2.

Material y métodos

2.1. Caracterización molecular

El ARN total se extrajo de tejidos foliares infectados por virus de C. annum (cv. Loungi) a
los 14días después de la inoculación (dpi) utilizando el método TRI-Reagent (Life
Technologies, Carlsbad,
CA, EE. UU., Cat No. 15596026) según las especificaciones del fabricante. instrucción.
Para la síntesis de ADNc, M-MLV (Moloney Murine Virus de la leucemia) Kit de síntesis de
ADNc (molécula de ADN de doble cadena, en la que una de sus hebras constituye una
secuencia totalmente complementaria al ARN mensajero a partir del cual se ha
sintetizado). de primera hebra (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) Se utilizó
siguiendo el protoco del fabricante

2.2. Clonación del gen CP

Productos de PCR purificados amplificados utilizando el degenerado par de cebadores:
Poty3 (5-TGAGGATCCTGGTG (C / T) AT (A / C) GA (A / G) AA (C / T) GG-3) y
CVMV1037 Pol
(5’-AGCATGGAGAGAGCGACATTAGTC-3) como cebadores aguas arriba (Hiskias, 1998)
y Oligo (dT)
(5´-GCGGGATCCT17-3´) como el cebador aguas abajo fueron ligado en el vector
pTZ57R / T (Thermo Scientific, EU. Kit de clonación por PCR InsTAclone, K1213). La
presencia de CP
Luego se confirmó el ADNc en el vector recombinante P01. a través del proceso de
secuenciación y la comprobación de la ausencia de errores. Imprimaciones universales
M13 adelante
(5 ’TGTAAAACGACGGCCA GT 3’) y M13 inversa (5 ’CAGGAAACAGCTATGACC 3’) se
utilizaron para la secuenciación el gen CP insertado en el sitio de clonación múltiple
(MCS) de el gen pTZ57R / T. Se utilizó el programa ClustalW para comparar 22
secuencias de ChiVMV altamente emparejadas presentes en el base de datos utilizando
la aplicación BLAST. El filogenético El árbol fue creado por el método de máxima
verosimilitud de secuencias alineadas ClustalW usando la versión MEGA
6.0 programa (Tamura et al., 2013) y análisis Bootstrap se realizó en 1000 repeticiones.

Clonación del gen CP amplificado con cebadores específicos

Tres pares de cebadores específicos del gen de la proteína de la cubierta basado en la
secuencia obtenida de ChiVMV (KJ472764) fueron diseñados (Tabla 1) comparando con
conocidos datos de secuencias de genes disponibles en la base de datos NCBI para la
amplificación del gen CP con sitios de restricción para posterior clonación en un vector
binario. El BglII y BstEII Se colocaron sitios de restricción en ambos extremos del gen CP
imprimación respectivamente.
Fragmento amplificado por PCR del gen CP con restricción los sitios se ligaron
directamente en el vector pGEM®-T Easy (Figura 1) usando el sistema vectorial pGEM®-
T Easy I. Finalmente, el
El gen CP se clonó en el vector de expresión de la planta, pCAMBIA1301, en los sitios
BglII y BsteII.
2.4 Ensayo transitorio mediado por Agrobacterium
La cepa de Agrobacterium LBA4404 se utilizó para transitorios estudios de ensayo. vector
pCAMBIA1301 que alberga el El gen ChiVMV CP (p1301: CP) se movilizó en LBA4404
mediante protocolo de congelación y descongelación. Para la agroinfiltración, se preparó
cultivo a partir de
células bacterianas mediante la transferencia de la única colonia en 50 ml de medio LB
líquido que contiene kanamicina antibiótico (50 µg / ml). Las bacterias transformadas
fueron incubados durante la noche con agitación a 28 ° C a 250 rpm. Del cultivo de la
noche a la mañana, se pusieron 250 μl en 10 ml de Medio LB que contiene tampón MES
10 mM (pH 5,7),
kanamicina (50 μg / mL) y acetosiringona 150 μM y se cultivó a 28 ° C hasta una DO 600
1. El cultivo se centrifugó a 4000 rpm durante 15 min y luego se tomó el sedimento y se
suspendido en MgCl2 10 mM, MES 10 mM (pH 5,7) y Acetosiringona 100 µM. La
suspensión se dejó a 25 ° C. durante 3-4 h. Dos hojas de cada planta de N. benthamiana
(Plantas de 4 a 5 semanas de edad). Las hojas eran ligeramente perforado desde el lado
inferior con una aguja y
la suspensión bacteriana se infiltró bajo presión en la puñalada de la hoja con una jeringa
estéril sin aguja de 2 ml.

