Practica N°3

Efecto del tiempo de reacción y concentración de enzimas

Nickole Juliethe García Lombo1, Ángel Felipe Silva Caleño2

1. 164004510
2. 164004538

Programa de Biología, Departamento de Biología y Química,

Universidad de los Llanos

Vereda Barcelona, km 12 vía a Puerto López, Villavicencio 500017, Meta, Colombia.

Objetivos:

- Determinar la actividad enzimática de la catalasa sobre el peróxido de hidrógeno

- Observar el efecto del tiempo de reacción en la actividad catalítica
- Observar el efecto de la concentración de enzima sobre la actividad catalítica

Resultados

Tabla 1. Cantidades usadas en la elaboración de las soluciones fosfato.

Reactivos Propiedades y/o cantidades

Buffer fosfatos 0.02M, pH 7.0 (100 ml)

H2O2 0.05M, pH 7.0 (30ml)

KMn O4 0.005M, pH 7.0 (30 ml)

Agua destilada 20 ml
Tabla 2. Evaluación del efecto de la concentración de enzima

Reactivo Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Tubo E Tubo F

Buffer fosfato 10,2 10 9,5 8,5 8 7,5
H2O2 buffer 0,3 0,5 1 2 2,5 3
Enzima 2 2 2 2 2 2
Tiempo (min) 1 1 1 1 1 1
H2SO4 6N 2 2 2 2 2 2
Vol KMnO4 gastado 0,6 0,7 0,6 0,8 0,9 0,8
mol H2O2 iniciales 1,5*10-3  1,5*10-3   --  1,5*10-3    1,5*10-3  1,5*10-3 
mol H2O2 residuales 1,49*10-3 1,49*10-3 -- 1,49*10-3 1,49*10-3 1,49*10-3
mol H2O2 descompuesta  7,5*10-6 8,75*10-6   -- 1*10-5  1,13*10-5   1*10-5 
mol H2O2 descompuesta/min/mL  1,5*10-5 1,75*10-5  -- 2*10-5  2,23*10-5  2*10-5 
de enzima
*el tubo C se descartó

Teniendo en cuenta la siguiente formula se hallan moles iniciales para cada tubo:

C 1 ×V 1 =C2 ×V 2

C1 ×V 1
=C2
V2
TUBO A:

H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 0,3mL (0,0003L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,0003 L
5 M =C 2
Moles iniciales:
−3
5 M × 0,0003 L=1,5× 10 moles
Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):
 0,005 moles KMn O4 5 mol H 2 O2
0,0006 L KMnO4 × × =7,5 ×10−6
1L 2mol KMn O4

Moles residuales
−3 −6 −3
1,5 x 10 moles−7,5 ×10 moles=1,49× 10

min 7,5 ×10−6 mol −5

Mol H 2 O 2 descompuestas de enzima : =1,5 x 10
ml 1 min
2 ml

TUBO B:

H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 0,5mL (0,0005L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,0005 L
3 M =C 2
Moles iniciales:
−3
3 M × 0,0005 L=1,5 ×10 moles
Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):

0,005 moles KMn O4 5 mol H 2 O2

0,0007 L KMnO 4 × × =8,75× 10−6
1L 2mol KMn O 4

Moles residuales

1,5 x 10−3 moles−8 , 75 ×10−6 moles=1,49 ×10−3

 min 8,75 ×10−6 mol
Mol H 2 O 2 descompuestas de enzima : =1,75 x 10−5
ml 1min
2 ml

TUBO D:

H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 2mL (0,002L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,002 L
0,75 M =C 2
Moles iniciales:
−3
0,75 M × 0,002 L=1,5× 10 moles
Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):

0,005 moles KMn O4 5 mol H 2 O2

0,0008 L KMn O 4 × × =1 ×10−5
1L 2 mol KMn O 4

Moles residuales
−3 −5 −3
1,5 x 10 moles−1 ×10 moles=1,49 ×10
−5
min 1 ×10 mol −5
Mol H 2 O2 descompuestas de enzima : =2 x 10
ml 1 min
2 ml

TUBO E:
H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 2,5mL (0,0025L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,0025 L
0,6 M =C 2
Moles iniciales:
−3
0,6 M × 0,0025 L=1,5 ×10 moles

Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):

0,005 moles KMn O4 5 mol H 2 O2 −5

0,0009 L KMn O 4 × × =1,13 ×10
1L 2 mol KMn O 4

Moles residuales

1,5 x 10−3 moles−1,13 ×10−5 moles=1,488 ×10−3

−5
min 1,13 ×10 mol −5
Mol H 2 O2 descompuestas de enzima : =2,25 x 10
ml 1 min
2 ml

