Función enzimática de la hemoglobina como reductase del nitrito que

produce NO bajo control allosteric

La vasodilatación Hypoxic es un fundamental, la respuesta fisiológica altamente conservada que requiere el

oxígeno y/o la detección del pH juntados a la vasodilatación. Mientras que este proceso primero fue
caracterizado hace más de 80 años, la identidad y el mecanismo exactos del sensor del oxígeno y de los
mediadores de la vasodilatación siguen siendo inciertos. En apoyo de un papel posible de la hemoglobina
(Hb) como sensor y effector de la vasodilatación hypoxic, aquí no demostramos a evidencia bioquímica que
Hb exhibe comportamiento enzimático como reductase del nitrito, con máximo NINGUNA generación
clasificamos ocurrir cerca de oxy--deoxy (R-a-T) a la transición estructural allosteric de la proteína. El índice
observado de la reducción del nitrito de Hb se desvía de la cinética second-order, y el progreso sigmoideo de
la reacción es determinado por un equilibrio entre 2 químicas de oposición del heme en las estructuras
cuaternarios allosteric de R (conformación oxigenada) y de T (deoxygenated la conformación) del tetramer
de Hb - el mayor potencial reductor del deoxyheme en el tetramer del estado de R y el número de unligated
los sitios del deoxyheme necesarios para el atascamiento del nitrito, que son más abundantes en el tetramer
del estado de T. Éstos las químicas de oposición dan lugar a una tarifa máxima cuando Hb es 40-60%
saturado con oxígeno (cerca del Hb P50), un punto de ajuste ideal evidente de la reducción del nitrito para
hypoxiaresponsive NINGUNA generación. Estos datos sugieren que el sensor del oxígeno para la
vasodilatación hypoxic sea determinado por la saturación del oxígeno de Hb y la estructura cuaternario y que
la actividad del reductase del nitrito de Hb no genera NINGÚN gas bajo control allosteric y del pH.

Introducción del oxígeno de Hb y los cambios allosteric

La vasodilatación Hypoxic es una respuesta
fisiológica fundamental que asegura entrega del
oxígeno y capacidad tapón adecuadas de la sangre
(eliminación incluyendo del CO2) a los tejidos
finos bajo tensión metabólica. Esta respuesta
fisiológica altamente conservada requiere el
oxígeno y la detección del pH juntados con la
vasodilatación. Mientras que este proceso primero
fue caracterizado hace más de 80 años (1, 2), la
identidad exacta y el mecanismo del sensor del
oxígeno y de los mediadores de la vasodilatación
sigue siendo desconocido (3, 4). De un punto de
vista de oxígeno-detección, una situación en la
cual la demanda metabólica de un tejido fino se
excede entrega del oxígeno causa una divergencia
de la relación normal entre la consumición del
oxígeno del tejido fino y la entrega vascular del
oxígeno. Esto crea una “señal del error” que es
caracterizado por una cuesta cada vez más
negativa cuando PaO2 venoso se traza contra la
consumición del oxígeno (4). Mientras que la
sabiduría convencional sugiere que esta señal del
error esté detectada como cambio en tejido fino o
la presión parcial de la sangre del oxígeno (PO2)
(es decir, el sensor del oxígeno detecta PO2), los
estudios recientes han sugerido que la saturación
altamente desarrollados del conformational de Hb
pueden favorecer esta función del oxígeno-sensor
(5-13). Tales cambios allosteric han sido asociados
al lanzamiento de ATP de la célula de sangre roja
(5-8), a la formación de S-nitrosothiols de S-
nitrosated Hb (9, 10), y, recientemente, a la
reducción del nitrito de la sangre a NO por Hb
(11-14). Los estudios tempranos por Furchgott,
Ignarro, y Murad demostraron la capacidad del
nitrito de activar el cyclase soluble del guanylate
(sGC) y de vasodilatar los anillos aórticos (15-17).
Sin embargo, las concentraciones M a la gama del
milímetro)requeridas para este efecto in vitro (en
el hundred- imposibilitaron en gran parte la
consideración de un papel del nitrito in vivo las
concentraciones queen seres humanos donde
están típicamente menos de 1 circulan M. Hemos
divulgado el existente de los gradientes arterial-a-
venosos del nitrito del plasma que aumentan con la
tensión metabólica regional (18) y recientemente
descrito una actividad vasodilatadora del nitrito en
las concentraciones fisiológicas cercanas in vivo
(11). Esta actividad vasodilatadora fue asociada a
la conversión del nitrito a NO por el deoxyHb,
sugiriendo que Hb posee una actividad fisiológica
del reductase del nitrito que pudo participar en la
vasodilatación hypoxic. De hecho, los arroyos en
1937 y Doyle y los colegas en 1981 caracterizaron Reacción 1
la reducción del nitrito a NO por el deoxyHb (19,
20).

Las abreviaturas anormales utilizaron: E1/2, La importancia fisiológica potencial de esta

potencial de la reducción (o redox); EPR, reacción nos pulsamos. Los requisitos para el
resonancia paramagnética del electrón; Hb, deoxyHb y los protones en la reacción sugirieron
hemoglobina; HbA, hemoglobina A; IHP, un mecanismo potencial para el oxígeno y la
hexaphosphate del inositol; Mb, myoglobin; NEM, detección del pH.
N-ethylmaleimide; PO2, presión parcial del
oxígeno. Conflicto del interés: Los autores han
declarado que existe ningún conflicto del interés.
Citación para este artículo: J. Clin. Invertir.
115:2099 - 2107 (2005). doi: 10.1172/JCI24650.

