Observar

Recuento de Bacillus cereus

Muestra

Observar las colonias redondas, chatas, secas, de color rosado

Siembra en sendas placas del medio de cultivo con 0,1 mL de
a violeta pues no ha sido fermentado el manitol, rodeadas de un
las diluciones decimales del alimento
precipitado causado por la actividad lecitinasa

Incubar a 30°C durante 24-48h

Repicar 5 colonias en agar nutritivo e incubar a 30oC durante

Medio de cultivo
24 hs. Colorear las preparaciones; observar el endosporo verde,

central a subterminal, que no deforma la célula y los glóbulos

COLORACIÓN DE ENDOSPOROS Y GLOBULOS DE POLIHIDROXI-

AGAR MYP SOLUCIÓN DE POLIMIXINA
BUTIRATO

Cubrir con verde de Volcar y cubrir con xileno durante 10

malaquita al 5% y calentar segundos. Secar y colorear con
dos o tres veces sin que se safranina al 0,5% durante 20 segundos
Disolver 500.000
Extracto de carne 1 unidades de sulfato seque.
Distribuir en porciones de 200 mL
g, peptona 10 g, D- de polimixina B
manitol 10 g,cloruro Esterilizar a 120°C durante 20 estéril en 50 mL de
Lavar, secar con papel y cubrir durante
de sodio 10 g, rojo minutos agua destilada
20 minutos con solución de negro
de fenol 0,025 g, estéril.
minutos. Sudan B al 0,3% en etanol al 70%.
agar 15 g, agua 900
Enfriar a 50°C, agregar 10 mL de la Volcar y cubrir con xileno durante 10
mL.
emulsión de yema de huevo y 2 mL segundos.
de la solución de polimixina
Recuento de Clostridium perfringens
Muestra Peptona 1 g, cloruro de sodio 9 g,

clorhidrato de cisteína 1 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120oC durante 20

minutos.

Preparar diluciones 10-1 a 10-5 en un diluyente con cisteína

Triptona 15 g, extracto de levadura 10 g, citrato férrico

0,5 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,0. Esterilizar a 120oC durante 20

Distribuir 10 mL de cada dilución en 10 tubos estériles con tapa a minutos. Enfriar a 50oC. Añadir 10 mL de sulfito de sodio heptahidratado

rosca y volcar de inmediato en cada uno 10 mL de agar sulfito fundido y a 50°C. al 5% y 10 mL de D-cicloserina al 4%, esterilizados por filtración

Agar 15 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120oC durante 20 minutos.

Una vez gelificado cubrir con una capa de agar-

agua de 3 cm de espesor. Incubar a 46oC durante 14-18 hs.

MEDIO GELATINA LACTOSA. Triptosa 15 g, extracto de levadura

10 g,lactosa 10 g, gelatina 120 g, rojo de fenol 0,05 g, agua 1 litro,
Una vez gelificado cubrir con una capa de agar- pH 7,5.Distribuir en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 120oC
durante 10minutos. La licuación se observa luego de enfriar el
agua de 3 cm de espesor. Incubar a 46oC durante 14-18 hs. cultivo.

Contar el número de colonias negras y multiplicar por el factor

de dilución correspondiente.

MEDIO FERMENTACION. Tripticase 10 g, neopeptona 10 g, agar 2g,

tioglicolato de sodio 0,25 g, agua 1 litro, pH 7,4. Distribuir en tubos con

Confirmar mediante observación de la inmovilidad de las
tapa a rosca. Esterilizar a 120°C durante 15 minutos. Agregar 1 mL de
células, la reducción de nitratos, la licuación de gelatina en 24-48
solución estéril de rafinosa al 10%
horas y la producción de ácido y gas por fermentación de lactosa

pero no de rafinosa.
Recuento de Bacillus formadores de LIMO

Muestra

Pesar 50 g de harina u otro ingrediente en un recipiente

estéril.

Agregar 450 mL de solución de peptona al 0,1%, agitar

enérgicamente durante 2 minutos y colocarlo en un baño de

agua hirviente durante 20 minutos.

AGAR TRIPTONA GLUCOSA. Triptona 5 g, extracto de levadura 2,5 g,

Preparar las diluciones 10-2 a glucosa 1 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7. Esterilizar a 120oC durante 15

10-4. Sembrar 0,1 mL en sendas placas de agar triptona glucosa, minutos

extendiendo con una varilla de vidrio en L.

