1º Curso del Grado en BIOLOGÍA

PRINCIPIOS INSTRUMENTALES Y METODOLÓGICOS

EN BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR II

BLOQUE 6
ESPECTROFOTOMETRÍA
2ª parte

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología

 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

Doble naturaleza de la radiación electromagnética

• Radiación electromagnética: la energía transportada por campos eléctricos y magnéticos que
se propagan en el vacío a la velocidad de la luz (c).
• Se puede explicar según la teoría oscilatoria (naturaleza de ondas) o según la teoría corpuscular
(fotones, partículas discretas de energía). Combinando las dos, se puede considerar que la
radicación electromagnética esta compuesta por paquetes (o partículas) discretos de energía
(fotones) que se desplazan siguiendo un movimiento ondulante
• Ejemplos: calor radiado, luz visible, luz UV, rayos X o rayos gamma.
C= velocidad de luz
Frecuencia (ν)

c=λ·ν
Como c es
constante, cuanto
mayor sea λ,
λ = c/ν
menor será ν, y
viceversa ν = c/λ

Longitud de onda (λ, lambda) = distancia recorrida por una oscilación de onda completa (unidades: nm a m)
Frecuencia ( , nu) = nº de oscilaciones completas/segundo (unidades: Herzio (Hz) = ciclo · s-1)
PIM II. 1º Curso del Grado en Biología
Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA
Las moléculas absorben radiación electromagnética en
función de su estructura atómica
 El termino absorción (o absorbancia) hace referencia a la capacidad de los átomos (o de las moléculas) de
absorber radiación electromagnética.
▪ La absorción de radiación provoca el paso de los electrones
de un nivel energético basal a un estado excitado (o
superior), lo que conlleva un cambio de orbital atómico.
▪ Debido a la naturaleza quantitizada de los orbitales atómicos, la
energía absorbida por los electrones es una cantidad exacta
(quantum) que depende de cada caso. Para que una sustancia
absorba una radiación, la energía de la radiación incidente debe de
coincidir con la diferencia de energía entre el estado basal y el
estado excitado del electrón. En caso contrario la sustancia es
“transparente” a la radiación.
▪ Por esta razón, las moléculas cambian su absorción con el cambio de
longitud de onda (diferente energía de la radiación). Diferentes
longitudes de onda pueden excitar de forma diferente a los átomos
de una molécula

▪ Este estado de excitación no es estable y un átomo

excitado tiende a liberar energía (radiación
electromagnética) para volver a su estado basal
original. A este proceso se le llama emisión, y
constituye la base de la fluorometría o
espectroscopia de fluorescencia. La energía
liberada siempre es menor que la energía absorbida
(mayor longitud de onda y menor frecuencia).
PIM II. 1º Curso del Grado en Biología
 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

Las moléculas pueden absorben radiación electromagnética y también emitir

parte de esta radiación absorbida (fluorescencia)

Los picos del espectro de

absorción y emisión de
una sustancia son tanto
más útiles para la
determinación de esa
sustancia cuanto más
Espectrofotometría de absorción. Se mide la absorción o absorbancia definidos están
(estrechos y de gran
intensidad)

La radiación emitida siempre posee

menor energía que la absorbida
Espectrofotometría de emisión o fluorometría. Se mide la emisión
de luz o fluorescencia Compuestos con dobles enlaces
conjugados suelen emitir fluorescencia

La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia

electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra (emisión de energía). Se trata de utilizar un haz de luz, por
lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de
una menor energía, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). El equipamiento que mide la fluorescencia es
llamado fluorómetro o fluorímetro
 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA
FLUORESCENCIA
La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Los fluorímetros utilizan filtros o monocromadores para aislar
la luz incidente y la luz fluorescente. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o
monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90° con respecto al haz de luz incidente
para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o transmitida llegue al detector.

Monocromador 1:
radicación incidente Monocromador 2: radiación
emitida (fluorescencia)