Cuadro 1
La reacción del nitrito con el deoxyHb revela la desviación de la cinética de primer orden y de producciones
equimolar del producto de metHb e hierro-nitrosyl-Hb. (a) Progreso de la reacción del nitrito-Hb bajo
condiciones M)de exceso del nitrito (10 milímetros de nitrito con el heme de 50 supervisadas
spectrophotometrically por la formación de hemes férricos en 630 nanómetro (línea de fondo en 700
nanómetro) bajo condiciones anaerobias o M da A630 dedurante la oxigenación parcial (oxyHb del 18%).
el metHb de 50 0.12 con el presente del nitrito de 10 milímetros. (b) El ajuste del registro natural de la
concentración del deoxyheme contra la hora para las condiciones demostradas en A, en donde está el
registro Ln [deoxyheme] natural de la concentración del deoxyheme cada vez señala. La concentración del
deoxyheme en cada vez que el punto fue determinado por el deconvolution espectral. (c) Efectos del escape
del oxígeno en producciones del producto en la reacción del nitrito-Hb (calculada por el deconvolution
espectral para las reacciones en A). (d) Índice instantáneo en un cierto plazo la consumición del deoxyheme
durante el curso de una sola reacción bajo condiciones en el A. El índice instantáneo de la consumición del
deoxyheme fue encontrado por el cambio negativo de la concentración del deoxyheme entre 2 puntos
adyacentes del tiempo (- d [deoxyheme]) sobre el intervalo del tiempo (despegue) donde está cambio d y t es
tiempo. (e) Progreso de la reacción del nitrito (10 milímetros) con variar las concentraciones iniciales del
deoxyheme supervisadas por la formación del metheme en 630 nanómetro. (f) Efecto de variar la
concentración inicial del deoxyheme (concentración del deoxyheme al principio de la reacción; La inicial
[de DeoxyHb]) en el índice inicial de la reacción calculaba de los datos en el E. La tarifa inicial de la
reacción es el índice de la formación férrica del heme al principio de la reacción calculada como el
excedente medio de la tarifa los primeros 200 segundos usando el coeficiente de la extinción de 3.4 en 630
nanómetro (el índice de la consumición del deoxyheme está aproximadamente dos veces tan rápidamente).

Además, la 1 reducción del electrón del nitrito por el deoxyheme ferroso sugiere que las características redox
del heme puedan modular este proceso. En apoyo de estas ideas, los datos de experimentos aórticos ines vitro
cinéticos de la prueba biológica del anillo han demostrado un umbral evidente de la vasodilatación por el que
la vasodilatación nitrito-Hb-dependiente se inicie en un PO2 que aproxima el Hb P50 (11). El P50 representa
el PO2 en el cual Hb es el 50% saturado con oxígeno. Importantemente, según lo demostrado en este estudio,
el índice de la reducción del nitrito a NINGÚN gas por Hb es máximo cuando Hb es el 50% saturado con
oxígeno. Una actividad máxima del reductase del nitrito que ocurre en el Hb P50 sería ideal para la
vasodilatación hypoxic, como el Hb P50 termal, químicamente, y allosterically es modulado por el
metabolismo circundante del tejido fino (21), y los estudios fisiológicos clásicos de la vasodilatación hypoxic
revelan un umbral hypoxic evidente de la vasodilatación en la saturación del Hb-oxígeno 40-60% (4, 22).

Resultados
La reacción del reductase del nitrito nueva. La reacción del nitrito y del deoxyHb se ha descrito previamente
como reacción de primer orden con respecto a deoxyHb bajo condiciones de exceso del nitrito, generando
producciones desequilibradas del producto de metHb y el 28% del 72% hierro-nitrosyl-Hb (19). Sin
embargo, basado en la reacción 1, equivalente (50: las producciones del producto del 50%) esperarían, con 1
topo de nitrito generando 1 topo de metheme y 1 topo de hierro-nitrosyl-heme. Hemos examinado esta
reacción bajo condiciones anaerobias terminantes en presencia de exceso del M y 10 milímetros de nitrito) y
la hemos observado unanitrito (heme de 50 divergencia inesperada de la cinética de primer orden y de
producciones equimolar del producto de metheme e hierro-nitrosyl-heme (el cuadro 1, CA). Sin embargo,
con la introducción del oxígeno del rastro (oxyheme del 18% presente al principio de la reacción), el índice
de los aumentos de la reacción y (aunque nunca exactamente) aproxima más de cerca el comportamiento de
primer orden observado en estudios anteriores (cuadro 1, A y B). La reacción del nitrito con Hb parcialmente
oxigenado también produce el metheme y las producciones hierro-nitrosyl-heme del producto constantes con
los niveles observados en estudios anteriores (figura 1C) (23).

Se esperaba que un escape del oxígeno aumentara la producción de metheme debido a la reacción simultánea
del nitrito con el oxyheme tan bien como la reacción de NINGÚN (formado de la reacción del nitrito con el
deoxyheme) con el oxyheme. Sin embargo, la desviación de la cinética de primer orden en ausencia del
oxígeno y el efecto del oxígeno en el aumento de la tarifa de la reacción eran inesperados (cuadro 1, B y D).
En la inspección inicial, bajo condiciones en las cuales la concentración del nitrito excedió el deoxyheme, la
reacción del nitrito con el deoxyheme (figura 1A) aparecía exhibir cinética de la cero-orden con respecto a
deoxyheme, según lo evidenciado por una tarifa relativamente constante a través del proceso de la reacción
incluso con el deoxyheme en tetramer del estado de T disminuye como se consume el deoxyheme. Esto es
balanceada por la reacción de aceleración del nitrito con el deoxyheme del estado de R, pues la concentración
de esta conformación allosteric aumenta con la formación del metheme e hierro-nitrosyl-heme, que ambos
estabilizan el tetramer del estado de R (figura 2A).
 Esto hace a T--r a la transición allosteric del estado ocurrir mientras que el metheme y los niveles hierro-
nitrosyl-heme aumentan del tetramer de Hb. Medimos la constante bimolecular de la tarifa de la reacción del
nitrito con el deoxyHb y el myoglobin (Mb) encima medir el tiempo y encontró de que este parámetro seguía
siendo constante para Mb monomeric (figura 2B).