TUBO F:

H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 3mL (0,003L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,003 L
0,5 M =C 2
Moles iniciales:
−3
0 , 5 M × 0,003 L=1,5× 10 moles
Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):

0,005 moles KMn O4 5 mol H 2 O2 −5

0,0008 L KMn O4 × × =1 ×10
1L 2 mol KMn O4

Moles residuales
−3 −5 −3
1,5 x 10 moles−1 ×10 moles=1,49 ×10
−5
min 1 ×10 mol
Mol H 2 O2 descompuestas de enzima : =2 x 10−5
ml 1 min
2 ml

Evaluación del efecto de la concentración de

enzima
Vmax
Velocidad Enzimatica (U/ml)

25
20.00 20.00
20 17.50
15.00
15

10 Vmed

5
0.00
0
0 KM 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012
[H2O2] (M)

Gráfico 1 Actividad enzimática de la catalasa Vs concentración de H2O2

Teniendo en cuenta la siguiente formula se halla la concentración para cada tubo:

C 1 ×V 1 =C2 ×V 2

C1 ×V 1
=C2
V2
De tal forma que se obtiene:

Tabla 3. Concentración final de H2O2

Concentración H2O2
Tubo A 1,03E-03
Tubo B 1,72E-03
Tubo D
6,90E-03
Tubo E
8,62E-03

Teniendo en cuenta el grafico 1 (velocidad enzimática vs concentración) se halló el valor del Km de

la siguiente forma:

Si KM=[S], entonces la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a:

V max
V ( media )=
2
Como se conoce el valor de Vmax:

20
V ( media )=
2
V ( media )=1 0
Conociendo el valor de V media se encuentra el valor de K M en la gráfica, de tal forma que este es
igual a 0,00065.

Tabla 4. Evaluación del tiempo de reacción de una enzima

Reactivo Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Tubo E Tubo F

Buffer fosfato 10 10 10 10 10 10
H2O2 buffer 2 2 2 2 2 2
Enzima 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
 Tiempo (min) 0 1 2 4 6 8
H2SO4 6N 2 2 2 2 2 2
Vol KMnO4 gastado 5,6 2,8 2,7 0,6 0,6 0,2
mol H2O2 iniciales 1,5*10 -3
1,5*10 -3
1,5*10 -3
 -- 1,5*10 -3
1,5*10-3
mol H2O2 residuales 1,43*10-3 1,47*10-3 1,47*10-3  -- 1,49*10-3 1,50*10-3
mol H2O2 descompuesta  7*10 -5
 3,5*10 -5
 3,38*10 -5
 --  1*10 -5
 2,5*10-6
mol H2O2  0  1,75*10-5  8,44*10-6  --  8,33*10-7  1,56*10-7
descompuesta/min/mL de
enzima
*el tubo D se descartó

TUBO A:

H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 2mL (0,002L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,002 L
0,75 M =C 2
Moles iniciales:
−3
0,7 5 M × 0,002 L=1,5× 10 moles
Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):

0,005 moles KMn O4 5 mol H 2 O2 −5

0,0056 L KMnO 4 × × =7 × 10
1L 2mol KMn O 4

Moles residuales

1,5 x 10−3 moles−7 ×10−5 moles=1,43× 10−3

−5
min 7 ×10 mol
Mol H 2 O 2 descompuestas de enzima : =0
ml 0 min
0,5 ml
TUBO B:

H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 2mL (0,002L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,002 L
0,75 M =C 2
Moles iniciales:
−3
0,7 5 M × 0,002 L=1,5× 10 moles
Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):

0,005 moles KMn O4 5 mol H 2 O2 −5

0,0028 L KMn O 4 × × =3,5 ×10
1L 2 mol KMn O 4

Moles residuales

1,5 x 10−3 moles−3,5 ×10−5 moles=1,47 × 10−3

−5
min 3,5 ×10 mol −5
Mol H 2 O2 descompuestas de enzima : =1,75 x 10
ml 1 min
0,5 ml

TUBO C:

H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 2mL (0,002L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,002 L
 0,75 M =C 2
Moles iniciales:
−3
0,7 5 M × 0,002 L=1,5× 10 moles
Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):

0,005 moles KMn O 4 5 mol H 2 O 2 −5

0,0027 L KMnO 4 × × =3,38 ×10
1L 2mol KMn O 4

Moles residuales
−3 −5 −3
1,5 x 10 moles−3,38 ×10 moles=1,47 × 10
min 3,38 ×10−5 mol −6
Mol H 2 O 2 descompuestas de enzima : =8,44 x 10
ml 2 min
0,5 ml