Casi siempre de luz UV

 1º Curso del Grado en BIOLOGÍA

PRINCIPIOS INSTRUMENTALES Y METODOLÓGICOS

EN BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR II

Aplicaciones espectrofotometría

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología

Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

ESPECTROFOTOMETRÍA (UV-visible): aplicaciones

▪ Muy usado en investigaciones biológicas para la identificación y cuantificación de
moléculas de interés biológico, tanto en solución como en muestras biológicas
complejas:
I. Identificación y cuantificación de sustancias: sustancias químicas,
oligoelementos, lípidos, azúcares, ácidos nucleídos, proteínas, y un largo
etc.
II. Estructura molecular.
III. Grado de pureza. Mediante comparación del espectro de absorción de
una muestra con el espectro de absorción de la sustancia pura
IV. Estudios de cinética de reacciones químicas o enzimáticas. Mediante
análisis de la desaparición de sustratos o aparición de productos.
V. Determinación del crecimiento de microorganismos en cultivos líquidos.
Se habla en este caso de determinación de la densidad óptica (DO) que
es la medida de la turbidez que provoca refracción de la luz. A mayor
turbidez, mayor refracción de la luz, menor transmitancia y mayor
concentración de microorganismos.
VI. Otros
PIM II. 1º Curso del Grado en Biología
Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

APLICACIONES BIOLÓGICAS
I. Identificación y cuantificación de sustancias
▪ Proteínas:
✓ Concentración total Bloque 7
✓ Concentración de proteínas específicas
✓ Estudios de desnaturalización-renaturalización
✓ Detección de unión de pequeñas moléculas a proteínas (coofactores y ligandos)
✓ Asociación proteína-proteína

▪ Ácidos nucleicos (DNA y RNA):

✓ Concentración
✓ Pureza
✓ Estructura (desnaturalización-renaturalización)

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología

 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

EVALUACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

El sistema de dobles enlaces conjugados de los anillos púricos y pirimidínicos de las bases
nitrogenadas conlleva la absorción de luz UV con un máximo de absorbancia a 260 nm

Los ácidos nucleicos absorben luz UV con un máximo de absorbancia a 260 nm

 Se usa la absorbancia a 260nm

DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS
desoxiadenosina 5'- desoxiguanosina 5'-
monofosfato
dAMP
(λmax) para determinar la
concentración total de ácidos
nucleicos en una preparación
 Problema: Cada nucleótido tiene una
capacidad de absorción diferente:
diferentes coeficientes de extinción!
y las moléculas de ADN o ARN está
compuestas por diferentes
monofosfato
dGMP combinaciones de nucleótidos!.
 ADN y ARN no absorben igual

desoxicitidina 5'- desoxitimidina 5'-

monofosfato monofosfato
dCMP dTMP
 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

EVALUACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Determinación de la concentración total de ácidos nucleicos
 Problema: Una molécula de ADN o ARN está compuesta por diferentes nucleótidos. Cada nucleótido tiene una
capacidad de absorción diferente (diferentes coeficientes de extinción). ADN y ARN no absorben igual

A260nm =C * ε260nm c= A260nm /ε260nm

 Además, la naturaleza de ADN doble cadena o simple cadena del ADN también afectan a la absorbancia
 Solución: Se utiliza como coeficiente de extinción un valor promedio de coeficientes de extinción calculados
experimentalmente*. Este coeficiente es distinto (la absorbancia es diferente) en función de la naturaleza de los
ácidos nucleicos (ADN doble o simple cadena, o ARN)

ADN doble ɛDNA 2c = 0,020 (µg/mL)-1 · cm-1 1/ ɛDNA 2c = 50 CDNA 2c = A260nm * 50 µg/mL
cadena
ADN simple
cadena
ɛDNA 1c = 0,027 (µg/mL)-1 · cm-1 1/ ɛDNA 1c = 37 CDNA 1c = A260nm * 37 µg/mL

ARN ɛRNA = 0,025 (µg/mL)-1 · cm-1 1/ ɛRNA = 40 CRNA= A260nm * 40 µg/mL

Nucleótidos
libres
ɛdNTPs = 0,030 (µg/mL)-1 · cm-1 1/ ɛdNTPs = 33,33 CdNTPs = A260nm * 33,33 µg/mL

* EL rango de concentraciones de DNA en el que se cumple la Ley de Lambert-Beer (relación lineal entre la concentración y la absorbancia)
es de aprox. 5-50 µg/mL.
PIM II. 1º Curso del Grado en Biología
 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

EVALUACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Análisis de la estructura del DNA (desnaturalización-renaturalización)

DNA
nativo Hipercromicidad

calor
ɛDNA 1c = 0.027
DNA
desnaturalizado
ɛDNA 2c = 0.020
Enfriamiento lento

Renaturalización del ADN

DNA
EFECTO HIPERCRÓMICO: La absorbancia a 260
renaturalizado nm aumenta con la desnaturalización del DNA

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología

 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

EVALUACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Análisis de la estructura del DNA (desnaturalización-renaturalización)

DNA CINÉTICA DE DESNATURALIZACIÓN

nativo

calor

DNA
desnaturalizado “Efecto cremallera”: hasta
que no se rompe un
número crítico de puentes
Enfriamiento lento de H las cadenas no se
separan

Renaturalización del ADN

DNA
La temperatura a la que se ha desnaturalizado el 50% del DNA
renaturalizado
se denomina temperatura de fusión; se abrevia Tm
(temperature of melting).