Cuadro 2
El comportamiento sigmoideo de la reacción de la reacción del nitrito-deoxyheme ocurre debido T--r a la
transición cuaternario allosteric de Hb. (a) Modelo de la reacción del nitrito-deoxyHb que representa un
equilibrio entre 2 procesos de oposición: (a) una reacción que decelera con el deoxyheme del estado de T
debido al agotamiento del deoxyheme disponible para la reacción con el nitrito debido a la conversión al
metheme e hierro-nitrosyl-heme (línea azul sólida); y (b) una reacción de aceleración del nitrito con el
deoxyheme del estado de R (de línea discontinua). La línea negra sólida con la flecha representa el proceso
de la reacción observado experimental y es el equilibrio de estos 2 procesos. (b) Tarifa bimolecular evidente
constante sobre el curso del tiempo de la reacción anaerobia de Mb (heme de 50 µM) y de Hb (heme de 50
µM) con el nitrito (10 milímetros con Hb y 2.5 milímetros con el Mb en heme concentraciones). La constante
bimolecular de la tarifa (const.) fue obtenida dividiendo el índice instantáneo de la reacción de la
consumición del deoxyheme por la concentración del deoxyheme y nitrito. (c) Inicial (6 minutos), intermedio
(17 minutos), y (30 minutos) espectros finales del EPR de hierro-nitrosyl-heme supervisada sobre el curso de
la reacción del nitrito-deoxyHb (heme de 100 µM, 2.5 milímetros de nitrito) demostrando una transición a
partir del α de 5 coordenadas (estado de T) hierro-nitrosyl-heme (con partir hiperfino característico) a la
geometría del heme de 6 coordenadas (estado de R). Las señales más pequeñas del EPR en puntos anteriores
del tiempo fueron normalizadas a la del punto final del tiempo para comparar la forma espectral de la señal
hierro-nitrosyl-Hb. (d) T--r a la transición estructural allosteric durante el curso de la reacción del nitrito-
deoxyHb, supervisada por la formación del porcentaje del α coordinado 6 hierro-nitrosyl-heme concerniente
al α total hierro-nitrosyl-heme.
En cambio, la constante bimolecular de la tarifa aumentó exponencial (R2 = 0.998 para el ajuste exponencial)
sobre el curso de la reacción del deoxyHb tetrameric con el nitrito, apoyando el modelo de el cual la
actividad del reductase del nitrito del deoxyHb tetrameric aumenta durante el curso del tiempo de reacción
(figura 2B). Confirmamos la presencia de a T--r a la transición allosteric durante el curso de la reacción
supervisando la estabilización del enlace entre el de Hb porhistidine próximo y el Ningún-liganded heme
en la cadena del espectroscopia paramagnética de la resonancia del electrón (EPR). Según las indicaciones
de El cuadro 2, C y D (experimento realizado usando el deoxyheme de  M y 2.5 milímetros de nitrito),
como procedió la reacción, el 100 hierro-nitrosyl-heme transitioned a partir del 5 (estado de T) (estado de
R) a del estado de Tla estructura coordinada 6. Esto ocurrió porque el hierro-nitrosyl-heme existe en
equilibrio entre el coordenada 5 un coordenada (histidine--heme al enlace interrumpido) y 6 (histidine )
especie intacta en del estado de R hierro-nitrosyl conserva la geometríaenlace, mientras que el coordinada
del heme 6 del 100% (24). La producción del porcentaje de cada especie del hierro-nitrosylheme durante el
curso del tiempo de reacción era similar a ésa observada por Hille y otros. cuando no se tituló NINGÚN
almacenador intermediario en la solución del deoxyHb (25). También, el cambio espectral hierro-nitrosyl-
heme observado durante el proceso de la reacción, como si la concentración del deoxyheme disminuía
continuamente (la reacción 1 y el cuadro 1, A y E). Sin embargo, cuando aumentamos la concentración
inicial del M) observamos un aumento linear en M a 190 el deoxyHb (en la gama 26.9 del la tarifa
inicial de la reacción (cuadro 1, E y F), una característica constante con cinética de primer orden con respecto
a deoxyheme. Una examinación más cuidadosa del cuadro 1, A y D, sugiere un perfil sigmoideo de la
reacción caracterizado por un aumento y entonces una disminución de la tarifa, con la tarifa máxima
ocurriendo cuando el aproximadamente 50% del deoxyheme se convierte al metheme e hierro-nitrosyl-heme.
Así, a pesar de la concentración que disminuye del deoxyheme disponible a reaccionar con el nitrito durante
el curso de la reacción, la tarifa de la reacción puede aumentar hasta que alcanza su máximo.

Índice creciente de la reducción del nitrito por el estado Hb de R. Presumimos que el perfil sigmoideo de la
reacción observado es la suma de 2 reacciones de oposición del nitrito con el deoxyheme en los 2
conformations allosteric de Hb. Pues progresa la reacción, el índice de la reacción del nitrito demostrado en
la figura 2C, era similar al cambio espectral observado durante la desoxidación y la reoxigenación de hierro-
nitrosyl-Hb substoichiometric (26). Esto confirma que como el deoxyheme se convierte al metheme e hierro-
nitrosyl-heme durante la reacción, T--r a la transición allosteric ocurre de hecho. Es probable que ocurra el
índice de aceleración de la reacción del nitrito con el estado Hb de R debido al potencial más bajo de la
reducción (por lo tanto, donante mejor del electrón) del deoxyheme dentro del estado de R contra los
tetramers del estado de T (14, 27). Los índices iniciales de la reacción del nitrito con Mb (monomer) del
estado de R, deoxyHb (NEM-modificado) N-ethylmaleimide-modificado (efecto que se estabiliza) del estado
de R, Hb nativo A (HbA), y Hb (IHP-tratado) hexaphosphate-tratado inositol (estado de T que se estabiliza)
fueron comparados a sus potenciales publicados de la reducción (E1/2s) según lo hecho un promedio para
que las M,subunidades obtengan los valores totales para el tetramer de Hb (heme de 50 2.5 milímetros de
nitrito) (tabla 1) (27, 28). Similar a las tarifas iniciales trazó en la figura 1F, el índice inicial de la reacción
indicada en la tabla 1 fue medido por el índice medio de la formación del metHb usando la parte inicial del
rastro de la reacción en 630 nanómetro. Un índice más alto de la reducción del nitrito correlacionó con un
carácter más alto de la afinidad del oxígeno o del estado de R y con un E1/2s más bajo para todas estas
condiciones (R2 = 1.000 para el ajuste exponencial). Estos datos son también constantes con la correlación
observada entre potenciales más altos de la reducción del heme y los índices del nitrosylation reductor
alcalino del metHb por NO, que forma Hb ferroso y el nitrito; esta reacción se puede considerar el revés de la
reacción del reductase del nitrito y es acelerada por un heme más alto E1/2 y pH alcalino (29). Estos datos
confirman que el deoxyheme en el estado Hb tetrameric de R es un nitrito más fácil reductase debido al heme
bajado E1/2.
 Tabla 1
El índice inicial de la formación férrica del heme en la reacción anaerobia
del heme de 50 µM con 2.5 milímetros de nitrito correlaciona con el E1/2
de las varias proteínas del heme.

Mutante Tarifa de la reacción (µM/s) E1/2 (m/v)

Mb del caballo 0.1884 25
HbA-NEM 0.0915 45
HbA 0.0161 85
HbA + IHP 0.0054 135

R2 = 1.000, cabiendo a la ecuación; y = 2.927 el × 10-5 + 0.4844e-x⁄26.62,

donde está la tarifa de la reacción y el x y es E1/2.