Incubar a 35°C durante 48 hs.

Contar las colonias blanco grisáceo, que se vuelven secas y

arrugadas. Multiplicar por el factor de dilución correspondiente,

para obtener el número de endosporos de bacterias formadoras

de limo por gramo.

 Frutas y hortalizas Recuento microscópico de MOHOS

Muestra

Si se necesitan más de tres trozos para lograr esa longitud, se

Colocar en el círculo central de la cámara de Howard 1 gota de
considera como un campo negativo.
la muestra bien mezclada y diluida con agua o azul-láctico, de tal
.
manera que la concentración de residuo sólido de la suspensión

sea 8-9%.

Examinar al menos dos cargas y calcular el porcentaje de

AZUL-LACTICO. Azul campos positivos

de algodón (= azul de
Depositar el cubreobjetos de tal manera que el material se .
anilina) 0,1 g, ácido
láctico distribuya por todo el círculo y se formen los anillos de Newton en

(85%) 100 mL las franjas laterales.

El material examinado en cada campo

microscópico tiene un volumen definido.

Se observan al menos 25 campos microscópicos separados en

cada carga de la cámara.

Si tres trozos de hifas sumados miden

1/6 del campo, se considera positivo dicho campo.

Recuento de Mohos y levaduras
Muestra

DILUYENTE TENSOACTIVO. Peptona 1 g, polisorbitano 80 (tween) 0,5

Suspender 10 g del alimento en 90 mL de diluyente tensoactivo
mL, agua 1 litro. Esterilizar a 120oC durante 15 minutos
(10-1), pasar 1 mL a un tubo con 9 mL de diluyente (10-2).

AGAR-DICLORÁN-CLORANFENICOL (general). Glucosa 10 g, peptona 5

Colocar 0,1 mL de cada dilución en la superficie de una placa g, extracto de levadura 5 g, fosfato monopotásico 1 g, sulfato de

de medio de cultivo y extender con una varilla de vidrio doblada en L. magnesio heptahidrato 0,5 g, agar 20 g, agua 1 litro, cloranfenicol 0,1 g,

diclorán (0,2% p/v en etanol) 1 mL. Esterilizar a 120°C durante 15 minutos.

Incubar durante 5 días a 22-25°C.

AGAR-GLUCOSA-TRIPTONA-LEVADURA (para levaduras en ausencia de

mohos). Glucosa 100 g, triptona 5 g, extracto de levadura 5 g,

cloranfenicol 0,1 g, agar 20 g, agua corriente 1 litro. [Puede adicionarse

Observar las placas que
0,03 g de azul tripán al medio neutro]. Esterilizar a 120°C durante 10 minutos
tengan entre 10 y 100 colonias de mohos o levaduras.

AGAR-DICLORÁN-GLICEROL (productos secos). Glucosa 10 g, peptona

5 g, fosfato monopotásico 1 g, extracto de levadura 5 g, sulfato de

Suspender los productos secos en una solución de sacarosa al magnesio heptahidrato 0,5 g, agar 20 g, cloranfenicol 0,1 g, diclorán

20% p/v. (0,2% p/v en etanol) 1 mL, glicerol 220 g, agua csp 1 litro (aw=0,955).

Esterilizar a 120°C durante 15 minutos.

AGAR-MALTA-GLUCOSA-SAL (productos salados). Extracto de malta 20

Emplear un diluyente con 5% p/v de NaCl para los
g, extracto de levadura 5 g, cloruro de sodio 100 g, glucosa 120 g, agar
productos salados.
20 g, agua 1 litro, aw=0,88. Se calienta en autoclave con vapor fluente

durante 30 minutos o en baño de agua hirviente.

Si la muestra es muy ácida, ajustar el pH de AGAR-MALTA-ACÉTICO (productos ácidos). Extracto de malta 20 g,

la suspensión a 3,5-4,0 extracto de levadura 5 g, agar 20 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120 oC

durante 15 minutos. Agregar 5 mL de ácido acético glacial al medio

estéril, fundido y tibio (pH aprox. 3,8)

Carne rojas Recuento de bacterias Aerobias Mesofilas

Muestra
Contar las colonias de las placas que presentan 30 a 300.