Tabla 1. Lista de pares de cebadores utilizados para la amplificación del gen CP del clon
p01.

Los sitios de restricción dentro de la secuencia del cebador están subrayados.

Palabras: higromicina(hygromycin) promoter (promotora) border right (borde derecho)
Figura 1. Representación esquemática del plásmido p03 (T-DNA de p1301-CP de
ChiVMV ATIPK)

2.5. Desarrollo de plantas transgénicas de N. benthamiana

Se desarrollaron plantas transgénicas de N. benthamiana utilizando el método del disco
de la hoja a través del protocolo de transformación mediado por agrobacterias.
Brevemente, hoja discos (8 cm) se prepararon a partir de hojas más jóvenes de Plantas
de N. benthamiana. los discos de hojas se sumergieron en LBA4404 cultivo (OD600 = 0,4)
que alberga p1301CP durante 30 minutos
y luego se pusieron en medios de cocultivo para EM durante 2-3 días a 230 ° C en
oscuridad. Después de 3 días, los discos de hojas se lavado con cefotaxima (250-500
mg / L) y colocado
en los medios de selección de MS. Después de 3-4 semanas, el emergente los brotes del
callo se cambiaron al medio de enraizamiento suplementado con antibiótico; a partir de
entonces, el endurecimiento fue hecho después de 3-4 semanas. Se recolectaron semillas
de plantas T0
para las generaciones futuras.

2.6. Confirmación de las plantas transgénicas

De las plantas transformadas, ADN y ARN genómico se aislaron en la etapa de 3-4 hojas
y se sometieron a PCR y amplificación por RT-PCR, respectivamente. ADN y ARN
se extrajeron de las hojas de plantas transgénicas, agroinfiltrados (tres plantas) así como
de la
plantas de N. benthamiana sin transformar. Aproximadamente El fragmento del gen CP de
1 kb se amplificó a partir de 9 Plantas de N. benthamiana mediante PCR utilizando
cebadores específicos.
El gen hpt se determinó mediante amplificación por PCR con cebadores directos e
inversos específicos de hpt de transgénicos plantas. También se realizó RT-PCR
utilizando cebadores específicos para el gen CP. El producto de PCR se corrió en gel de
agarosa al 1%. para observar la intensidad de la banda

2.7. Ensayo de resistencia a virus

Para infectar las plantas transgénicas, la savia pura de ChiVMVATIPK (las plantas se
mantuvieron como fuente de infección en un invernadero) se hizo triturando las hojas de
un planta infectada sistémicamente en tampón fosfato 0,1 M solución. La savia se pasó a
través de una tela de muselina y se mezcló con polvo de carborundo (malla 600, 1 mg /
ml). Los la mezcla se inoculó mecánicamente a los subestudiados plantas de control
transgénicas y no transgénicas suavemente
frotando las hojas. Las plantas fueron analizadas para ChiVMV. título a través de DAS-
ELISA (Clark y Adams, 1977) después de 2 semanas de inoculación. Disponible
comercialmente Kit de detección ELISA (LOEWE biochemical, EE. UU., Cat. No. 07185S /
100) se utilizó para la detección de ChiVMV.

Figura 2. Síntomas de ChiVMV en hojas de chile recolectadas de Islamabad. (a) Muestra

moteado y severo aclaramiento y distorsión de las venas. (b) Muestra un tamaño de hoja
reducido con moteado y distorsión.

