Determinación de células formadoras de anticuerpos

INTRODUCCIÓN

Las células formadoras de anticuerpos (CFA) pueden determinarse funcionalmente in

vitro mediante la propiedad que tienen los anticuerpos producidos de fijar complemento
después de haberse unido a su antígeno. El sistema se establece mezclando células linfoides
provenientes de un animal inmunizado con eritrocitos de carnero (GRC) con los glóbulos rojos
homólogos. Los anticuerpos específicos producidos se unen a los glóbulos rojos y éstos, en
presencia de complemento, se lisan dando lugar a la formación de pequeñas placas líticas en
cuyo centro se encuentra la célula linfoide productora de anticuerpos.
El método originalmente descrito por Jerne solamente es adecuado para cuantificar el
número de CFA productoras de anticuerpos de clase IgM (método directo), ya que la IgG es
menos eficiente en la activación del complemento. Por tal motivo, cuando se requiere
determinar CFA productoras de IgG se agrega a la placa un antisuero producido contra la
gamma globulina de la especie de donde provienen las células linfoides (método indirecto),
antes de la adición del complemento.
Si se desea determinar el número de CFA contra otros antígenos que no sean eritrocitos,
es necesario conjugar o sensibilizar a la membrana del GRC con el antígeno en cuestión. Esta
modificación permite una gran versatilidad del método en cuanto a los antígenos que pueden
probarse, puesto que se han descrito técnicas para unir prácticamente cualquier antígeno a los
GRC.
El método descrito por Jerne fue mejorado por Cunningham, logrando una mayor
sensibilidad en la determinación de las CFA. Para ello desarrolló un procedimiento que permite
la formación de una monocapa de linfocitos y eritrocitos en la que se visualizan las placas
líticas con un diámetro de 30-40 µm que, en el método de Jerne, pueden pasar desapercibidas.

OBJETIVO

El objetivo de la práctica es poner de manifiesto en un cultivo in vitro la existencia de

células que producen anticuerpos en un animal inmunizado.

MATERIAL Y MÉTODO

I. Método directo de Jerne

Material por grupo

Baño maría ajustado a 43oC.
Incubadora ajustada a 37oC.
Microscopio óptico.
1 termómetro.
Agitador Vortex.
Cámaras de Neubauer.

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 1 mechero Bunsen.
2 charolas de plástico.
0.5 m de tela de organza.

Material por equipo

3 cajas de Petri de 15 x 100 mm.
3 pipetas serológicas de 5.0 mL.
5 pipetas serológicas de 1.0 mL.
6 tubos de ensaye de 13 x 100 mm.
1 tubo de ensaye de 12 x 75 mm.
1 tijera de disección.
1 pinza de disección.
1 vaso de precipitados de 100 mL.
1 liga.
1 émbolo de plástico.
2 pipetas Pasteur con bulbo de hule.
3 Solución salina de Hanks.
Solución de cristal violeta al 0.1% en ácido cítrico 0.1 M.
Suero fresco de cobayo, como fuente de complemento.
Suspensión de eritrocitos de carnero lavados tres veces con solución salina de Hanks,
ajustados a una concentración del 20%.
Ratones jóvenes previamente inmunizados por vía intraperitoneal con 0.1 mL de una
suspensión de eritrocitos de carnero al 10%. La dosis de eritrocitos empleada
dependerá de la cepa de ratón utilizada, ya que la respuesta de cada cepa es variable.
Ratones jóvenes no inmunizados.
Agarosa al 1% en solución de Hanks.

Método
1. Colocar un pedazo de tela de organza sobre un vaso de precipitados u otro frasco que sirva
como recipiente y sujetarlo con una liga o cinta adhesiva.
2. Sacrificar los ratones, inmunizados tres o cuatro días antes, por dislocación cervical.
3. Extraer el bazo sin restos de grasa y sin pelos de ratón, cortar en tres partes, colocar los
fragmentos de bazo sobre la tela del recipiente.
4. Humedecer con un volumen conocido de solución de Hanks y macerar con delicadeza
usando un émbolo de jeringa. Adicionar más solución de Hanks hasta obtener un volumen
de 5.0 mL.
5. Homogeneizar la suspensión de células esplénicas aspirando y expulsando la suspensión
celular utilizando una pipeta Pasteur.
6. Transferir la suspensión celular a un tubo de ensaye y dejar reposar 5 min.

