FUNDAMENTOS Y APLICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS: EI

(Impacto Electrónico), APCI (Ionización Química a presión atmosférica), ESI (Electrosprays), para el
análisis de muestras de interés farmacéutico y manejo de los equipos para desarrollar estos
métodos.

Historia de la espectrometría de masas

Thomson utilizó Como se ha descrito en la historia de muchos instrumentos, la mayoría de ellos han
sido desarrollados en el campo de la física. La espectrometría de masas presenta su desarrollo una
vez que Joseph Jhon Thomson asume una cátedra en la Universidad de Cambridge, Inglaterra.
Como se describe Thomson hasta ese momento había dado aportes grandes en la física teórica,
pero la cátedra Cavendish se fundamentaba en experimentación. Thomson tuvo que elegir
rápidamente un nuevo programa de investigación experimental, por lo que eligió la transmisión de
electricidad a través de gases, descubrió que descargas eléctricas en gases producían iones y que
estos rayos de iones podían adoptar diferentes trayectorias parabólicas de acuerdo a su masa
cuando pasaban a través de campos electromagnéticos. Dahl, P. F. Flash of the Cathode Rays: A History of J. J. Thomson’s Electron;
Institute of Physics Publishing: Bristol, U.K., 1997 Esa investigación estaba en discusión por muchos científicos quienes
intentaban contestar la respuesta a la siguiente pregunta ¿Cuál a es la naturaleza de los rayos
catódicos?. Muchos pensaron que estaban hechos de partículas y otros tantos que eran olas, sin
embargo después de 50 años de investigación nadie daba una respuesta definitiva. Así fue como
Thomson comenzó a introducirse en el tema, y aunque como se describe no era la excelencia en el
laboratorio practico las ayuda con la que contaba fue suficiente para crear un instrumento que
desviara estas partículas al someterlas a un campo magnético, E. Everett, su asistente aporto
mucho para este desarrollo de este aparato. De Laeter, J.; Kurz, M. D. J. Mass Spectrom. 2006, 41, 847–854 , Biemann, K. Int. J. Mass
Spectrom. 2007, 259, 1–7

Por primera vez su aparato para medir e/m de las partículas fundamentales, electrones, en 1897.
Dos años más tarde, nuevamente con la ayuda de Everett, construyó un instrumento que podía
medir simultáneamente e/m y e, midiendo indirectamente la masa del electrón. Por este trabajo
"descubrir" el electrón, recibió el Premio Nobel de Física de 1906. Los primeros trabajos de Thomson
sobre rayos catódicos sentaron las bases del campo de la Espectrometria de masas (EM).
Finalmente, Thomson, con la ayuda de su protegido Francis Aston (que ganaría su propio Premio
Nobel de Química en 1922), construyó lo que luego sería reconocido como el primer espectrómetro
de masas para medir las masas de los átomos cargados. Este instrumento utilizaba tubos de
descarga de gas para generar iones, que luego se pasaban a través de campos eléctricos y
magnéticos paralelos. Los iones se desviaron en trayectorias parabólicas y luego se detectaron en
una placa fotográfica. En las primeras tres décadas del siglo XX, Aston y otros científicos
rediseñaron los instrumentos para mejorar el poder de resolución y comenzaron a usarlos para
separar y probar la existencia de isótopos elementales. Hillenkamp, F.; Karas, M. Int. J. Mass Spectrom. 2000, 200, 71–77., Griffiths, J.
(2008). A brief history of mass spectrometry. Anal. Chem, 80(15), 5678-5683.