Está claro de estos datos que ocurre la desviación de la cinética de primer orden en la reacción del nitrito con
el deoxyHb porque de T--r a la transición allosteric. Esto también fue confirmada por la cinética de primer
orden de las moléculas que son de Hbincapaces de la transición allosteric, tal como Mb y cadenas del
(tetramer del estado de R solamente) y de Hb con IHP y el pH bajo (trabados en estado de T). Estos datos se
demuestran para el Mb en el cuadro 3, A y B, y para de HbA en el cuadro 3, E y F.

Para tetrameric Hb que reacciona anaerobio con el nitrito, la reacción es esencialmente una reacción
autocatalytic allosteric con un solo nitrito que reacciona con un heme del estado de T para generar un
metheme y un hierro-nitrosyl-heme, que en virtud de su R indican efectos que se estabilizan, allosterically
bajar el potencial redox de 2-6 otros hemes (dependientes en la formación hierro-nitrosyl inter o
intratetrameric). Esto produce autocatalysis mientras que los hemes del estado de R generan más hemes del
estado de R, E1/2 exponencial que disminuye y constantes bimoleculares de aumento de la tarifa durante el
curso de la reacción (figura 2B). Dos papeles recientes han explorado la reacción del nitrito con el deoxyHb,
viniendo a diversas conclusiones. Un estudio de Luchsinger y de los colegas divulgó que esta reacción rindió
cocientes del producto del metHb a hierro-nitrosyl-Hb de 1: 1 a 1: 6, constante con estudios anteriores de
Doyle, y de ése la reacción aparecían obedecer la cinética de primer orden (19, 30). Sin embargo, en el
estudio de Luchsinger, la preparación inicial del deoxyHb contuvo el metHb del aproximadamente 10%; esta
contaminación produce catálisis del estado de R de esta reacción. Un segundo estudio de Huang y otros.
demostró los efectos del metHb y de R de la estabilización del estado en el aumento de la tarifa de la reacción
y modeló matemáticamente la reacción del nitrito-deoxyHb, produciendo los resultados que son constantes
con nuestra reacción autocatalytic allosteric propuesta (14).
Cuadro 3
El índice de la reacción del reductase del nitrito y de NINGUNA formación del gas está bajo control
allosteric. (a)  M) y de Hb (heme de 50 Progreso de la reacción anaerobia de Mb (heme de 50 M) con el
nitrito (10 milímetros con Hb y 2.5 milímetros con el Mb en concentraciones del heme) supervisado
spectrophotometrically por la formación del metHb en 630 nanómetro. (b) Primeros ajustes de la orden para
el Mb y el no-primer comportamiento de la orden de Hb tetrameric (ajustes del registro natural de la
concentración del deoxyheme para las mismas reacciones demostradas en A). (c) La medida simultánea de
NINGÚN gas por quimioluminescencia durante el curso de la reacción demostrada en la inserción del A.
demuestra el índice instantáneo de la consumición del deoxyheme sobre el curso de la reacción, obtenido del
deconvolution espectral. (d) La época de no enarbolar NINGUNA producción midió por la
quimioluminescencia para la reacción del nitrito (10 M) con la saturación que variaba (0-75%)
delmilímetros) con Hb (heme de 50 monóxido de carbono. %HbCO, porcentaje de Hb que se satura con
monóxido de de HbA (trabado encarbono. (e) Progreso de la reacción para las cadenas del M
reaccionó con 0.5 milímetros detetramer del estado de R; el heme de 35 nitrito en pH 7.0) e IHP-trató Hb
(trabado en tetramer del estado de T; el heme M reaccionó con 2.5 milímetros de nitrito en pH 6.4) fue
supervisado porde 50 el índice de la consumición del deoxyheme. (f) Ajustes de primer orden para las de
HbA en pH 7.0 y para Hb IHP-tratado en pH 6.4 para las cadenas del condiciones en la demostración de
E que la desviación a partir de la primera orden requiere una transición estructural allosteric del tetramer
de Hb (ajustes del registro natural de la concentración del deoxyheme para las mismas reacciones
demostradas en E).
Cuadro 4
Las tarifas máximas para la reducción del nitrito a NO ocurren alrededor del Hb P50. (a) La negativa del
cambio en la concentración del deoxyheme (obtenida por espectral en un cierto plazo del deconvolution)
durante la reacción del nitrito (10 milímetros) con (0-40%) Hb parcialmente oxigenado (heme total de 50
µM). (b) Índice instantáneo del deoxyheme consumición sobre el curso del experimento descrito en el
índice inicial del A. (c) (intercepción de la guarnición polinómica en B en los segundos 0) de la reacción
para condiciones descritas sobre trazado como función de la saturación inicial del oxígeno. (d) El
instantáneo índice de la consumición del deoxyheme contra la fracción hemes férricos ligados u oxidados
(concerniente a total heme: deoxy-, satisfecho, e hierro-nitrosyl-Hb) durante curso de la reacción
anaerobia del nitrito (10 milímetros) con el deoxyheme (µM 50).