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 7. Si los ratones fueron inmunizados tres días antes, la suspensión celular se diluye 1:10 en
solución de Hanks; si la inmunización fue dos días antes, se diluye 1:5. Es importante
recordar que cada cepa de ratón responde de manera diferente al antígeno, por lo cual se
sugiere determinar la dilución adecuada para la cepa de ratones en estudio o trabajar con
cantidades conocidas de células linfoides por mL.
Introducir los tubos de ensaye (tres por equipo) en el baño maría a 43oC y adicionarles 2.0
mL de agarosa fundida, al 0.8 %.
8. Adicionar a cada tubo, sin retirarlo del baño, 0.15 mL de la suspensión de GRC e
inmediatamente 0.1 mL de la suspensión celular diluida y mezclar suavemente con ayuda de
un agitador Vortex durante tres segundos. Verter rápidamente el contenido del tubo dentro
de una caja de Petri previamente calentada a una temperatura tal que se soporte en el dorso
de la mano.
9. Distribuir homogéneamente la agarosa por toda la caja cuidando de que no se solidifique.
Este paso no debe durar más de cinco segundos.
10. Dejar reposar la caja en una superficie plana hasta que solidifique la agarosa. Sembrar tres
cajas por suspensión.
11. Incubar las cajas a 37oC durante 45 min.
12. Adicionar a cada caja 1.5 mL de suero fresco de cobayo diluido 1:10, mantenido
previamente en baño de hielo, y distribuirlo por toda la superficie de la placa.
13. Incubar las cajas a 37oC durante 30 min.
14. Observar y contar a contraluz las placas hemolíticas que aparezcan en cada
caja. 16. Durante el periodo de incubación, realizar la cuenta de células esplénicas en la
suspensión de trabajo, la cual debe mantenerse en baño de hielo. Diluir dicha suspensión
1:20 en cristal violeta (0.1 mL de la suspensión celular y 1.9 mL del colorante) y contar el
número de células presentes en esta preparación en una cámara de Neubauer. Tomar en
cuenta la dilución efectuada con el cristal violeta para los cálculos. El procedimiento a
seguir para contar en la cámara de Neubauer se indica en el apéndice III.

RESULTADOS

Obtener el promedio de placas hemolíticas y calcular el número de células formadoras de

anticuerpo (CFA) por cada millón de células esplénicas (CFA/106 células de bazo).

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II. Método de Cunningham

Material por grupo

Agitador Vortex.
Microscopio óptico.
Cámara de Neubauer.
2 charolas de plástico.
Platinas calientes.
Parafina fundida.
Hisopos
Cinta doble adhesiva de 2-5 mm de ancho.
0.5 m de tela de organza.
Alcohol etílico al 95%.

Material por equipo

6 portaobjetos.
3 pipetas serológicas de 5.0 mL.
5 pipetas serológicas de 1.0 mL.
3 tubos de ensaye de 13 x 100 mm.
1 tubo de ensaye de 12 x 75 mm.
1 tijera de disección.
1 pinza de disección.
1 vaso de precipitados de 100 mL.
1 liga.
1 émbolo de plástico
Tela de algodón
1 micropipeta de 200 µl.
Solución salina de Hanks.
Solución de cristal violeta al 0.1 % en ácido cítrico 0.1 M.
Suero fresco de cobayo, como fuente de complemento.
Suspensión de GRC, lavados tres veces, al 10%. La dosis de GRC que se use va a
depender de la cepa de ratón que se esté trabajando en ese momento, ya que la respuesta
de las cepas es variable.

Método

Preparación de microcámaras

1. Sumergir los portaobjetos en alcohol etílico al 95% y secarlos perfectamente con una tela de
algodón limpia y seca.
2. Alinear tres portaobjetos desengrasados y colocarles tres tiras de cinta de doble adhesivo, dos
en cada uno de los extremos y la otra en el centro del portaobjetos.

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 3. Colocar otro portaobjetos limpio sobre los que ya tienen el adhesivo para formar dos
microcámaras por cada par de portaobjetos. La capacidad de cada microcámara oscila entre
100 y 150 µl (dependiendo del grosor de la cinta con doble adhesivo).

Determinación de CFA
1. Realizar los puntos 1-6 del método de Jerne.
2. Tomar 0.1 mL de la suspensión celular, la cual debe mantenerse en baño de hielo, y
mezclarla con
3. 1.9 mL de la solución de cristal violeta (dil 1:20) para llenar con esta preparación una
cámara de Neubauer y contar las células esplénicas. El procedimiento a seguir para
contar en la cámara de Neubauer se indica en el apéndice III.
4. Diluir la suspensión celular con solución de Hanks a una concentración de 2.5 x106
células/ml.
5. Mezclar 2 mL de esta nueva suspensión de células con 0.25 mL de GRC al 10% y 0.15
mL de suero fresco de cobayo.
6. Llenar con esta última mezcla las microcámaras con la ayuda de una
7. micropipeta cuidando de que no queden burbujas. El volumen de cada microcámara debe
considerarse para los cálculos posteriores.
8. Cerrar los extremos de las microcámaras con parafina fundida.
9. Incubar a 37oC durante 1 h en posición horizontal.
10. Contar las placas hemolíticas que aparezcan en cada cámara.

RESULTADOS

Contar y determinar el promedio de placas hemolíticas de cada ensayo y calcular el número de

células formadoras de anticuerpo (CFA) por cada millón de células esplénicas (CFA/106 células
de bazo).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

JERNE, N. K. and NORDIN, A. A., 1963. “The agar plaque technique for recognizing antibody
producing cells”. En: Cell bound antibodies. Amos, B. y Koprowski, H. Editores. Editorial The
Wistar Institute Press.
JERNE, N. K. and NORDIN, A. A 1963. “Plaque formation in agar by single cells”. Science,
140:405.
CUNNINGHAM, A. J., 1965. “A method of increased sensitivity for detecting single antibody-
forming cells”. Nature, 207:1106.
CUNNINGHAM, A. J. and SZENBERG, A., 1968. “Further improvements in the plaque
techniques for detecting single antibody-forming cells”. Immunology, 14:599.
DRESSER, D.W. 1978. “Assays for immunoglobulin-secreting cells”. En: Handbook of
experimental immunology. vol II. 3ª. ed. Editorial Blackwell Scientific Publications.

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