Multiplicar el número obtenido por la inversa de la dilución

Extraer con un bisturí estéril una capa de 2-3 mm de correspondiente y la inversa del volumen sembrado para obtener

profundidad y área externa de 10 cm2 y colocarla en un frasco de las ufc/g o cm2, según corresponda.

vidrio con 100 mL del diluyente y 20 perlas de vidrio estériles.

Agitar enérgicamente durante 2 a 3 minutos.

Pasar un hisopo estéril sobre el área central de la plantilla

estéril (100 cm2) y colocarlo en un tubo con 10 mL de diluyente.

Pesar asépticamente 25 g de la muestra picada, agregar 225
Apretar el hisopo repetidas veces contra las paredes y agitar para
mL de diluyente en bolsas de plástico estériles y homogenizar en
recuperar los microorganismos.
un 'Stomacher' durante 2 minutos, o en frascos de vidrio estériles

con 20 ó 30 perlas de vidrio. Agitar repetidas veces por espacio

de 2 a 3 minutos. Cada 0,1 mL del líquido

corresponde a 1 cm2. Hacer la dilución 10-1 y otras sucesivas

según la superficie analizada.

Llevar 1 mL de cualquiera de las suspensiones anteriores (10-1)

a un tubo con 9 mL de diluyente, mezclar bien (10-2) y repetir la

operación para obtener sucesivamente otras diluciones según el

material analizado. Sembrar e incubar como se indica

arriba. Contar las colonias y calcular las ufc/cm2 multiplicando el

número obtenido por la inversa de la dilución correspondiente.

Depositar 0,1 mL de las tres últimas

diluciones en sendas placas de agar para recuento y distribuir el

inóculo con una varilla de vidrio previamente flameada. Incubar

las placas invertidas a 35oC durante 48 hs.

Recuento de Brochothrix thermosphacta
Muestra

AGAR ESTREPTOMICINA-TALIO. Peptona 7 g, triptona 7 g, peptona de

Sembrar las placas de agar estreptomicina-talio con 0,1 mL de soja 6 g, extracto de levadura 2 g, glicerol 15 g, fosfato dipotásico 1 g,

las diluciones decimales de la muestra, extendiendo el inóculo sulfato de magnesio hidratado 15 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,0.

con una varilla de vidrio en L. Esterilizar a 120oC durante 20 minutos. Enfriar hasta 50oC y agregar, en

condiciones de asepsia, 10 mL de sulfato de estreptomicina al 5%, 10

mL de cicloheximida al 0,5% y 10 mL de acetato de talio al 0,5%, todas

ellas esterilizadas por filtración.

Incubar 2 días a 22oC. Contar las

colonias regulares y más bien pequeñas.

AGAR TSGY. Triptona 17 g, peptona de soja 3 g, extracto de levadura

Si es necesario confirmar, hacer una estría recta en agar TSGY 3g, cloruro de sodio 5 g, fosfato dipotásico 2,5 g, glucosa 2,5 g, agar
15 g,, agua 1 litro, Esterilizar a 120oC durante 20 minutos
e incubar a 4oC durante 10 días. Son bacilos no esporulados,

catalasa positivo.
Recuento de E. coli
Muestra

Preparar las diluciones de la muestra (10-1 y 10-2) por alguno de

los procedimientos descriptos más atrás.

Sembrar 0,1 mL de

cada dilución en sendas placas de medio de cultivo.

AGAR EOSINA-AZUL DE METILENO. Peptona 10 g, lactosa 10 g,

Incubar a 35oC durante 24 - 48 hs. fosfatodipotásico 2 g, eosina Y (solución acuosa al 2%) 20 mL, azul de
metileno(solución acuosa al 0,25%) 25 mL, agar 15 g, agua 1 litro, pH
7,1.Esterilizar a 120oC durante 15 minutos.