En la década de los 20´s, Arthur J. Dempster de la Universidad de Chicago, desarrolló un analizador

magnético que enfocaba iones formados por impacto electrónico ( electron impact) sobre un colector
eléctrico. Este diseño fue adaptado por Josef Mattauch, Richard Herzog, Kenneth Bainbridge, Alfred
Nier y otros, permitiendo importantes descubrimientos en física atómica y nuclear en los 30´s. Pero
fue hasta la década de los 40´s que los primeros espectrómetros de masas comerciales aparecieron.
Durante los 30´s y 40´s, Nier y algunos otros incorporaron las tecnologías de vacío y electrónica para
mejorar el desempeño de los primeros diseños de espectrómetros. Instrumentos de doble enfoque,
que combinan analizadores magnéticos y electrostáticos fueron introducidos permitiendo
incrementar la precisión. Estos instrumentos fueron originalmente desarrollados con el propósito de
determinar en forma precisa los pesos atómicos de los elementos y sus isótopos.
En la década de los 40´s se construyeron los primeros espectrómetros de masas disponibles
comercialmente por medio de diferentes compañías de Europa y Estados Unidos. En esta década
también se desarrolló el espectrómetro de masas de tiempo de vuelo ( time-of-flight, TOF), un
concepto propuesto como un analizador más barato y simple en el cual los iones son separados en
base a sus diferencias en velocidad cuando son acelerados en un tubo de vuelo lineal. De Laeter, J.; Kurz, M.
D. J. Mass Spectrom. 2006, 41, 847–854

A principios de los 50´s, los patrones de fragmentación de los iones comenzaron a ser entendidos,
aunque los aparatos disponibles estaban limitados en el rango de masas. Otro tipo de instrumento
desarrollado para el propósito de acoplar el espectrómetro de masas a un cromatógrafo de gases
fue el filtro de masas cuadrupolo, el cual usa un campo eléctrico cuadrupolar conteniendo
componentes de radiofrecuencia y corriente directa para separar iones. En 1953 el analizador de
masas cuadrupolo fue patentado. Este analizador fue reportado por Wolfgang Paul de la Universidad
de Bonn, quien después ganó el Premio Nobel de Física en 1989 por su trabajo de trampa de iones
(ion trapping). En 1956 las primeras muestras biológicas (esteroides) fueron exitosamente
analizadas.
En los 60´s la espectrometría de masas se estableció como una técnica para caracterizar
compuestos orgánicos. Este fue asistido con la introducción de una fuente de ionización química.
Otros métodos de ionización surgieron incluyendo desorción de campo, ionización secundaria
(secondary ionization MS o SIMS), desorción de plasma y desorción láser. Aparecieron las primeras
publicaciones científicas especializadas incluyendo Organic Mass Spectrometry. La espectrometría
de masas en tándem (MS/MS) surgió con el desarrollo de procedimientos de disociación por
inducción de colisión, permitiendo obtener información estructural de componente de una mezcla
usando dos etapas de análisis de masas. Hillenkamp, F.; Karas, M. Int. J. Mass Spectrom. 2000, 200, 71–77., Griffiths, J. (2008). A brief history of
mass spectrometry. Anal. Chem, 80(15), 5678-5683. Hoy, la EM está principalmente bajo el ámbito de la química analítica

Fundamentos de la espectrometría de masas

La espectrometría de masas a demostrado ser una técnica analítica utilizada para cuantificar
materiales conocidos, identificar compuestos desconocidos dentro de una muestra y dilucidar la
estructura y las propiedades químicas de diferentes moléculas. El proceso completo implica la
conversión de la muestra en iones gaseosos, con o sin fragmentación, que luego se caracterizan por
su relación masa/carga (m/z) y abundancia relativa. http://www.usp.br/massa/2014/qfl2144/pdf/MassSpectrometry.pdf
El primer paso en el análisis espectrométrico de masas de los compuestos es la producción de iones
en fase gaseosa, por ejemplo por ionización electrónica:

Este ion molecular normalmente sufre fragmentaciones, debido a su baja estabilidad. Ademas que
es un catión radical con un número impar de electrones, este puede fragmentarse para dar un
radical y un ion con un número par de electrones, o una molécula con un nuevo catión radical.
Destacamos la importante diferencia entre estos dos tipos de iones y la necesidad de escribirlos
correctamente: Estos dos tipos de iones tienen diferentes propiedades químicas. Cada ión de
producto primario que es derivado del ión molecular puede, a su vez, sufrir fragmentación, etc.
Todos estos iones se separan en el espectrómetro de masas de acuerdo con su relación de masa a
carga.