TUBO E:

H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 2mL (0,002L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,002 L
0,75 M =C 2
Moles iniciales:

0,7 5 M × 0,002 L=1,5× 10−3 moles

Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):

0,005 moles KMn O4 5 mol H 2 O2 −5

0,0008 L KMn O4 × × =1 ×10
1L 2 mol KMn O4

Moles residuales
−3 −5 −3
1,5 x 10 moles−1 ×10 moles=1,49 ×10

min 1 ×10−5 mol

Mol H 2 O2 descompuestas de enzima : =8,33 x 10−7
ml 6 min
0,5 ml

TUBO F:

H2O2 0,05M- 30mL (0,03L):

Volumen usado: 2mL (0,002L)

0,05 M ×0,03 L
=C 2
0,002 L
0,75 M =C 2
Moles iniciales:
−3
0,7 5 M × 0,002 L=1,5× 10 moles
Moles descompuestas:

Teniendo en cuenta la ecuación

2 KMnO 4+ 3 H 2 SO 4 +5 H 2 O2 →2 Mn SO 4+ 5O2 + K 2 SO 4 +8 H 2 O
5 mol de H2O2 reaccionan con 2 mol de KMnO4 (0,005M):

0,005 moles KMn O 4 5 mol H 2 O 2

0,0002 L KMn O 4 × × =2,5 ×10−6
1L 2 mol KMn O 4

Moles residuales

1,5 x 10−3 moles−2,5 ×10−6 moles=1,50× 10−3

 min 2,5 ×10−6 mol
Mol H 2 O2 descompuestas de enzima : =1,56 x 10−7
ml 8 min
0,5 ml
Se graficó la actividad enzimática en función del tiempo de reacción (micromoles de H2O2
descompuestas/min/mL de enzima). *1 mol equivale a 1000000micromol

Tiempo de reacción vs actividad enzimática

20
17.5
18
16
Actividad Enzimática

14
12
10 8.43
8
6
4
20 0.833 0.16
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo de reaccion (min)

Gráfico 2 Actividad enzimática de la catalasa en función del tiempo de reacción

Análisis de los resultados

Bien se sabe que las enzimas son macromoléculas que actúan biológicamente como catalizadores
(aceleran las reacciones químicas). La mayoría de los catalizadores están formados por algunas
cadenas de aminoácidos que conforman las proteínas (Casi todas las enzimas son proteínas). [1][2]

Existen distintos factores que afectan la funcionalidad de las enzimas, puesto que estas dependen
de sus pliegues de las proteínas y como es que estas interactúan en ella. Factores como
temperatura, concentración, inhibidores y el pH son algunos mecanismos que pueden afectar el
funcionamiento óptimo de una enzima (No quiere decir que no funcione). Es necesario mantener
tasas de reacción altas para que gran parte de los procesos metabólicos en la célula funcionen
óptimamente y pueden sostener la vida del individuo. [3]

En sangre sé es capaz de detectar y cuantificar la actividad de las enzimas (Mayormente usado en

medicina), proporcionando información que complementa la capacidad del médico para
diagnosticar distintos tipos de enfermedades. Una de estas enzimas a estudiar es la catalasa
(peróxido de hidrógeno oxidorreductasa EC 1.11.1.6), una de las enzimas más abundantes en la
naturaleza y se encuentra ampliamente distribuida en el organismo humano, y por supuesto en la
sangre. La catalasa tiene una función de protección frente efectos nocivos de algunas sustancias
como lo es el peróxido de hidrógeno a través de descomposición en oxígeno molecular y agua sin
producción de radicales. [2][3]

2 H 2 O2 Catalasa 2 H 2 O+O2 Ec.1

→

Existe un modelo conocido, propuesto por Leonor Michaelis y Maud Leonora que describe este
estudio “cinética enzimática” se conoce como Cinética Michaelis-Menten, un modelo capaz de
explicar el mecanismo que toma la enzima para aumentar la tasa de reacción según la
dependencia con la concentración de la enzima y el sustrato. [3] [4]

La catalasa, una enzima catalizadora cuenta con la siguiente reacción general.

