El MTT es un compuesto perteneciente a la familia de 

sales de tetrazolio, soluble en agua y

con color amarillo.

Al reducirse, el MTT se convierte en un compuesto de la familia formazanos, de color violeta e

insoluble en agua. Para cuantificarlo se suele disolver en un disolvente orgánico, como DMSO
(dimetilsulfóxido) y se mide su color mediante la A 570.

El fundamento de este ensayo de citotoxicidad es que el MTT o Bromuro de (3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difenil tetrazol), cuando es reducido por las deshidrogenasas
mitocondriales se transforma en el correspondiente formazán, que precipita en forma de
cristales coloreados. Estos cristales disueltos en dimetilsulfóxido presentan un máximo de
absorción a 540 nm. La medida de la absorbancia es por consiguiente directamente
proporcional al número de células viables

Ensayo del MTT. Este ensayo se basa en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinato-
deshidrogenasa en un compuesto coloreado de color azul (formazan), permitiendo determinar
la funcionabilidad mitocondrial de las células tratadas. Este método ha sido muy utilizado para
medir supervivencia y proliferación celular. La cantidad de células vivas es proporcional a la
cantidad de formazán producido.

Este método fue desarrollado por Mosmann en 1983 siendo modificado en 1986 por Francois
Denizot y Rita Lang

MOSMANN

Se ha utilizado una sal de tetrazolio para desarrollar un ensayo colorimétrico cuantitativo para
la supervivencia y proliferación de las células de mamíferos. El ensayo detecta células vivas,
pero no muertas y la señal generada depende del grado de activación de las células. Por tanto,
este método puede utilizarse para medir la citotoxicidad, la proliferación o la activación. Los
resultados se pueden leer en un espectrofotómetro de barrido multipozo (lector ELISA) y
muestran un alto grado de precisión. No se utilizan pasos de lavado en el ensayo. Las
principales ventajas del ensayo colorimétrico son su rapidez y precisión, y la falta de
radioisótopos. Hemos utilizado el ensayo para medir linfocinas proliferativas, estimulaciones
mitógenas y lisis mediada por complemento.

Muchos ensayos biológicos requieren la medición de células de mamíferos supervivientes y/o

en proliferación. Esto se puede lograr por varios métodos, por ejemplo, contando las células
que incluyen/excluyen un tinte, midiendo la proteína 5aCr-etiquetada liberada después de lisis
celular, y midiendo la incorporación de nucleótidos radiactivos ([3H]thymidine o
[lZSI]iododeoxyuridine) durante la proliferación celular. El método radiactivo puede ser
parcialmente automatizado y puede manejar un número moderadamente grande de muestras,
pero incluso con estos métodos, es difícil procesar miles de puntos de ensayo por día. En
nuestra investigación actual, analizamos muchas muestras de diversas linfocinas que inducen
la proliferación celular, por lo que requerimos un ensayo rápido y cuantitativo capaz de
manejar un gran número de muestras.

Las células viables se podían medir utilizando cualquiera de los varios métodos de tinción, pero
queríamos evitar cualquier paso de lavado que aumentara el tiempo de procesamiento y la
variación de la muestra. Los espectrofotómetros de escaneo multipozo (lectores ELISA) pueden
medir un gran número de muestras con un alto grado de precisión, por lo que investigamos la
posibilidad de usar una reacción de color como medida del número de células viables.
Idealmente, El ensayo colorimétrico para células vivas debe utilizar un sustrato incoloro que
sea modificado a un producto coloreado por cualquier célula viva, pero no por células muertas
o medio de cultivo tisular. Las sales de tetrazolio son candidatas atractivas para este propósito,
ya que miden la actividad de varias enzimas deshidrogenasas (Slater et al., 1963). El anillo de
tetrazolio se divide en las mitocondrias activas, por lo que la reacción se produce solo en las
células vivas.

Hemos desarrollado un ensayo colorimétrico rápido, basado en la sal de tetrazolio MTT (3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio bromuro), que mide solo células vivas y puede leerse en
un espectrofotómetro multipozo de barrido (lector ELISA). Este ensayo es versátil y
cuantitativo, y lo consideramos un avance significativo sobre las técnicas tradicionales para
varios ensayos de proliferación y citotoxicidad de uso común.

El ensayo colorimétrico MTT (tetrazolio) (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio

bromuro; Sigma catalog no. M2128) se disolvió en PBS a 5 mg/ml y se filtró para esterilizar y
eliminar una pequeña cantidad de residuos insolubles presentes en algunos lotes de MTT. En
los momentos indicados a continuación, se añadió una solución madre de MTT (10 /~1 por
100/~1 medio) a todos los pocillos de un ensayo, y se incubaron placas a 37°C durante 4 h.
Ácido-isopropanol (100 /~1 de 0.04 N HCI en isopropanol) se añadió a todos los pozos y se
mezcló a fondo para disolver los cristales de color azul oscuro. Después de unos minutos a
temperatura ambiente para asegurar que todos los cristales se disolvieron, las placas se
leyeron en un lector Dynatech MR580 Microelisa, utilizando una longitud de onda de prueba
de 570 nm, una longitud de onda de referencia de 630 nm, y un ajuste de calibración de 1,99
(o 1,00 si las muestras estaban fuertemente coloreadas). Las placas se leyeron normalmente
dentro de 1 h de la adición del isopropanol.

Resultados En experimentos preliminares, probamos varias sales de tetrazolio mediante

incubación con células durante varias horas. El reactivo más prometedor fue MTT, un sustrato
de color amarillo pálido que produjo un producto de formazán azul oscuro cuando se incubó
con células vivas.

El ensayo colorimétrico mide el número y la actividad de las células vivas al final del ensayo

Esto sugiere que el ensayo MIT colorimétrico puede tener una aplicabilidad muy amplia para
medir la supervivencia y/o la proliferación de varias células y puede aplicarse potencialmente a
cualquier ensayo en el que las células vivas deban distinguirse de las células muertas o de la
falta de células. Los resultados en la Fig. 2 muestran que las células muertas no pueden
escindir MIT dentro de los 30 minutos posteriores a la lisis mediada por complemento. Esto
indica que el ensayo también tiene un valor potencial para la medición cuantitativa y rápida de
la muerte celular, por ejemplo, en la tipificación de HLA. El ensayo MTT también puede ser
aplicable al ensayo de linfocitos T citotóxicos,