FACULTAD DE INGENIERÍA MARÍTIMA Y

CIENCIAS DEL MAR

FICHA DE LA PRÁCTICA PARA LABORATORIO

CÓDIGO

MATERIA Herramientas para el diagnóstico de Enfermedades Ac. ACUG1043

LABORATORIO
1

NOMBRE DE LA Extracción de ADN & electroforesis.

PRÁCTICA

OBJECTIVOS:

- Elaborar los siguientes métodos de laboratorio como la extracción de ADN y de electroforesis

mediante las prácticas correspondientes realizados en los laboratorios de la Espol para así afianzar
los conocimientos vistos en clase.

MARCO TEÓRICO:

ELECTROFORESIS

Se puede considerar como una técnica de laboratorio para las cual se realiza para separar moléculas
de ADN, ARN así como también de las proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica; en la
que usa corriente eléctrica para mover las moléculas a través de un gel o de otro tamiz. Los cuales
permite que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las moléculas más grandes,
determinando el tamaño de las moléculas, usando estándares de tamaños conocidos que se separan
en el mismo gel y comparado con la muestra.

EXTRACCIÓN DE ADN

Es el método más utilizado para el diagnóstico de enfermedades, dentro del marco general de la
acuacultura, se procede a realizarlo luego de la extracción de la muestra, en la que se establece el
protocolo de la cual se realiza la preparación de la muestra mediante se agrega TEN de la cual se
macera hasta homogenizar la muestra para obtención exitosa de datos confiables y reproducibles en
la obtención de marcadores moleculares de las cuales se obtendrían a trabes de la técnica de PCR y
secuenciación.

MATERIALES & EQUIPOS:

- Para realizar a electroforesis necesitamos lo siguiente:
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-TAE (conductor polarizado ADN)

-Tinte (Syber Safe)
-Pipeta 100 mcl
-0,5 gr de Agarosa
-Microondas
-Máquina de electroforesis
- Lagartos de carga (+) y (-)

- Para la extracción de ADN

-Tejido o muestra conservada previamente con etanol al 95%

-Pipeta de 750 mcl
-solución salina
-Vortex
-Buffer lisis ( Dodecilsulfato sódico)
-Contenedor de agua a 95°c
-Máquina centrífuga
-etanol al 95% helado
-70 ml de agua Pura

PROCEDIMIENTO & FÓRMULAS:

Para empezar la experimentación, primero comenzamos a calcular el valor de TAE, SYBER SAFE, la cantidad
de agarosa (polvo) de la cual será disuelta en 25 ml de agua.

- Cálculo del TAE

Poseemos un volumen inicial de 1000 ml, cuya concentración es de 1x, volumen del TAE es 50 x.

C1V1=C2V2
V1(50X)=C2(1000ml)
V1= C2(1000 ml)/ 50
V1= 20 ml

- Cálculo del Syber Safe

Necesitamos encontrar el volumen inicial, en la cual tiene una concentración 1000x, y su volumen
final es de 25 ml que posee una concentración final de 1x

C1V1=C2V2
(1000ml)V1=C2(25ml)
V1=25ml/ 1000ml= 0,0025ml
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- Cálculo de Agarosa en 25 ml

Se necesita saber cuantos gramos de agarosa al 2% se necesita colocar en 25 ml de agua.

gr=ml
2gr  100ml
X  25 ml
=(25*2)/100= 0,5 gr agarosa.

Luego procedemos a realizar la electroforesis

-Se comienza teniendo prepara la cámara de electroforesis, junto con los dos lagartos (+) y (-)
-Luego se procede a pesar los 0,5 gr de agarosa para luego ser mezclado con los 20 ml de agua, en
la que se revuelve y después se procede a calentarse en la microonda durante 50 sg para observar
que se homogeniza la mezcla
- agarramos la maquina de electroforesis y añadimos los peines del lado de 1,5 para tenerlos listo
con los lagartos conectados
-posteriormente utilizaremos el tinte de syber safe de la que con la ayuda de una pipeta 100 mcl
agregamos en la solución calentada para luego verterlo en la cámara de electroforesis con los peines
puestos para dejarlo reposar aproximadamente 50 minutos para que se solidifique
- Luego del tiempo transcurrido, sacamos los peines y con la ayuda de una pipeta tomamos la
muestra para colocarla en cada uno de los pocillos que fueron creados al sacar los peines, dejamos
reposar
- Por último, mediante luz uv, podemos observar el resultado de las muestras analizadas.

Para la extracción de ADN se procedió a realizar lo siguiente:

-Previamente la muestra del tejido se debe exponer a etanol al 95%

-Luego se hace lavado de residuos de etanol por lo que se pone con una pipeta 750 mcl de solución
salina en un tubo de 1,5 ml y se coloca una muestra para luego agitar en el Vortex.
-Luego se reirá la solución salina 750 ml y se coloca Buffer lisis ya que dejará expuesto el ADN
que está dentro del tejido.
-Posteriormente se lo expone a calor a 95°C para luego llevarlo a la centrífuga en la primera se
realiza 13000 rpm/10 minutos que luego tenemos restos de tejidos, posteriormente agregar 150 ml +
300 ml etanol al 95% de etanol helado por lo que se hace es precipitar el ADN, para otra vez
centrifugar 13000 rpm/5 minutos para luego lavar etanol al 70% luego lo mandamos centrifugar por
5 minutos mas en la que luego se deja secar por 10 minutos
- Luego se agrega 70 ml de agua pura poniendo en el Vortex, para luego guardar las muestras en
etanol en refrigeración para el análisis en PCR.

ILUSTRACIONES:
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CONCLUSIONES:

Se concluye que la extracción del ADN es uno de los métodos más importantes para los análisis posteriores
como previo para otros exámenes por lo es de principal importancia que se realice de la manera más
adecuada

RECOMENDACIONES
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En la práctica de electroforesis , se recomienda a tener cuidado en la adición de tinte Syber safe debido que
altamente radioactivo por lo cual se vería tomar las medidas preventivas para la realización de la misma, así
como también

Elaborado por: _Miriam Aurora Sánchez S.

Aprobado por: _____________________________
Fecha de elaboración: __9/9/2020_______