Esta técnica básicamente estudia el efecto de la energía ionizante en las moléculas. Depende de las
reacciones químicas en la fase gaseosa en la que se consumen las moléculas de muestra durante la
formación de especies iónicas y neutras. Un espectrómetro de masas genera múltiples iones de la
muestra bajo investigación, luego los separa de acuerdo con su relación específica de masa a carga
(m/z), y luego registra la abundancia relativa de cada tipo de ion. El primer paso en el análisis
espectrométrico de masas de los compuestos es la producción de iones de fase gaseosa del
compuesto, básicamente por ionización electrónica. Este ion molecular sufre fragmentación. Cada
ión de producto primario derivado del ión molecular, a su vez, sufre fragmentación, y así
sucesivamente. Los iones se separan en el espectrómetro de masas de acuerdo con su relación de
masa a carga, y se detectan en proporción a su abundancia. Se produce así un espectro de masas
de la molécula. Muestra el resultado en forma de una gráfica de la abundancia de iones versus la
relación masa-carga. Los iones proporcionan información sobre la naturaleza y la estructura de su
molécula precursora. https://www.csn.es/documents/10182/914813/OFC-04-06%20Radiaci%C3%B3n%20y%20protecci%C3%B3n%20radiol%C3%B3gica%20(Gu%C3%ADa%20did%C3%A1ctica%20para%20Educaci%C3%B3n%20Secundaria)

El instrumento consta de tres componentes principales: Fuente de iones- para producir iones
gaseosos a partir de la sustancia estudiada. Analizador- para resolver los iones en sus
características componentes de masa de acuerdo con su relación masa-carga. Sistema detector
para detectar los iones y registrar la abundancia relativa de cada una de las especies iónicas
resueltas. O. David Sparkman, Mass Spectrometry: Overview and History, Mass Spectrometry, First published:15 September 2006 https://doi.org/10.1002/9780470027318.a6001
TABLA 1. Variantes de componentes del sistema de espectrometría de masas

FIG 1. Componentes de un espectrofotometro de masas

Además, es necesario un sistema de introducción de muestras para admitir las muestras a estudiar
en la fuente de iones mientras se mantienen los altos requisitos de vacío (~10-6 a 10-8 mm de
mercurio) de la técnica; y se requiere una computadora para controlar el instrumento, adquirir y
manipular datos, y comparar espectros con bibliotecas de referencia. https://www.intechopen.com/books/spectroscopic-analyses-

developments-and-applications/application-of-mass-spectroscopy-in-pharmaceutical-and-biomedical-analysis

A partir de la composicion anterior los equipos de masas pueden realizar los siguientes porcesos:
 Producir iones a partir de la muestra en la fuente de ionización.
 Separar estos iones de acuerdo con su relación de masa a carga en el analizador de masas.
 Finalmente, fragmentar los iones seleccionados y analizar los fragmentos en un segundo
analizador.
 Detectar los iones que salen del analizador y medir su abundancia con el detector el cual
convierte los iones en señales eléctricas.
Finalmete y como se ha venido describiendo en diversos equipos, el procesamiento de las señales
se realiza por medio de un procesador. Estos daros se analizan en una computadora la cual debe
ser capaz de realizar calclulos que permitan la conversion de esas señales, realice las integraciones
correspondientes y arroje el espectro de masas correspondiente a la muesta analizada.
El aumento de la sensibilidad y la resolución del instrumento ha abierto nuevas dimensiones en el
análisis de productos farmacéuticos y metabolitos complejos de sistemas biológicos. En
comparación con otras técnicas, la espectroscopía de masas es solo la técnica para la
determinación del peso molecular, a través de la cual podemos predecir la fórmula molecular. Se
basa en la conversión de la muestra en estado ionizado, con o sin fragmentación, que luego se
identifican por sus relaciones de masa a carga (m/e). La espectroscopía de masas proporciona una
rica información elemental, representa una tecnica de identificacion y caracterizacion importante util
para interpretar componentes de mezclas complejas. La espectroscopia de masas también ayuda en
el análisis elemental cuantitativo, es decir, la intensidad de una señal de espectros de masas es
directamente proporcional al porcentaje del elemento correspondiente. También es una herramienta
no invasiva que permite estudios in vivo en humanos. Investigaciones recientes han examinado las
posibles aplicaciones de los espectrómetros de masas en el campo biomédico. También se usa
como detector sensible para técnicas cromatográficas como LC – MS, GC – MS y LC/MS/MS.
Todas las técnicas de espectrometría de masas tienen componentes similar, pero estos
componentes a veces difieren en su naturaleza de una espectrometría de masas a otra dependiendo
del tipo de espectrometría de masas que se aplica.
Esta técnica se utiliza en campos industriales y académicos para ambos de rutina y con fines de
investigación. La siguiente lista engloba las principales aplicaciones de espectrometría de masas:
• Farmacéutica: descubrimiento de fármacos, química combinatoria, farmacocinética, metabolismo
de fármacos,
• Clínica: detección neonatal, análisis de hemoglobina, pruebas de drogas,
• Ambiental: HAP, PCB, calidad del agua, contaminación de alimentos,
• Geológico: composición del aceite,
• Biotecnología: el análisis de proteínas, péptidos.
Mass Spectrometry (Importance and Uses) Bassam Abdul Rasool Hassan* Clinical Pharmacy Discipline, School of Pharmaceutical Sciences, University of Sains Malaysia, 11800, Minden,