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología

Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

EVALUACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

¿Y qué pasa con la pureza de la preparación?

 Cuando se purifican ácidos nucleicos suelen estar contaminados con proteínas, fenoles,
alcoholes, sales, etc. Proteínas y fenoles también absorben a 280 nm
 Puede calcularse la pureza de una preparación midiendo el cociente A260 nm/A280 nm

▪La preparación se considera con un grado de pureza aceptable si el cociente

A260nm/A280nm es ~ 1,8 (DNA) ó ~ 2,0 (RNA)
▪Cocientes menores de 1,7 indican contaminación importantes con proteínas o fenoles
▪Una preparación de ADN con un ratio mayor a 2.1 indica que está contaminada con
ARN

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología

Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

ESPECTROFOTOMETRÍA (UV-visible): aplicaciones

▪ Muy usado en investigaciones biológicas para la identificación y cuantificación de
moléculas de interés biológico, tanto en solución como en muestras biológicas
complejas:
I. Identificación y cuantificación de sustancias: sustancias químicas,
bioelementos (Cu+, Fe+, etc), lípidos, azúcares, ácidos nucleídos,
proteínas, y un largo etc.
II. Grado de pureza. Mediante comparación del espectro de absorción de
una muestra con el espectro de absorción de la sustancia pura
III. Estudios de cinética de reacciones químicas o enzimáticas. Mediante
análisis de la desaparición de sustratos o aparición de productos.
IV. Estructura molecular.
V. Determinación del crecimiento de microorganismos en cultivos líquidos.
Se habla en este caso de determinación de la densidad óptica (DO) que
es la medida de la turbidez. A mayor absorbancia, mayor concentración
de microorganismos.
VI. Otros

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología

Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE REACCIONES ENZIMÁTICAS

Métodos directos
p-nitrofenil- p-nitrofenol
fosfato

Fosfatasa
alcalina

pH
básico

Color amarillo ‒
ʎmax= 400 nm

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología

Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE REACCIONES ENZIMÁTICAS

Métodos indirectos

Métodos indirectos
RH2 + NAD(P)+ R + NAD(P)H + H+ (NEDA)

Color rosa
ʎmax= 540nm
PIM II. 1º Curso del Grado en Biología
Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

ESPECTROFOTOMETRÍA (UV-visible): aplicaciones

▪ Muy usado en investigaciones biológicas para la identificación y cuantificación de
moléculas de interés biológico, tanto en solución como en muestras biológicas
complejas:
I. Identificación y cuantificación de sustancias: sustancias químicas,
bioelementos (Cu+, Fe+, etc), lípidos, azúcares, ácidos nucleídos,
proteínas, y un largo etc.
II. Grado de pureza. Mediante comparación del espectro de absorción de
una muestra con el espectro de absorción de la sustancia pura
III. Estudios de cinética de reacciones químicas o enzimáticas. Mediante
análisis de la desaparición de sustratos o aparición de productos.
IV. Estructura molecular.
V. Determinación del crecimiento de microorganismos en cultivos líquidos.
Se habla en este caso de determinación de la densidad óptica (DO) que
es la medida de la turbidez que provoca refracción de la luz. A mayor
turbidez, mayor refracción de la luz, menor transmitancia y mayor
concentración de microorganismos..
VI. Otros
PIM II. 1º Curso del Grado en Biología
 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA
DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS EN CULTIVOS LÍQUIDOS

 Las partículas en suspensión no absorben sino que dispersan la luz, disminuyendo la

cantidad de radiación transmitida: TURBIDEZ (~ incremento de absorbancia)
 La turbidez es directamente proporcional a la concentración de las partículas en
suspensión: cuantas más partículas más turbidez y aparentemente más absorbancia
 La determinación de la turbidez (turbidimetría) de suspensiones biológicas tiene
múltiples aplicaciones, por ejemplo, para determinar el crecimiento de
microorganismos en cultivos líquidos

Relación entre la turbidez (absorbancia 600 nm)

de un cultivo bacteriano y el número de
bacterias presente en el mismo

Medio de cultivo Cultivo bacteriano

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología
Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA
APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA

▪ Muy usado en investigaciones biológicas para la identificación y cuantificación de

moléculas de interés biológico, tanto en solución como en muestras biológicas
complejas:

