoxirribosa que carece de
oxigeno en su carbono 2.
Estas cadenas de polinucleótidos
interactúan de la siguiente manera, el
índice de Chargaff establece que la
cantidad de A/T tiene una proporción
de 1 al igual que la de G/C. Esto
significa que hay el mismo numero de
A/T y de G/C en una cadena de
polinucleótidos.
La cadena del ADN es una doble
hebra antiparalela teniendo la
dirección 5’ -> 3’ y la dirección 3’ -> 5’.
Siempre una Guanina se une a una Citosina con 3 puentes de hidrogeno, mientras que la
Adenina y Timina lo hacen a través de 2 puentes de hidrogeno. Por esto es más fácil
desnatura una hebra de poli A-T.
Si una molécula de DNA de doble hélice presenta un 20% de Timina, ¿Cuál sería el
porcentaje de las bases restantes?

*Adenina estaría en un 20%, mientras que Guanina y Citosina en un 30%

Modelo de Watson y Crick

Hoy sabemos que hay tres formas distintas del DNA, las cuales presentan distintas
características, por ejemplo, la forma B tiene hendiduras más grande que la Z y que la A.
La forma B es la forma normal o típica del DNA.

Enlace fosfodiéster
Se forma entre el 3’ OH del primer nucleótido y el 5’ fosfato del
segundo nucleótido. La cadena tiene dirección 5’ (fosfato libre)
a 3’ (OH libre)

*Dextrógira: Giro hacia la derecha

*Levógira: Giro hacia la izquierda

 • Las moléculas de DNA genómico no tienen una estructura por ejemplo uniforme
• Cada nucleótido puede adoptar formas moleculares algo diferentes
• Cambios más importantes implican rotación alrededor del enlace b-N-glucosídico
• Las rotaciones dentro de los nucleótidos inducen cambios en la estructura de la
hélice
• Otras variaciones son B’-, C-, C’- D-, E- y T-DNA
• Las variaciones en el ancho y profundidad de los surcos tienen implicaciones en la
unión de proteínas al DNA.

La duplicación del ADN es:

• Semiconservativa (Messelson y Stahl, 1958)
• Comienza en un origen de replicación
• Bidireccional
• En sentido 5’ -> 3’
• Se inicia con un primer de RNA
• Hebra adelantada y hebra atrasada (fragmentos de Okazaki)

DNA polimerasa:

• α y δ: Síntesis (I, III)

• β: Reparación (II)
• γ: Mitocondrial

Las proteínas que mantienen abiertas el DNA de hebras simples son las SSB, mientras que
la helicasa se encarga de ir abriendo la doble hélice (rompe los puentes de hidrogeno).
Luego llega la polimerasa realizando la replicación, por ley de homología va agregando los
dioxinucleotidos que corresponden. El problema de la hebra retrasada es que se van
agregando nucleótidos en dirección 3’, por esto en la hebra retrasada se debe sintetizar
un pequeño primer que es de color verde en la imagen (fragmentos de Okazaki), que
vineen a dar cuenta de que para que la hebra retrasada siga las regla general de que esto
solo crece por el extremo 3’ hay que irles sintetizando un iniciador, un primer, este primer
lo va sintetizando la primasa, la primasa casa cierto tiempo les va poniendo un iniciador
en la cadena retrasada.
El tamaño del DNA en virus y en
bacterias es bastante variable
Las bacterias se ven afectadas
por fagos los cuales pueden
destruirlos, así como las bacterias
pueden destruir nuestras células.

El virus no es muy grande, que posee una

partícula SPIKE, que reconoce un receptor AC2
que está presente en gran cantidad en el
epitelio respiratorio, aunque también afecta a
otros órganos. Este es un virus de RNAmc
(monocatenario) es un RNA de una sola hebra y
de polaridad positiva y que posee una
envoltura.

Proteasa PLpro, proteína que participa en el procesamiento de la cápside viral durante el

ciclo replicativo, tiene una RNA polimerasa dependiente de ARN que es codificado por
ella misma.
Especies v/s cantidad de pares de bases
La cantidad de pares de bases no esta relacionada con la
complejidad de la especie. Una cebolla tiene mucho más
DNA que Homo sapiens.