E+ S K 1 [ ES ] K 2 E+ P Ec.2
→ →

Donde “E” es la enzima, “S” es el sustrato, “[ES]” es la interacción de Enzima-sustrato y “P” el

producto de la interacción. [5]

Existe una ley de velocidad de reacción que describe como las concentraciones de todas las
especies presentes y como estas varían con el tiempo, cambiando las propiedades del sistema.
Esta se calcula midiendo el valor de cualquier propiedad adecuada que pueda relacionarse con la
composición del sistema como una función del tiempo. [6]

La permanganometría se usó en esta práctica como titulante de reductores, ya que es capaz de

hacer la valoración de soluciones de peróxido de hidrogeno, cuyo punto de titulación tiende a una
tonalidad rosa. La reacción química que se presenta es la siguiente.[7]
+2
+ ¿↔2 Mn +8 H 2 0+ 5 O2 ¿
−¿+5 H2 O2 +6 H ¿
2 Mn O4 Ec. 3

El objetivo de la práctica fue estudiar el tiempo de reacción y como varía la actividad catalítica en el
mismo. Como se pudo observar en la tabla 2 y tabla 3, fueron descartados el tubo C y tubo D
respectivamente con fines prácticos para una mejor visualización de las gráficas.

La grafica 1 muestra un aumento repentino de 0,3 ml (H 2O2 añadidos) a 0,5 ml, de ahí en adelante
se ve un aumento constante hasta llegar a los 2 ml de H 2O2 añadidos donde se puede ver otro
aumento repentino hasta 2,5 ml siendo el punto más alto de la gráfica o también conocido como
velocidad máxima y está estrechamente relacionado con el número de sitios activos que posee
esta enzima cuando se evalúa con el sustrato, puesto que dentro del sitio activo, los sustratos se
acercan entre sí en una alineación óptima con los distintos factores que participan en la catalización
de la transformación de sustratos en productos.[2] Después en la gráfica, de 2,5 ml a 3,0 hay una
disminución.

En la gráfica 2 se evidencia algo similar, puesto que en uno de los tiempos de reacción más bajos
(1 minuto), se tuvo la actividad enzimática más alta de todos los tiempos de reacción, demostrando
que aparte del pH, concentración de la enzima y otros factores, un tiempo de reacción menor es un
factor importante para un optima actividad enzimática, o al menos para la actividad enzimática de la
catalasa.

Consulta:

Estudio cinético de la actividad invertasa:

Materiales Reactivos

•Balanza (sensibilidad de 1 mg) • Acetato sódico

•Baños termostáticos (5) • Ácido acético
•Bloque seco o baño de agua hirviendo • Ácido clorhídrico
• Centrífuga preparativa • Nescofilm
• Espectrofotómetro/Colorímetro • Preparado liofilizado de invertasa de levadura
• Homogeneizador • Reactivo de Bradford
• pH-metro • Reactivo de DNS
• Ácido 2,3-dinitrosalicílico
• Tartrato sódico potásico
• Hidróxido sódico
• Sacarosa
• Tris

PROCEDIMIENTO:

- Determinación de velocidades iniciales.

Preparar 5 series de tubos (1 blanco y 2 problemas para cada serie o tiempo de incubación) con las
mezclas de ensayo indicadas en la Tabla 1. Las mezclas de ensayo se incuban a 55 ºC durante 5,
10, 15, 20 y 30 minutos.

Tabla 1. Mezcla de ensayo estándar para la determinación de la actividad invertasa

Componentes Blanco (de sustrato) Problema (x2)

Sacarosa 0,2 M (ml) 0,0 1,0
Tampón acetato 0,1M, pH 5 2,0 2,0
(ml)
Agua destilada (ml) 2,0 1,0
Extracto enzimático 100,0 100,0

Pasado el periodo de incubación se toma 0,1 ml de cada tubo y se le añade 1 ml del reactivo DNS,
incubándose posteriormente a 100 ºC durante 10 minutos. Enfriar y determinar la absorbancia a
570 nm de la mezcla problema utilizando como blanco la mezcla de ensayo del blanco de sustrato.
A partir de los valores de absorbancia y tiempo de incubación se pueden determinar los valores de
actividad enzimática. Alternativamente, se puede preparar una única serie de tubos, tomándose a
los intervalos de tiempo indicados alícuotas de 0,1 ml que se verterán sobre 1 ml de reactivo DNS,
previamente dispensado en un tubo de ensayo de tapón de rosca, mezclándose inmediatamente
para detener la reacción enzimática.

- Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad invertasa:

Preparar 5 series de tubos (1 blanco y 2 problemas para cada serie o concentración de enzima),
conteniendo diferentes volúmenes de extracto enzimático, tal como se indica en la Tabla 2. Las
mezclas de ensayo se incuban a 55 ºC durante 15 minutos. Pasado el periodo de incubación se
toman 0,1 ml de cada tubo y se le añade 1 ml del reactivo DNS, incubándose posteriormente a 100
ºC durante 10 minutos. Enfriar y determinar la absorbancia a 570 nm de la mezcla problema
utilizando como blanco la mezcla de ensayo del blanco de sustrato. A partir de los valores de
absorbancia y tiempo de incubación se pueden determinar los valores de actividad enzimática.

Tabla 2. Volúmenes de extracto y agua destilada a añadir a las diferentes mezclas de ensayo para
la determinación del efecto de la concentración de enzima sobre la actividad invertasa.

Mezcla de 1 2 3 4 5
ensayo B/P B/P B/P B/P B/P
Agua 2,0/1,0 1,9/0,9 1,8/0,8 1,7/0,7 1,6/0,6
destilada (ml)
Extracto 0,1/0,1 0,2/0,2 0,3/0,3 0,4/0,4 0,5/0,5
enzimático
diluido 1:4
(ml)
Nota: En todos los casos los blancos (B) recibirán 2,0 ml de tampón acetato y los problemas (P) 2,0
ml de tampón y 1,0 ml de sacarosa 0,2 M

- Efecto del pH sobre la actividad invertasa:

Preparar 5 series de tubos (un blanco y dos problemas para cada serie o valor de pH). En cada
serie de tubos se utilizarán las mezclas de ensayo 7 indicadas en la Tabla 1, añadiendo a cada
serie tampón de diferentes valores de pH (4,0- 4,5- 5,0- 5,5 y 7,0). Las mezclas de ensayo se
incuban a 55 ºC durante 15 minutos. Pasado el periodo de incubación, se toman 0,1 ml de cada
tubo y se le añade 1 ml del reactivo DNS, incubándose posteriormente a 100 ºC durante 10
minutos. Enfriar y determinar la absorbancia a 570 nm de la mezcla problema utilizando como
blanco la mezcla de ensayo del blanco de sustrato. A partir de los valores de absorbancia y tiempo
de incubación se pueden determinar los valores de actividad enzimática.

- Efecto de la temperatura sobre la actividad invertasa:

 Preparar 5 series de tubos (un blanco y tres problemas para cada serie o valor de temperatura). En
cada serie de tubos se utilizarán las mezclas de ensayo indicadas en la Tabla 1. Incubar las
mezclas de ensayo a temperatura ambiente (25 ºC), 35, 45, 55, y 65 ºC durante 15 min. Pasado el
periodo de incubación se toman 0,1 ml de cada tubo y se le añade 1 ml del reactivo DNS,
incubándose posteriormente a 100 ºC durante 10 minutos. Enfriar y determinar la absorbancia a
570 nm de la mezcla problema utilizando como blanco la mezcla de ensayo del blanco de sustrato.
A partir de los valores de absorbancia y tiempo de incubación se pueden determinar los valores de
actividad enzimática.

- Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad invertasa:

Preparar 6 series de tubos (un blanco y dos problemas para cada serie), en cada serie de tubos se
añadirá sacarosa a una concentración diferente. La preparación de una gama de soluciones de
sacarosa 2-100 mM se realizará siguiendo las indicaciones de la Tabla 3. Preparar las mezclas de
ensayo que se indican en la tabla 1 (un ensayo para cada una de las concentraciones de sustrato).
La mezcla de ensayo se incuba a 55 ºC durante 15 minutos. Pasado el periodo de incubación se
toman 0,1 ml de cada tubo y se le añade 1 ml del reactivo DNS, incubándose posteriormente a 100
ºC durante 10 minutos. Enfriar y determinar la absorbancia a 570 nm de la mezcla problema
utilizando como blanco la mezcla de ensayo del blanco de sustrato. A partir de los valores de
absorbancia y tiempo de incubación se pueden determinar los valores de actividad enzimática.
Cuando en el ensayo se utilicen concentraciones altas de sacarosa es fundamental que la mezcla
de ensayo se agite periódicamente durante el tiempo de incubación.

Tabla 3. Preparación de soluciones de sacarosa de diferente concentración.

[Sacarosa] en la [Sacarosa] añadida a Solución stock de Dilución

mezcla de ensayo la mezcla de ensayo sacarosa (mM)
(mM) (mM)
2,5,0 10 20 1:2
5,0 20 200 1:10
10,0 40 200 1:5
20,0 80 200 1:2,5
50,0 200 200 Ninguna
100,02 200 200 Ninguna

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