Tabla 2. Reacción de diferentes especies hospedadoras contra el aislado ATIPK de

ChiVMV después de la inoculación mecánica.
Figura 2. Síntomas de ChiVMV en hojas de chile recolectadas de Islamabad. (a) Muestra
moteado y severo aclaramiento y distorsión de las venas.
(b) Muestra un tamaño de hoja reducido con moteado y distorsión.
Figura 3. Desarrollo de síntomas en plantas hospedantes propagativas después de la
inoculación mecánica con ATIPK aislado de ChiVMV. (a) N. tabacum muestra mosaico,
moteado y aclaramiento de venas (b) C. annum (cv. Loungi) muestra los síntomas de
moteado, mosaico, deformación de las hojas y aclaramiento de venas.
Resultados
3.1. Aislamiento y confirmación de virus.
Las muestras de hojas de plantas de chile infectadas con síntomas característicos de
ChiVMV como mosaico, moteado, distorsión de las hojas, bandas de venas, aclaramiento
de venas y hojas de tamaño reducido (Figura 2), se sometieron a ELISA específico de
ChiVMV. Los resultados de DAS-ELISA confirmaron la presencia de ChiVMV en las
muestras de hojas recolectadas, mediante el uso de anticuerpos policlonales específicos
del virus y solo el 40% de las 35 muestras reaccionaron positivamente con anticuerpos
(Tabla 2).
El aislado de ChiVMV utilizado en este estudio se denominó ATIPK (aislado de chile).
ATIPK se purificó biológicamente a partir de plantas de Chenopodium quinoa después de
pasar por tres transferencias de lesiones en plantas separadas. El aislado ATIPK de
ChiVMV biológicamente purificado se propagó adicionalmente en plantas de tabaco (N.
tabacum) y chile (cv. Loungi) para la propagación del virus y como fuente continua de
virus para estudios moleculares. La savia infecciosa se transmitió mecánicamente a la
especie hospedadora propagativa. Las plantas de tabaco y chile investigadas mostraron
síntomas típicos de mosaico y moteado en las hojas después de 10-14 dpi (Figura 3a yb).
3.3. Análisis filogenético
Se recuperaron de la base de datos y alinearon un total de 22 secuencias de nucleótidos
mejor emparejadas de diferentes ubicaciones geográficas (Tabla 3). Secuencia de
nucleótidos
Figura 4. Amplificación por RT-PCR del gen CP con CVMV1037 / oligo (dT). Los carriles
1, 2, 3 y 4 contienen un producto amplificado de 1,2 kb del gen NIb y CP.

El análisis revelado acerca de la secuencia del aislado ATIPK (KJ472764) consta de 96

bases de la región NIb y 864 nucleótidos del gen CP, así como 23 bases de 3 'UTR. La
secuencia (KJ472764) se alineó con los datos disponibles eliminando las 96 bases de la
región NIb.

El análisis comparativo de la secuencia de nucleótidos de CP reveló que la identidad de

nucleótidos oscila entre el 88,4% y el 86,8%. La identidad de nucleótidos más alta fue del
88,4% con un aislado de Tailandia (DQ854956) y la identidad de nucleótidos más baja fue
del 86,8% con un aislado identificado en la India (DQ854964). Mientras que la identidad
de aminoácidos osciló entre 91,8% y 89,3%. El valor más alto de identidad de
aminoácidos (92,7%) se observó con 3 aislamientos de India (EF213679, EF213681 y
EF213703) y la identidad de aminoácidos más baja fue de 89,3% para un aislado de
Indonesia (AB703256).
La secuencia de nucleótidos CP de los aislados de ChiVMV ATIPK tenía sustituciones de
68 pb en diferentes posiciones del gen CP de los aislados del mundo. La región N-
terminal del gen CP mostró más diversidad en las sustituciones de bases de nucleótidos
en comparación con la región 3 '. Las sustituciones estuvieron presentes principalmente
en los primeros 200 nucleótidos del total de 864 bases del gen CP.
El análisis filogenético basado en secuencias de nucleótidos del gen CP de aislamientos
de ChiVMV ATIPK mostró que el aislado paquistaní estaba agrupado con un aislado
(HQ218936) de China (Figura 5).
El árbol de máxima verosimilitud basado en la secuencia de nucleótidos del gen CP se
dividió en dos clados divergentes (I y II). El clado II contenía dos aislamientos, uno de
Pakistán (KJ472764) y otro de China (HQ218936), mientras que el resto de los 22
aislamientos pertenecían a India, Taiwán, Tailandia e Indonesia pertenecían al clado II. El
árbol filogenético fue respaldado por un fuerte valor de arranque (1000). Se observó una
menor correspondencia entre ChiVMV-ATIPK y otros aislamientos asiáticos. El análisis
filogenético mostró que el aislado ChiVMV de Pakistán formó un clado distinto con el
aislado chino que refleja su estrecha relación geográfica con el aislado chino en
comparación con los aislados indios.

3.4. Ensayo transitorio mediado por Agrobacterium

El plásmido pCAMBIA1301: CP se utilizó para el ensayo transitorio de agroinfiltración en
plantas de N. benthamiana. El ADN genómico se aisló en el estadio de 3-4 hojas de las
hojas de 9 plantas transgénicas, se infiltró en agro (3 plantas) y se corrió en gel de
agarosa al 1% (Figura 6).