Máximo NO generación cerca del Hb P50 provee de Hb las características del oxígeno-sensor y del
Ninguno-donante. Las consideraciones antedichas sugieren que el índice de la reacción del nitrito-deoxyHb
es máximo en la saturación del oxígeno 40-60% debido a el equilibrio entre la concentración del deoxyheme,
que se requiere para el atascamiento del nitrito, y la mayor capacidad reductora del deoxyheme del estado de
R, que se requiere para la reducción del nitrito. Para confirmar esto, no medimos NO formación del gas
durante el nitrito-Hb y la reacción nitrito-Mb y probamos después para ver si no hay generación bajo control
allosteric y protón-ligado. En estos experimentos, deoxygenated el Mb, Hb, y parcialmente el monóxido de
carbono u oxígeno-limitan las preparaciones de Hb fueron reaccionados con exceso de nitrito anaerobio,
mientras que ocurrió la constante que revolvía y que purgaba con helio (a excepción de reacciones parciales
del oxyHb). El gas purgado viajó en línea en un quimioluminescente NINGÚN analizador del gas para la
detección de NO. La reacción fue supervisada simultáneamente por spectrophotometry visible de la
absorbencia y el índice de la reacción medido como el índice de la consumición del deoxyheme.
El Mb (50 M) se traba en la conformación del estado de R y tiene un potencial bajo de la reducción del
heme. Según lo esperado, la reacción con exceso del nitrito (2.5 milímetros) exhibió una tarifa rápida con
decaimiento exponencial de primer orden mientras que los sitios del deoxyheme fueron consumidos en la
reacción (cuadro 3, A y B).
No midió simultáneamente NO cinética de primer orden similar seguida generación del gas con un índice
inicial rápido de NO formación que disminuyó exponencial (constante con un proceso de primer orden;
Figura 3C). En cambio, Hb tetrameric exhibió un perfil más sigmoideo de la reacción, así desviándose de
comportamiento de primer orden, y demostró un índice máximo de NO generación en el medio de la reacción
cuando el equilibrio entre el número de deoxyhemes y su potencial reductor era óptimo (el cuadro 3, CA).
Puesto que la ligadura del CO al heme produce la conformación del estado de R de Hb, equilibreamos el
deoxyHb con concentraciones que variaban del CO y reaccionamos esta mezcla parcial del carboxyHb (0, 50,
y el 75%) con el nitrito para evaluar el efecto del carácter del estado de R en el índice de NINGUNA
generación. Según las indicaciones de la figura 3D, la época de no enarbolar NINGUNA producción
disminuyó como saturación del carboxyHb creciente a partir de la 0 hasta el 75%, correspondiendo con el
aumento de cadenas de R de al principio de la reacción. R deHbA fue trabada en carácter del estado del la
conformación tetrameric del estado, y HbA IHP-tratado en el pH bajo fueron trabados en la conformación
tetrameric del estado de T. El índice de la consumición del deoxyheme para ambas especies de Hb, similar a
eso para el Mb (según las indicaciones de la figura inserción de 3C), rápido inicialmente y después fue
retrasado exponencial mientras que progresó su reacción con el nitrito (figura 3E). Junto con el ajuste de
primer orden linear del Mb, demostrado en cadenas y Hb IHP-tratado demostrar esa figura 3B, los ajustes de
para en ausencia de una transición estructural allostericprimer orden del del tetramer de Hb, la reacción
sigue la cinética de primer orden (figura 3F). También confirmamos las más cadenas de Hb comparadas con
el índice rápido de un más lento de la reacción para la tarifa del estado de R para el estado HbA de  T en
presencia de IHP en el pH bajo.

La tarifa máxima del reductase del nitrito se observa en la saturación del oxyHb 40-60%. Agregamos el
nitrito a Hb con una gama de las saturaciones iniciales del oxyHb y supervisamos después el índice inicial de
la reacción del reductase del nitrito deconvoluting los espectros del deoxyHb y observando el índice de la
desaparición del deoxyheme. Esto permitió la medida específica de la independiente de la reacción del
reductase del nitrito de reacciones adicionales entre el nitrito y el oxyheme. Estas reacciones fueron
realizadas en cubetas anaerobias con las adiciones del oxígeno para alcanzar las saturaciones medidas del
oxígeno demostradas en el cuadro 4. Constante con la modulación allosteric de la reacción del reductase del
nitrito, el índice inicial de la reacción aumentó como la concentración inicial del oxyHb aumentó y alcanzó
una tarifa máxima en la saturación de 40-60% Hboxygen (cuadro 4, CA). Reexaminamos la reacción
anaerobia del nitrito con el deoxyHb trazando la tarifa instantánea de la reacción en cada vez que punto
durante el curso de la reacción contra la fracción de los hemes totales ligados sin y oxidados al metHb. Esto
reveló un efecto similar: una tarifa máxima del reductase del nitrito en la ligadura de aproximadamente 40-
60% Hb (en este caso metheme y el actuar hierro-nitrosyl como modificantes del estado de R; Figura 4D).
Cuadro 5
Efecto del pH en la reacción del reductase del nitrito. (a) La tarifa inicial (encontrada por la guarnición
polinómica del índice de la consumición del deoxyheme sobre la fracción ligado) de la reacción del nitrito
(2.5 milímetros) con deoxyHb (heme de 45 µM) en diversos valores de pH adentro 0.01 Almacenador
intermediario de fosfato de M. La inserción demuestra la tarifa inicial trazada contra la concentración del
protón. (b) NINGÚN gas medido por la quimioluminescencia de las reacciones demostrado en A. (c) el
índice bimolecular del reacción del nitrito con el deoxyHb en almacenador intermediario de fosfato en pH
7.6, 7.0, y 6.5 y deoxymyoglobin adentro Almacenador intermediario de PBS en el ligand y la oxidación
excesivos del heme del pH 7.4 estados. (d) Factores 12.59 y 3.16 de la corrección (dado por 10pH - 6.5)
fueron multiplicados por las tarifas bimoleculares en pH 7.6 y 7.0, respectivamente (demostrado adentro C)
para eliminar la contribución del protón que cambia concentraciones a la tarifa bimolecular.