Incubar a 35oC durante 24 - 48 hs. Contar las colonias oscuras
con brillo verde metálico en agar-eosina-azul de metileno o las de
color púrpura con halo del mismo color y fluorescentes en agar
McConkey-MUG.
AGAR MC CONKEY-MUG. Peptona 20 g, lactosa 10 g, sales biliares
1,5g, cloruro de sodio 5 g, rojo neutro (sol. hidroalcohólica al 1%) 3
mL,violeta cristal (sol. acuosa al 0,1%) 1 mL, metil-umberiferil-β-
glucurónido0,05 g, agar 15 g, agua estéril 1 litro, pH 7,1. Calentar a
ebullición hastadisolución completa
 Muestra AGAR CITRATO DE SIMMONS. Sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g,

Identificación de E. coli fosfato monoamónico 1 g, fosfato dipotásico 1 g, citrato de sodio

dihidrato 2 g, cloruro de sodio 5 g, azul de bromotimol (solución al 0,2%)

Tomar material de varias colonias y suspenderlas en 1 mL de diluyente.
40 mL, agar 15 g, agua 1 litro, pH 6,8-7. Esterilizar a 120oC durante 15 minutos.

. de soja 6 g, sulfato ferroso amónico

MEDIO SIM. Triptona 20 g, peptona
Hacer una tinción de Gram y la reacción de catalasa.
0,2 g, tiosulfato de sodio 0,2 g, cloruro de sodio 5 g, agar 3,5 g, agua 1

litro, pH 7,3. Esterilizar a 120oC durante 15 minutos.

Sembrar por punción con aguja en el medio SIM, y con asa en REACTIVO DE KOVAC. Disolver 1 g de p-dimetil-amino-benzaldehído en

caldo glucosa y agar citrato. 15 mL de alcohol isoamílico y añadir 20 mL de ácido clorhídrico concentrado

CALDO GLUCOSA. Proteosa-peptona 5 g, glucosa 5 g, fosfato

Incubar a 35oC durante 48 hs.
dipotásico 5 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120 oC durante 15 minutos.

Observar el color del agar citrato si tiene color azul hubo

ROJO DE METILO. Disolver 10 mg en 30 mL de etanol 96o y añadir 20
asimilación del citrato.
mL de agua, esta solución es roja a pH 4,4 y amarilla a pH 6,2..

En el medio SIM el crecimiento de E. coli se aleja de la punción

de siembra debido a la movilidad y no colorea el medio de negro (H2S CREATINA ALCALINA. Disolver 0,3 g de creatina y 40 g de hidróxido de
negativo)..
potasio, en 100 mL de agua destilada.
.

Añadir 1 mL del reactivo de Kovac y agitar, al cabo de 10 minutos aparece color

rojo en capa superior si hubo formación de indol..

Dividir en dos tubos el cultivo en caldo glucosa.

Tubo 1: agregar unas gotas de rojo de metilo, se verá color rojo si hubo una fermentación ácida mixta

Tubo 2: añadir 1 mL de α-naftol y 0,5 mL de creatina alcalina,dejar en reposo hasta 3 hs. Si hubo
formación de acetoína, un intermediario de la fermentación butilén-glicólica, aparecerá un color rojo
(reacción de Voges-Proskauer).
PRESENCIA-AUSENCIA DE E. coli
Muestra

Suspender la muestra en el diluyente para revitalizar las células

y dejar a 30oC durante 4 a 6 hs.

Agregar igual volumen del medio MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO CONCENTRADO. Peptona 20 g, glucosa 5

de enriquecimiento concentrado. g, fosfato dipotásico 8 g, fosfato monopotásico 2 g, bilis de buey 40 g,

verde brillante (sol. acuosa al 0,5%) 3 mL, agua esteril 1 litro, pH 7,2.

Calentar a ebullición hasta disolver.

Incubar durante 18-24 h a 37oC.

Hacer el aislamiento sobre agar McConkey- AGAR MC CONKEY-SORBITOL-TC. Peptona 20 g, sorbitol 10 g, desoxi-
sorbitol-TC e
colato de sodio 1 g, cloruro de sodio 5 g, violeta cristal (sol. acuosa al 0,1%)
1 mL, rojo neutro (sol. hidroalcohólica al 1%) 3 mL, agar 15 g,

agua estéril 1 litro, pH 7,1

Observar las colonias incoloras y confirmar
mediante una prueba serológica de aglutinación.

AGAR MC CONKEY-SORBITOL-TC. Peptona 20 g, sorbitol 10 g, desoxi-

colato de sodio 1 g, cloruro de sodio 5 g, violeta cristal (sol. acuosa al 0,1%)

1 mL, rojo neutro (sol. hidroalcohólica al 1%) 3 mL, agar 15 g,

agua estéril 1 litro, pH 7,1