Penang, Malaysia

La preparación de muestras es una parte integral, que marca a veces el éxito en la realización de
una determinación basado en espectrometría de masas (MS). Las buenas técnicas de preparación
de muestras requieren una comprensión profunda de las muestras sobre todo aquellas de naturaleza
biológica y del proceso de cromatografía sea gases o liquida en fase reversa y normal. Estos
parámetros son determinantes en el desarrollo del método analítico y están basados en las
propiedades fisicoquímicas que tienen los compuestos. Dependiendo del experimento, las muestras
a menudo contienen componentes (tampones y/o sales, detergentes, polietilenglicoles, lípidos,
cromatinas, anticuerpos y estreptavidina) que no son necesariamente compatibles con el análisis
especialmente LC-MS. Por lo tanto, la preparación exitosa de la muestra comienza con un diseño
experimental adecuado. Siempre que sea posible, los componentes incompatibles con MS de
ionización por electropulverización deben reemplazarse sistemáticamente con componentes
compatibles, como sales volátiles y detergentes amigables con MS. Adicionalmente, Se debe
recomendar la eliminación de componentes incompatibles cuando no se pueden evitar (por ejemplo,
una proteína de membrana insoluble requiere detergente para la solubilización o se necesita resina
de estreptavidina para enriquecer las proteínas y péptidos marcados con
biotina). http://www.spectroscopyonline.com/sample-preparation-guide-mass-spectrometry-based-proteomics, Thingholm TE, Jensen ON, Larsen MR. Enrichment and separation of mono- and
multiply phosphorylated peptides using sequential elution from IMAC prior to mass spectrometric analysis. Methods Mol Biol 2009;527:67–78

En el caso de las muestras sometidas a espectrometría de masas, la representatividad de la

muestra es sin duda un aspecto fundamental para la correcta interpretación de los resultados, la
cantidad de muestra necesaria para el análisis depende de las características de la muestra y del
tipo de análisis a realizar. La siguiente tabla refleja la cantidad de muestra que es recomendable
enviar, de forma que facilite la manipulación de la muestra y la realización de ensayos adicionales
que pudieran ser necesarios. Cantidades superiores son aceptables.

TABLA 2. Cantidad de muestra recomendada para análisis MS

-Métodos de Ionización

Mencionar todos, pero resaltar EI, APCI y ESI.

--EI

--APCI

--ESI

-Analizadores

-Detectores de iones

Adquisición y procesamiento de datos

Aplicaciones de los espectrómetros de masas

Análisis de muestras de interés farmacéutico utilizando el espectrómetro de masas

Desarrollo de métodos analíticos HPLC y CG acoplados a masas en la identificación y cuantificación de

compuestos de interés farmacéutica.