Contenido de DNA en algunos organismos (Paradoja del valor C)

Hay anfibios que poseen mucho más DNA
que los humanos, hay tiburones y plantas
que poseen mayor cantidad de DNA.
El valor de la paradoja C significa que no hay
relación entre el tamaño del genoma y la
complejidad genética. Hay variaciones
importantes en los tamaños de los
genomas dentro de muchos grupos de
organismos.
Clasificación del DNA eucarionte

Genomas de los eucariontes

La tm es la temperatura a al cual el 50% del DNA esta

como hebra simple y el otro 50% esta como hebra
doble, en función del calor que se le aplica para
desnaturalizarla. El organismo azul tiene una
secuencia tm menor que el organismo rojo; esto se
debe a que el tm azul es más rico en secuencia A-T por
lo tanto tiene un tm menor.
Por ejemplo, desnaturalizamos el DNA y comenzamos lentamente a bajar la temperatura
¿Cuáles son las fracciones re-asociadas que existen? La que tiene menor complejidad en
el genoma es la secuencia Poli U o Poli A, su complejidad es de 1 ya que es la que requiere
menor temperatura, además solo posee un nucleótido.

Los estudios de cinética nos permiten saber cual es la complejidad de un genoma.

DNA satélite de ratón: porción del DNA altamente repetido.

Los DNA que se reasocia lentamente suelen ser DNA de secuencia única.

Cinética de re naturación DNA eucarionte

La fracción que se re asocia primero son las que
están altamente repetidas, luego comienzan a
asociarse las moderadamente repetidas y por
ultimo se encuentran las de secuencia única; esto
demuestra que nuestro genoma tiene al menos 3
tipos distintos de fracciones.

Secuencias repetidas funcionales (mediante repetido) codificantes

Familias de genes dispersas: Actinas (5 a 30)

Tubulina (3 a 15)

Familias de genes en tándem: Organizadores nucleolares (genes que codifican para rRNA)

Histonas (100 a 1000)

Secuencias repetidas funcionales no-codificantes

Secuencias altamente repetidas

Repeticiones en tándem de numero variable (VNTR)

• DNA satélite: DNA centromerico, alto contenido A/T (97% en congrejos), D.

Melanogaster: AATACATAG, humanos: secuencia de 170pb.
• DNA minisatélite: Unidades repetidas de 15 a 100 pb, normalmente de 25pb, que
forman complejos de hasta 20kb de extensión (LTR).
• DNA microsatélite: Unidades de repetición de no más de 13pb y 150pbde
extensión (STR). Lo más frecuente son repetidos de dinucleótidos con alrededor
de 140.ooo copias en todo el genoma, normalmente CA.

Repeticiones dispersas
Secuencias transpuestas (transposones)

• LINES (long interpsersed nuclear elements): 1 a 5kb presentes en 20.000 a 40.000

copias por genoma humano (21%)
• SINES (short interspersed nuclear elements): secuencias de 200 a 300 pb como
secuencias Alu en humanos, con 1.200.000 copias por genoma (14%)
DNA espaciador
No se conoce su función, se piensa que puede tener algún rol estructural. Produce espacio
entre los genes. (Selfish DNA)
En humanos el DNA espaciador es mucho ya que esta lleno de intrones, algunos intrones
dentro del proceso de editing cumplen una función, el splaicing alternativo, cuando están
transcribiendo un gen, se pueden usar intrones alternativos para producir a partir del
mismo gen distintos productos génicos.

