INFORME DE LABORATORIO N° 2

N° de grupo Grupo 6

Fecha Lunes 15 de Mayo, 2017

Integrantes Macarena Altamirano, Camilo Tapia

Título MUTAGÉNESIS

Objetivos del práctico

- Obtener mutantes de Escherichia coli resistentes a los antibióticos

ampicilina (amp) y rifampicina (rif), tanto espontáneos, como inducidos
con un agente mutagénico físico (UV)
- Distinguir diferentes fenotipos de mutantes y comparar la frecuencia de
aparición de mutantes espontáneos e inducidos
- Evaluar el efecto de agentes mutagénicos sobre la viabilidad celular

Resultados y Discusión

Efecto del agente mutagénico sobre la viabilidad celular

En la tabla 1 observamos que existen bacterias viables en todo tiempo de exposición, sin
embargo, como podemos observar de los gráficos XX y XX, vemos que las bacterias
viables (UFC) disminuyen a medida que aumenta el tiempo de exposición a luz UV. La luz
ultravioleta es un agente mutágeno que genera distintos tipos de lesiones a nivel del
material genético; induce la formación de dímeros de pirimidinas que bloquean la
replicación y la transcripción, y además puede causar deleciones, duplicaciones y
sustituciones de bases en el DNA. Por otro lado, las bacterias tienen distintos mecanismos
de reparación del DNA dañado, como reparación de dímeros de timina por
fotorreactivación o “salto” del bloqueo causado por los dímeros por sistema SOS
Considerando estos antecedentes, la disminución de la viabilidad podría estar producida por
un efecto acumulativo de las mutaciones inducidas por la exposición a luz UV (más tiempo
de exposición, más mutaciones) llegando a un punto en el que los sistemas de reparación
se ven sobrepasados, produciendo inviabilidad celular.

Tabla 1. Resultados 2016/2017 (todos los resultados incluyendo resistencia y bla). Es

posible apreciar que a medida que aumenta el tiempo de exposición a luz UV el
crecimiento bacteriano decrece.

Obtención y distinción de mutantes de E. coli resistentes a ampicilina y rifampicina

Efecto de la luz UV en la resistencia a ampicilina

En nuestros resultados observamos que no existen individuos resistentes a ampicilina y que

tampoco aparecen de forma inducida por exposición a luz ultravioleta. Sin embargo, de
resultados previos proporcionados por las profesoras ayudantes, podemos observar que si es
posible obtener mutantes espontáneos de E. coli resistentes a ampicilina (cultivo a tiempo
0) y que además estos aumentan conforme aumenta la exposición a luz UV, hasta llegar a
un punto máximo (40s) para luego empezar a decaer.

Respecto a la resistencia a antibióticos en general, podemos decir que existen cuatro

mecanismos generales: bombas de expulsión que saquen el medicamento desde el interior
de la célula; cambios en la permeabilidad de la membrana externa, principalmente a través
de modificaciones de porinas y por último, alteraciones en el sitio de acción del antibiótico.
Por otra parte, la ampicilina es un antibiótico que actúa inhibiendo la síntesis de la pared
externa uniéndose a proteínas específicas localizadas en la pared celular. Al impedir que la
pared celular se construya correctamente, la ampicilina ocasiona la lisis de la bacteria
Considerando estos antecedentes, sumado al hecho que la cantidad de individuos resistentes
aumenta producto de la exposición a un agente mutagénico, podemos suponer que la
resistencia de los mutantes inducidos se debe a los mecanismos de resistencia relacionados
a alteraciones en la secuencia de DNA, es decir, la resistencia bacteriana podría ser causada
o por la modificación estructural de porinas que antes permitían el paso del antibiótico y su
consecuente acción o por la modificación estructural de la enzima blanco de acción de la
ampicilina, causando que el antibiótico ya no pueda actuar. Sin embargo, para determinar
concretamente la causa de la resistencia es necesario hacer otro tipo de estudios, por lo que
no podemos más que conjeturar.

Resistencia a rifampicina

En nuestros resultados se observa que a diferencia de lo que sucede con la ampicilina, para
la rifampicina la cantidad de individuos resistentes sólo disminuyen a medida que aumenta
el tiempo de exposición a luz ultravioleta, por lo que podemos deducir que el agente
mutagénico no induce la aparición de nuevos individuos resistentes a este antibiótico, sino
que actuaría disminuyendo los ya existentes (espontáneos).

La rifampicina es un antibiótico que actúa bloqueando la RNA polimerasa uniéndose a la

subunidad beta de la RNA polimerasa impidiendo de esta forma que la enzima se se una al
DNA, bloqueando en consecuencia la transcripción del RNA. Por otro lado, como se
mencionó anteriormente, la luz ultravioleta es un agente mutágeno que induce la formación
de dímeros de pirimidinas en el DNA que bloquean la replicación y la transcripción lo que
puede causar la aparición de mutaciones. La disminución en el número de individuos
resistentes podría deberse a que la luz ultravioleta podría afectar al gen implicado en la
resistencia al antibiótico (en caso de tratarse de una enzima que modifica químicamente el
medicamento, o un mecanismo similar) causando la pérdida de la resistencia, aunque esto
es poco probable, ya que el principal mecanismo de resistencia a la rifampicina son
mutaciones espontáneas que causan cambios estructurales en la RNA polimerasa,
impidiendo la unión y acción de la rifampicina sobre esta enzima) o a que la acumulación
de daños en el DNA llega a un punto en que resultan tóxicos para las células causando su
muerte (a mayor tiempo de exposición, mayor cantidad de daño y mayores individuos
afectados).

Grafico 1. Aparición de mutantes resistentes a ampicilina v/s tiempo de exposición.

Grafico 3. Aparición de mutantes resistentes a rifampicina v/s tiempo de exposición: Se

observa que hay una relación entre la aparición de mutantes resistentes a rifampicina y la
exposición a UV.

Conclusiones
Como podemos observar del experimento de los efectos de la exposición de las bacterias a
luz UV sobre la viabilidad, mientras mayor exposición a un agente mutágeno, mayor es la
inviabilidad celular, probablemente porque la acumulación de mutaciones sobre los
individuos termina siendo tóxica.

Por otro lado, la luz ultravioleta puede causar la aparición de mutaciones en el DNA, que
pueden conferir nuevos atributos a un individuo, como lo observado en la aparición de
individuos resistentes a ampicilina o afectar en atributos ya existentes, como lo observado
en la cantidad de unidades formadoras de colonias resistentes a rifampicina. Sin embargo,
la proporción de individuos beneficiados por la acción de este agente mutágeno es una
fracción menor respecto de los afectados, como se observa al comparar la cantidad de
nuevos individuos resistentes a ampicilina versus disminución de individuos viables.

Finalmente, podemos decir que las mutaciones aportan variabilidad a una población y que
estas pueden presentarse de forma espontánea (como lo observado en la aparición de
resistencia a antibióticos) por errores de la DNA polimerasa (error aproximado ~1x10e9
nucleótidos incorporados) o inducidas por un mutágeno como la luz UV.

Bibliografía

- Griffiths, J. F. (2004). Genética Moderna. McGraw-Hill Education.

- Pierce, B. (2009). Genética: Un enfoque conceptual. Editorial Médica
Panamericana.
- Tortora, J., Funke, B. & Case, C. (2007). Introducción a la microbiología. Editorial
Médica Panamericana.
- Forbes, B., Sahm, D. & Weissfeld, A. (2007). Bailey & Scott Diagnóstico
Microbiológico. Editorial Médica Panamericana.