La química del sensor del pH es mediada por el protonation del nitrito y el efecto redox de Bohr. Porque la
reacción de la reducción del nitrito descrita en la reacción 1 requiere un protón, la concentración de aumento
de protones sería esperado acelerar esta reacción por el registro inverso - del ∆pH (es decir, como el pH
disminuye a partir el 7.6 a 6.5 la tarifa debe aumentar cerca 10 (∆pH) = 10 (6.5 - 7.6) = 101.1 o por el doblez
12.59). Sin embargo, si nuestro modelo allosteric de la reducción del nitrito está correcto, una oposición
adicional “(oxidación) efecto redox de Bohr” de disminuir el pH en la estabilización de T se esperaba que el
tetramer del estado aumentara el potencial redox del heme y retrasó la reacción. Análogo al efecto de Bohr
del oxígeno de Hb (31, 32), la relación en medio el potencial redox de ferrihemes y del pH es linear dentro
del physiologic gama del pH, tal que una 1 disminución de la unidad del pH está acompañada en 60
milivoltios aumentar de E1/2 (33-36). Para caracterizar éstos que compiten las químicas, establecen si la
actividad del reductase del nitrito de Hb tiene características del sensor del pH, y proporciona la
confirmación adicional de un modelo allosteric, evaluamos el efecto del pH encendido esta reacción que
usaba el almacenador intermediario de fosfato de 0.01 M ajustó a corresponder pH. Constante con el
aumento inverso del registro en tarifa (10-∆pH) debido a más protonation del nitrito, pH que disminuye
dentro la gama fisiológica (pH 6.4-7.8) aumentó dramáticamente índice inicial de la reacción (medida por el
deconvolution espectral, R2 = 0.98 para el ajuste linear de log10 [tarifa inicial] contra el pH) y de la tarifa de
NINGUNA generación del gas del nitrito (medido por la quimioluminescencia) (Cuadro 5, A y B). Es
importante reconocer que podría la tarifa inicial de la reacción no ser afectado por el efecto redox de Bohr
porque era todo el Hb deoxygenated ya completamente y en estado de T al principio del reacción. Esto es
evidenciada claramente por el aumento inverso exacto del registro en tarifa inicial de la reacción mientras
que el pH disminuyó (figura 5A) o, equivalente, el aumento linear en la tarifa inicial de la reacción como
concentración del protón aumentado (figura 5A, inserción). La tarifa inicial de la reacción aumentado como
la concentración del protón aumentó, y el linear el ajuste extendió a través del punto cero, demostrando ese
protonation se requiere para la reacción del nitrito y del deoxyHb (figura 5A, inserción). Sin embargo,
presumimos que como procedió la reacción, el efecto redox de Bohr retardaría la transición de T--r a cerca
estabilizar el estado de T. Por lo tanto comparamos el “instantáneo” índice bimolecular de la reacción en los
valores de pH de 7.6, 7.0, y 6.5 durante el curso de la reacción, sobre una gama del heme “saturaciones” (es
decir, datos demostrados como la fracción del total Ninguno-ligada o hemes férricos durante el proceso de la
reacción anaerobia de nitrito y Hb). En la figura 5C, indicamos el efecto grande previsto de disminuir el pH
en el aumento de la tarifa bimolecular inicial (calculada como reacción instantánea la tarifa se dividió por la
concentración del nitrito y del deoxyheme), pero del aumento en la tarifa bimolecular como el Hb se liga
completamente y experimenta T--r a la transición fue reducido. Esto es demostrada más claramente
normalizando el bimolecular tarifas durante el curso de la reacción por el registro inverso - del ∆pH a
corregir para el efecto directo de la concentración del protón. En Calcular 5D, nosotros demuestran
claramente que la tarifa bimolecular inicial es inafectada por el efecto redox de Bohr, como todo el Hb está
en el estado de T, pero como la reacción progresa, la subida de la tarifa bimolecular es limitada en el pH bajo
debido al efecto de Bohr redox en la estabilización de T tetramer del estado. En un sistema fisiológico, el
efecto de bajar el pH en el aumento el potencial redox del heme sería más que compensado por el aumento
inverso del registro en la tarifa de la reacción y pH-dependent exposición de más deoxyhemes para la
reducción del nitrito. Consideraciones cinéticas. El comportamiento químico de Hb como nitrito el reductase
presenta un mecanismo elegante para el oxígeno que detecta, como la actividad máxima del reductase del
nitrito allosterically se liga a Hb P50. Además, este mecanismo aparece tratar cinético preocupaciones por el
requisito para una generación rápida de una vasodilatación effector. Mientras que la constante bimolecular de
la tarifa del nitrito la reducción por el deoxyHb del estado de T es 0.12 M-1s-1 en 25°C y pH 7.4, aumentos
bimoleculares de esta constante de la tarifa exponencial durante T--r a la transición allosteric al doblez
aproximadamente 50 en el final de la reacción (figura 2B). Así el índice del tetramer de Hb del estado R4
acerca a el de Mb (6 M-1s-1; Figura 2B). El promedio bimolecular la tarifa constante durante el proceso de la
reacción era 0.35 M-1s-1, en la misma orden que nuestro valor previamente medido de 0.47 M-1s-1 (11) y
eso encontró por Doyle y otros. (1 M-1s-1) (19). Además, el requisito de un protón para la reacción sugiere
que la tarifa aumentar en el registro inverso - del ∆pH. Por ejemplo, en una cama vascular bajo tensión
metabólica fisiológica con la saturación del oxígeno de Hb de el 60% en pH 7.0 y 37°C, el índice
bimolecular de la reducción del nitrito a NINGÚN ser 4.4 M−1s−1. Nosotros y otros hemos divulgado
recientemente que las células de sangre rojas tienen nitrito intracelular de 300 nanómetros en estado
constante y que estos niveles son controlados a través de un estrecho fisiológico gama (37). De hecho, los
niveles de la sangre del nitrito aparecen ser conservados a través de especie con uptake y de la utilización por
el erythrocyte bajo control del oxígeno y pH-dependent (18, 38-40). Como deoxygenates de Hb en una cama
vascular metabólico activa y alcances un oxígeno saturación de el 60% en pH 7.0 y 37°C, el índice
bimolecular de la reducción del nitrito a NINGÚN estaría en 4.4 M-1s-1 y los 300 nanómetro el nitrito
reaccionaría con el deoxyheme intracelular de 12 milímetros a forma 10.6 nanómetro NO por el segundo, un
resultado cinético constante con nuestro observaciones fisiológicas anteriores (11). Mientras que hemos
demostrado eso las inyecciones del nitrito en las soluciones de la célula y de las soluciones rojas de Hb no
generan NINGÚN gas, los estudios adicionales se requieren para evaluar cómo NO puede escapar el
erythrocyte y evitar autocapture por intracelular Hb (discutido más completamente en la discusión).
Discusión Implicaciones fisiológicas para la vasodilatación hypoxic. La vasodilatación Hypoxic requiere la
detección del oxígeno y la elaboración rápida de un mediador de vasodilatación de quien module la
resistencia microvascular arteriolas. Constante con un punto de ajuste del oxígeno-sensor alrededor de Hb
P50, los estudios fisiológicos clásicos de la vasodilatación hypoxic revelan constantemente un umbral para