Componentes genéticos del genoma humano

Enzimas usadas en la manipulación del DNA

Polimerasas: Enzimas que sintetizan polinucleótidos nuevos complementarios a un molde
de DNA o RNA existentes. DNA polimerasa I, Taq polimerasa.
Nucleasas: Enzimas que degradan la molécula de DNA o RNA rompiendo los enlaces
fosfodiéster que unen un nucleótido al siguiente.
• Exonucleasas: Eliminan nucleótidos de los extremos.
• Endonucleasas: Cortan enlaces fosfodiéster internos. Endonucleasas de
restricción.
Ligasas: Enzimas que unen moléculas de DNA sintetizando enlaces fosfodiéster entre
nucleótidos ubicados en los extremos de dos moléculas diferentes o en los dos extremos
de dos moléculas diferentes o en los dos extremos de una misma molécula.
Enzimas de modificación terminal: Enzimas que efectúan cambios en los extremos de las
moléculas de DNA. Desoxinucleotidiltransferasa terminal (agrega nucleótidos en el
extremo 3’)

Endonucleasas de restricción
• Se encuentran naturalmente en bacterias.
• Reconocen secuencias entre 4-8 pares de bases de DNA
de doble hebra.
• Rompen un enlace fosfodiéster en casa una de las hebras
reconocidas
• Dejan extremos cohesivos y romos.

Con este método se pueden obtener los transgénicos, porque el resultado es un DNA
hibrido.
Técnicas biotecnológicas

Electroforesis
Southern (DNA) y Northern (RNA) Blot
Mediante capilaridad se
traspasan las bandas en el
mismo orden en el que
están solo que sobre un
filtro de nitrocelulosa, luego
el filtro se verte en una
solución y se le pone una
sonda, las sondas
identifican específicamente
un gen de interés; luego
esto lo exponemos a un fil
de rayos x y así aparecen las
bandas en donde se
encuentra el gen de interés.

La reacción de PCR
• DNA polimerasa
• Oligonucleótidos cebadores (primers)
• Desoxinucleótidos (dNTPs) dATP, dTTP, dGTP, dCTP
• MgCl2 (cofactor)
La mezcla de reactivos se somete a una cantidad
variable de ciclos, que a través de temperaturas
variables manejan la reacción

Dos importantes innovaciones dieron impulso a la técnica:

Taq polimerasa
Thermus aquaticus: Vive en el agua a 75°C, su DNA polimerasa, Taq polimerasa, posee una
temperatura óptima de 72°C y es estable hasta 94°C.

Termociclador
• 94°C: Denaturación
• 54°C: Apareamiento / Oligonucleótidos
• 72°C: Amplificación
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
1985, K.Mullis (Nobel en 1993)

Taq polimerasa (Thermus aquaticus)

En cada ciclo se repite:

• Denaturar DNA a 96°C
• Hibridar partidores (primers) a 50-55°C
• Amplificar con Taq polimerasa a 72°C

Se realizan de 20 a 40 ciclos
• Ciclo 10: 264
• Ciclo 20: 262.144
• Ciclo 30: 268.435.456

Secuencias del DNA

• Químico
• Enzimático (Sanger)
• Automático
• De próxima generación:
- Ilumina
- Pirosecuenciación
• De tercera generación:
- Nanoporos

Secuenciación Enzimática de Sanger o desoxi

Los fragmentos de ADN obtenidos se separan por electroforesis en geles de acrilamida
muy finos y de gran longitud que permiten distinguir fragmentos de ADN que se
diferencian en un solo nucleótido.

Sabiendo que el DNA crece en la dirección 5’ – 3’, si comenzamos a leer el gel por los
fragmentos de menor tamaño (extremo 5’) y avanzamos aumentando el tamaño de los
fragmentos (hacia 3’), obtendremos la secuencia del ADN en la dirección 5’ – 3’.

Secuenciación automática
Pirosecuenciación

Cada vez que se agrega un nucleótido se libero un pirofosfato, si en el sistema hay un

luciferasa, toma el pirofosfato y lo convierte en un destello de luz que el computador
registra como una señal dependiendo del tipo de base.