I. Identificación y cuantificación de sustancias: clorofila, lípidos, oxido

nítrico, y un largo etc
II. Estudios de cinética de reacciones químicas o enzimáticas. Mediante
análisis de la desaparición de sustratos o aparición de productos.
III. Estructura molecular.
IV. Cuantificación de acidos nucleicos a tiempo real. qPCR, Real Time PCR o
PCR a tiempo real
V. Estudio de la fotosíntesis. Comportamiento de la fluorescencia de la
clorofila
VI. Otros
Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA
APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA

▪ Muy usado en investigaciones biológicas para la identificación y cuantificación de

moléculas de interés biológico, tanto en solución como en muestras biológicas
complejas:

I. Identificación y cuantificación de sustancias: clorofila, lípidos, oxido

nítrico, y un largo etc
II. Estudios de cinética de reacciones químicas o enzimáticas. Mediante
análisis de la desaparición de sustratos o aparición de productos.
III. Estructura molecular.
IV. Cuantificación de acidos nucleicos a tiempo real. qPCR, Real Time PCR o
PCR a tiempo real
V. Estudio de la fotosíntesis. Comportamiento de la fluorescencia de la
clorofila
VI. Otros
 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA
APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA
IV. Cuantificación de ácidos nucleicos a tiempo real. qPCR, Real Time PCR o PCR a tiempo real

1) Algunas moléculas, como el SYBR

Green, pueden unirse al ADN de doble
cadena y aumentan mucha la emisión de
fluorescencia cuando están unidos a este 3) El rendimiento de una
PCR puede monitorizarse
en tiempo real midiendo
la fluorescencia

4) Se va midiendo la emisión de 5) También se puede comprobar la

2) En presencia de SYBR Green (u otros fluorescencia al final de cada ciclo de PCR desnaturalización-renaturalización
productos equivalentes) la emisión de de un molécula de ADN
fluorescencia es proporcional a la concentración
de ADN de doble cadena
Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA
APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA

▪ Muy usado en investigaciones biológicas para la identificación y cuantificación de

moléculas de interés biológico, tanto en solución como en muestras biológicas
complejas:

I. Identificación y cuantificación de sustancias: clorofila, lípidos, oxido

nítrico, y un largo etc
II. Estudios de cinética de reacciones químicas o enzimáticas. Mediante
análisis de la desaparición de sustratos o aparición de productos.
III. Estructura molecular.
IV. Cuantificación de acidos nucleicos a tiempo real. qPCR, Real Time PCR o
PCR a tiempo real
V. Estudio de la fotosíntesis. Comportamiento de la fluorescencia de la
clorofila
VI. Otros
Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA
APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA
V. Estudio de la fotosíntesis. Comportamiento de la fluorescencia de la clorofila

Fotosíntesis (Y)
Mecanismos de Fotoprotección (N)
Fluorescencia (F)
Y+N+F= 1
Conociendo la fluorescencia de
una muestra se puede deducir
la eficiencia fotosintética
Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA Aplicaciones
APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA
V. Estudio de la fotosíntesis. Comportamiento de la fluorescencia de la clorofila

• Aplicaciones Agronómicas:

From a US satellite in space to a farm in Australia, data

gathered about our planet is beamed right into the hands of
Control deforestation del Amazonas
farmers to help them make management decisions like how
much irrigation water their crops need.

Control de irrigación de cultivos

Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA Aplicaciones
APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA
V. Estudio de la fotosíntesis. Comportamiento de la fluorescencia de la clorofila
• Aplicaciones Ecológicas
• Estudios de poblaciones
• Mareas de algas
• Cambio climático

Distribución de la masa forestal y fitoplacton del planeta

Monitorización mareas rojas y otras poblaciones de fitoplancton

marino
 Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA

Inmunofluorescencia: Estudios in vivo:

Biología molecular expresión de
utilización de anticuerpos
marcados con fluoróforos proteínas
fluorescentes
Visualización ác. nucleicos

Secuenciación DNA GFP

Vídeos en Moodle
Genómica funcional:
Análisis global de la
expresión génica

Células infectadas con adenovirus:

Núcleos en azul
Células infectadas en verde
etc., etc., etc.

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología

Bloque 6: ESPECTROFOTOMETRÍA

TERMOGRAFÍA (radiación infrarroja o térmica)

Cáncer de tiroides Cáncer de mama Flebitis

Fibromialgia Síndrome post-traumático Veterinaria clínica

PIM II. 1º Curso del Grado en Biología