esta respuesta de alrededor 40-60% Hboxygen saturación (PO2 de 20-40 milímetros hectogramo) (4, 22). El
acumular datos obtenidos de medidas de longitudinal microvascular los gradientes de la saturación del
oxígeno y del Hb-oxígeno sugieren eso arteriolar la tensión del oxígeno disminuye mientras que la sangre
atraviesa A1 al calibre A4 arteriolas. Esta gota es substancial en músculo esquelético, resultando en el nivel
A4 PO2 arteriolar valora el acercar de 20 milímetros hectogramo y Hb saturaciones de menos el de 40%
(repasado recientemente en la referencia. 41). Éstos las disminuciones del oxígeno se han atribuido para
dirigir entrega del oxígeno de las arteriolas, la consumición del oxígeno por el endotelio y alisa músculo, e
intercambio del oxígeno de la contracorriente con el sistema venoso. El último se ha divulgado para entregar
el CO2 a las arteriolas, efectuar que baja la afinidad del Hb-oxígeno vía el efecto de Bohr. Estos perfiles de la
entrega del oxígeno indican que los desaturates de Hb debajo del 50% dentro de la microvascularización de
la resistencia del músculo esquelético, un proceso eso también maximizaría la actividad del reductase del
nitrito de Hb dentro Arteriolas A4. En el corazón y el cerebro, donde la mayor parte de está el oxígeno
entregado de la cama capilar, una propagación retrógrada del se ha invocado la señal vasodilatadora de
explicar la vasodilatación de la regeneración del tejido fino hypoxic a las arteriolas de la resistencia (42, 43).
Reconocemos que sea probable que vasodilatación hypoxic, como la regulación dependiente del endotelio
del flujo de la sangre, es overbuilt, con los mecanismos traslapados múltiples que aseguran adecuado entrega
del oxígeno a los tejidos finos de respiración. La reducción Hb-dependiente del Erythrocyte- y del nitrito al
lanzamiento NINGÚN (11) y del ATP (6-8) proporcionar la vasodilatación en las tensiones del oxígeno a
partir del 40 a 15 milímetros hectogramo. Mecanismos adicionales para el traslapo probable de la
vasodilatación hypoxic con los sistemas del erythrocyte, incluyendo la producción de la adenosina,
prostaglandinas, NO, y el hyperpolarizing endotelio-derivado factor del tejido fino, tan bien como la
vasodilatación comprensiva del feedforward (repasada recientemente en la referencia. 4). Debajo de 10
milímetros del hectogramo de tensión del oxígeno, reducción directa del nitrito a NO por el
disproportionation nonenzymatic (reducción ácida similar a eso divulgó en el estómago) (44-46) y la
reducción enzimática cerca el oxidoreductase de la xantina (47-49) puede contribuir a la vasodilatación
hypoxic y anaerobio NINGUNA formación. Además, la “explosión” No hay formación observada para Mb
(figura 4A) de interés particular y sugiere que las disminuciones de PO2 debajo de 2-4 milímetros
hectogramo, como ocurre durante ejercicio, en isquemia, y en tejido fino altamente metabólico, ser asociado
a una conversión rápida del nitrito del tejido fino (niveles que se acercan del µM 20; referencia. 37) a NO.
Esta actividad del reductase del nitrito del Mb (o cytoglobin y neuroglobin) pudo participar en modulación de
la respiración mitochondrial del tejido fino y limitación de lesión de la isquemia-reperfusión durante
extremos del ejercicio o del vasoocclusion patológico (50, 51). ¿NINGUNA exportación del erythrocyte? Un
desafío importante para un papel de las reacciones del nitrito-Hb en el control de la vasodilatación hypoxic
son cinética de NINGUNAS reacciones con el deoxy- y el oxyHb del vicinal, que no debe limitar NINGUNA
difusión fuera del erythrocyte. Sin embargo, nuestro estudios anteriores revelan que las concentraciones
fisiológicas del nitrito vasodilatan los anillos aórticos solamente en presencia de deoxyHb o deoxygenated
erythrocytes y que cerca de concentraciones fisiológicas del resultado del nitrito en la vasodilatación en el
antebrazo humano (11). De hecho, las predicciones cinéticas sugerirían que NINGÚN se escaparan en el
espacio principal para la detección en fase gaseosa en el estudio actual ilustrado en las figuras 3C y 5B.
Mientras que es la solución a esta paradoja no todavía claros, reconocemos que la biología puede superar
tales cinéticos apremios. Por ejemplo, un reductase membrana-asociado del nitrito metabolon con el
deoxyHb y el metHb, proteína del intercambio de aniones, la anhidrasa, el aquaporin, y los canales
carbónicos del macaco de la India podrían reunir el nitrito, el protón, el deoxyheme, y altamente hidrofóbico
canales en los cuales podría servir para concentrar el lipofílico NO el complejo de la membrana (52). De
hecho, el histidine distal del bolsillo del heme puede donar un protón a la reacción, un efecto análogo a la
donación del protón por el aspartate en la enzima bacteriana del reductase del nitrito (53). Esta donación del
protón del histidine al nitrito serviría a la posición y estabilizar el nitrito en el bolsillo del heme y acelerar la
reacción formando el ácido nitroso. Debido a la potencia de NINGÚN (concentración del effectivev del 50%
[EC50] de solamente 1-5 nanómetro) y porque el flujo es proporcional a el radio a la cuarta energía, muy
poco NINGÚN escape se requiere para vasodilatación. Estamos explorando actualmente otros intermedios
potenciales incluyendo los cuales pueda formar en la reacción del deoxyHb del nitrito H2NO2 (NINGÚN
hidratado), HNO2 -, NO2 2− (descrito por Doyle; referencia. 19), NO, ONOO-, y N2O3. Formación N2O3
por el nitrosylation reductor catalizado por el nitrito ha sido caracterizado recientemente por Fernandez y
Ford (29). Estabilizarían muchos de estos intermedios en los canales hidrofóbicos (H2NO2, N2O3, y
NINGÚN) mientras que otros serían estabilizados en canales del anión, tales como el anión proteína del
intercambio (HNO2 -, ONOO-, y NO2 2−). Una tarifa máxima de NINGUNA formación cerca del Hb P50
puede también conducir a las reacciones con superoxide (O2 -), sabido a la forma de la autooxidación de Hb
en P50 (54). Difusión NO-O2 limitado - las reacciones pueden generar ONOO- y N2O3, que tienen el
potencial al nitrosate de poco peso molecular thiols en el bolsillo del heme (55). En la conclusión, estos datos
revelan 2 características de la novela de la molécula de Hb: primero, la actividad del reductase del nitrito de
Hb produce NO debajo control allosteric; y en segundo lugar, el índice de la reducción del nitrito a NINGÚN
es máximo en la saturación del Hb-oxígeno 40-60%. Estas 2 características proporcionar un mecanismo
bioquímico que podría ligar el oxígeno allosteric detección a la vasodilatación. Estos datos sugieren que
saturación del oxígeno de Hb y estructura cuaternario más bien que acto del tejido fino PO2 como oxígeno
los sensores para la vasodilatación hypoxic y ésa la vasodilatación effector son NO, generado por una
actividad del reductase del nitrito de Hb. Entender esta química debe permitir terapéutico no apuntó
NINGUNA entrega a los tejidos finos específicos bajo tensión hypoxic usando soluciones del nitrito.