Secuenciación con nanoporos

Consiste en que dentro de la maquina se
encuentran unos nanoporos, dentro hay un
sistema enzimático asociado al poro (le poro se
encuentra en una membrana) a cada de la
membrana se pone un voltaje. Hay una enzima
asociada al poro que desenrolla la doble hebra y
hace pasar una hebra simple, como esto esta
estandarizado cada ves que pasa la hebra hay
algunas bases son pequeñas por lo que dejan
pasar mucha corriente eléctrica, pero cuando pasan bases más grandes como la purina A
– G, disminuye, por lo que cada base tiene su propia conductimetría. De esta forma se
puede determinar la secuencia del genoma.
El análisis genómico estructural consta de conocer lo organización y secuencia de la
información genética contenida dentro de un genoma

Mapas genéticos:

• Asignar loci génicos y marcadores moleculares a distintos cromosomas

• Calcular distancias entre genes y marcadores en los cromosomas en base a
porcentajes de recombinación (unidades mapa o cM)
Mapas físicos: Análisis directo del DNA ubicando los genes en distancias medidas en pares
de bases.

• Mapeo de restricción
• Uso de sitios de secuencia etiquetada (STS)
• Electrolisis de campo pulsado, para cromosomas pequeños como los de
levaduras. Se pueden separar, cada banda corresponderá a un cromosoma, y
luego hacer Southern blot.
Secuenciación del genoma completo: Se han secuenciado más de 150 eucariontes
- 1982: Fago lambda
- 1995: Haemophilus influenzae
- 1996: Levadura
- 1998: C. elegans
- 2000: D. melanogaster
- 2000: Primer borrador del genoma humano completo

Mapeo cromosómico
Mapeo físico, cortar el DNA con enzimas de restricción y obtener un set de clones que
deben ser analizados (librería genómica), usando cósmidos, YACs. Etc. Se obtiene un
numero de clones al azar, que se analizan por sobreposición, un set de clones
sobrepuestos es llamado un contig.
Por PCR se amplifica una pequeña región llamada Sequence-Tagged Site (STS), 100 a 500
pb y fácilmente identificables, las cuales se usan para caracterizar clones (YACs) con
grandes insertos genómicos. Los que comparten STS están sobrepuestos y se pueden ir
ordenando

Genoma humano

• 3.289.000.000 de pares de bases

• Longitud de la cadena de DNA es de 1,82 metros
• 31.000 genes estimados inicialmente
• 23.000 genes estimados (1 de cada 128 Kb)
• 99,9% del genoma es idéntico en la especie humana, solo el 0,1% permite las
diferencias d ellos individuos de la especie.
• Más de la mitad del genoma son secuencias repetidas, aparentemente sin función
conocida.
• Los genes propiamente tales son alrededor del 20% del genoma. Existiendo cerca
de un 2% de exones y el resto son intrones.

Metagenómica
Se muestrean y determinan las secuencias de genomas de todo un grupo de organismos
que habitan un ambiente común.
Comunidad microbiana que habita en el drenaje de ácido de una mina

Microbioma del intestino humano

Biología sintética: Crear nuevos organismos

2010 (Gibsons y col) sintetizaron el genoma completo (1,08 millones de pb) de
Mycoplasma mycoides 2011 se reemplazaron 90.000 pb cromosoma 9 de levadura por
DNA sintético.
La genómica funcional tiene
como objetivo identificar
todas las moléculas de RNA
transcritas de un genoma
(transcriptoma) y todas las
proteínas codificadas pro el
genoma (proteoma)
Conocer el momento y lugar
donde se expresan los genes
y la cantidad que se expresa.
Microarreglos: Hibridación de
ácidos nucleicos. Se fijan
numeroso fragmentos de DNA a
un soporte con un patrón
ordenado. Se marca el mRNA o
cDNA con nucleótidos
fluorescentes que hibridarán con
la sonda complementaria y
emitirán fluorescencia que puede
ser detectada.

Tecnología de microarrays (chips de AND o RNA) La tecnología demicroarrays es una

tecnología en desarrollo para estudiar la expresión de muchos genes a la vez. Consiste en
colocar miles de secuencias génicas en lugares determinados sobre un portaobjetos de
vidrio llamado chip. Variaciones de esta técnica permiten estudiar la expresión de genes
asociados a algún tipo de cáncer