Métodos
Preparaciones los reactivo y de Hb. Todos los reactivo fueron comprados de sigma Aldrich, excepto el
mutante Hb, que fue proporcionado por C. Ho. A menos que se indicare contrariamente, las soluciones de Hb
y las reacciones fueron realizadas usando salino phosphatebuffered, pH 7.4, en la temperatura ambiente.
Cadenas aisladas del β de HbA (tetramer) fueron preparados por C. Ho. El adulto humano normal Hb fue
preparado hypotonically lysing lavó los erythrocytes, desechando la membrana fracciones, y almacenar el
hemolysate en - 80°C según lo descrito previamente (56). El Hb fue dializado o pasado a través de una
columna de la exclusión del tamaño lavada con el almacenador intermediario que correspondía al
experimento particular. NEMmodified HbA fue preparado incubando los 200-µM HbA con 10-milímetro
NEM para 1 hora en almacenador intermediario de PBS en pH 7.4 en equilibrio con aire del sitio y
temperatura ambiente. Para IHP-limitar Hb, el pH de la solución de IHP era ajustado a 7.4 antes de la adición
al deoxyHb en un 5 a 1 cociente. El exceso NEM o IHP fue quitado por la columna de sephadex G25
(biociencias de Amersham). La saturación del oxígeno de la solución de Hb fue medida por la espectroscopia
de absorción visible (espectrofotómetro del UV-Vis HP8453; Hewlett-Packard). La concentración y el
porcentaje de cada especie del heme eran analizados cerca deconvoluting el espectro en componentes de
espectros de la base de Hb integrado por oxyHb, deoxyHb, hierro-nitrosyl-Hb, carboxyHb, metHb y metHb-
nitrito, usando un lo menos - método de los cuadrados similar a ése previamente descrito (55). CarboxyHb
fue incluido en el análisis solamente cuando el carboxyHb fue agregado a la mezcla de reacción. metHb y
metHb-nitrito tener absorción significativa en 630 nanómetro, y su suma fue divulgada como la cantidad total
de metHb o de hemes férricos. Medida simultánea de la reacción del nitrito con Hb por espectroscopia de
absorción visible y NINGUNA detección del gas por quimioluminescencia. En estos experimentos, los 50-
µM deoxygenated las preparaciones del Mb, de Hb, y de Hb ligadas parcialmente con el monóxido de
carbono fue reaccionado con exceso del nitrito (10 milímetros, 2.5 milímetros con Mb) anaerobio en un
frasco de 25 ml para NINGUNA medida. Durante esto el tiempo, el revolvimiento de la constante y el
espacio libre purgando con helio fueron realizados (nota que la solución no está purgada; solamente el gas
del espacio principal es arrastrado). El gas purgado viajó en línea a través del espacio principal del frasco que
contenía 5 ml de mezcla de reacción en un quimioluminescente NINGÚN analizador del gas (Sievers
NINGÚN analizador; Instrumentos analíticos de GE) para la detección de NO. La reacción fue supervisada
simultáneamente en una longitud del camino de 1 centímetro cubeta de cristal bajo presión positiva del helio
para la medida espectral por spectrophotometry visible de la absorbencia en la temperatura ambiente usando
un CABALLO DE FUERZA Espectrofotómetro del UV-Vis 8953 (Hewlett-Packard). Progreso de la
reacción fue supervisado por el cambio de la absorción en 630 nanómetro. Concentraciones adentro punto del
deoxyheme, del oxyheme, hierro-nitrosyl-heme, y del metheme en cualquier momento fueron derivados con
el deconvolution espectral. La reacción instantánea la tarifa fue medida como el índice instantáneo de la
consumición del deoxyheme (cambio negativo de la concentración del deoxyheme con respecto a intervalo
del tiempo). Índice bimolecular (o índice bimolecular constante en el caso del Mb) de la reacción entre el
deoxyheme y el nitrito fue obtenida por la tarifa instantánea de la reacción dividida por la concentración del
nitrito y del deoxyheme en eso inmediato. Observar que todos los experimentos del UV-vis fueron realizados
en cubetas anaerobias sin purgar. Aplicamos la presión positiva del helio sin un canal para el escape del gas,
como esto previene los escapes del oxígeno en el sistema. Solamente los experimentos de la formación del
gas de NO se realizan con la cabeza colección del gas del espacio (figuras 3C y 5B). Espectroscopia del EPR
con el deconvolution espectral. La espectroscopia del EPR fue conducida en las temperaturas de 132 K con
una temperatura de la variable de Bruker 4111 VT la unidad y el espectrómetro de ESR-ER-200 D fijaron
(Bruker BioSpin GmbH) en 9.43 Frecuencia microondas del gigahertz, energía de la microonda de 10 mW,
modulación del gauss 5 amplitud, una constante del tiempo del ms 100, y un rato de la colección de 100
segundos para cada exploración. El espectro del EPR para hierro-nitrosyl-Hb era deconvoluted para obtener
el porcentaje de cada especie de nitrosyl-heme (heme y hexacoordinate del penta- y del α del hexacoordinate
β-nitrosyl-heme) con espectros de la base según lo descrito previamente (26). Reconocimientos
Reconocemos el trabajo cuidadoso de Vidhya Annavajjhala, Catherine E. Cushenberry, y Peter Grant en
apoyo de este proyecto. Este trabajo fue apoyado por la división intramuros del NIH y apoyado parcialmente
por NIH concede HL58091 (a D. Kim-Shapiro) y GM55792 (a N. Hogg). El spectrometry del EPR fue
facilitado por una concesión del centro de la biotecnología de Carolina del Norte (2003- IDG-1013 a D. Kim-
Shapiro). Recibido para la publicación el 3 de febrero de 2005, y aceptado en revisado formar el 24 de mayo
de 2005. Tratar la correspondencia a: Marcar T. Gladwin, NIH, construyendo 10 Centro de investigación
clínico, sitio 5-5140, 10 impulsión de centro, Bethesda, Maryland 20892-1662, los E.E.U.U. Teléfono: (301)
435-2310; Fax: (301) 402-1213; E-mail: mgladwin@mail.nih.gov.