3.5. Confirmación de plantas transgénicas de N. benthamiana

El ADN y el ARN se extrajeron de las hojas de plantas transgénicas (9 plantas),
agroinfiltradas (3 plantas), así como de plantas de N. benthamiana de control (no
transformadas). Se obtuvo un fragmento de gen CP de aproximadamente 1 kpb de 9
plantas putativas de N. benthamiana. Se realizó PCR para confirmar la presencia del
transgén ChiVMV-CP; mientras que no se observó ninguna banda para las plantas de
control no transgénicas. La intensidad de la banda fue casi la misma para todas las
plantas probadas, lo que indicó que la integración fue la misma y exitosa. El análisis de la
integración genética en transgén a través de PCR es una práctica general que se ha
dio un nivel bajo de señal, valores de ELISA casi negativos. seguido por varios científicos
(Missiou et al., 2004; Bazzini et al., 2006). El gen hpt se determinó mediante amplificación
por PCR con cebadores directos e inversos específicos de hpt de plantas transgénicas.
Los fragmentos amplificados de 700 pb del gen hpt de p03 representan la presencia del
transgén en plantas transgénicas (Figura 7).
La RT-PCR dio los mismos resultados según la PCR, pero la intensidad de la banda fue
diferente para las supuestas plantas transgénicas (Figura 8a yb). Los diferentes niveles de
intensidad indicaron la cantidad de transcripción de ARNm en las células de cada planta
transgénica. La cantidad detectable de ARN estaba presente en las plantas probadas, lo
que sugiere que la resistencia se confiere a través del mecanismo de silenciamiento
génico postranscripcional (Ghosh et al., 2002). Las plantas transgénicas y control (no
transgénicas) inoculadas mecánicamente se evaluaron mediante la prueba DAS-ELISA
antes y después de la infección, con el fin de evaluar el nivel de títulos de virus en plantas
transgénicas y control. Antes de la infección, todas las líneas transgénicas Las lecturas de
ELISA confirmaron los síntomas fenotípicos y mostraron que la acumulación de virus
estaba en una cantidad detectable en hojas infectadas sistémicamente de estas plantas
transgénicas y de control a 15 dpi. Las plantas transgénicas de N. benthamiana habían
mostrado varios niveles de resistencia contra el aislado ATIPK de ChiVMV. Los valores de
ELISA de las plantas no transgénicas inoculadas indicaron que estas plantas poseían una
alta cantidad de título de ChiVMV en comparación con las plantas transformadas (Figura
9). Las líneas transgénicas T3, T4 y T7 no mostraron ningún síntoma durante todo el ciclo
de vida dieron como resultado valores de ELISA negativos o inferiores a la media (<0,25)
se consideraron líneas transgénicas "resistentes" en la base de los síntomas y las lecturas
de ELISA. Las líneas transgénicas T2, T6 y T8 tuvieron la capacidad de dar una
resistencia moderada al ataque viral y no se desarrollaron síntomas en las hojas durante
15 dpi, mientras que los síntomas aparecieron en 20 dpi y desaparecieron en las etapas
de desarrollo lateral y se pueden llamar síntomas retardados. . Estas tres líneas (T2, T6 y
T8) se denominaron líneas transgénicas de “resistencia moderada” en función de los
síntomas y las lecturas de ELISA (0,32-0,37) que eran menos de dos veces el valor medio
de ELISA (<0,25). Mientras que T1 y T5 mostraron los síntomas leves de mosaico y
moteado y mostraron valores altos de ELISA (0,59-0,60), es decir, tres veces o menos de
tres veces el valor medio de ELISA (<0,25), se denominaron "moderadamente
susceptibles". Por otro lado, las plantas de control mostraron una alta acumulación viral
como indicador de comportamiento altamente susceptible después de la inoculación con
savia infecciosa del aislado ATIPK de ChiVMV (Cuadro 4 y Figura 10).
Plantas de control negativo: N. benthamiana sin transformar
plantas desafiadas con agua destilada
El valor DAS ELISA para cada línea transgénica es el valor promedio de cinco
repeticiones 4.
Discusión
El presente estudio ha revelado la identificación molecular y la purificación biológica del
cultivo de chile que infecta ChiVMV en Pakistán. Este estudio destacó la posición
filogenética del aislado ATIPK de ChiVMV (KJ472764) entre los potyvirus encontrados en
otras partes del mundo. ChiVMV aislar ATIPK de Pakistán clade arriba por separado con
el aislado chino que mostró su posición filogenética distintiva. El uso del gen CP del
aislado ATIPK de ChiVMV paquistaní nos permitió producir plantas modelo transgénicas
que expresaban la resistencia contra virus poco estudiados. Los resultados de los
estudios de caracterización molecular y evaluación de la resistencia confirmaron que la
resistencia se ha generado a través del mecanismo de silenciamiento génico
postranscripcional (PTGS). Figura 10. Desarrollo de síntomas en plantas transgénicas
después de desafiar con ChiVMV aislado ATIPK a 15 ppp. A) Líneas transgénicas de
resistencia. B) Líneas transgénicas de resistencia moderada. C) Líneas transgénicas
moderadamente susceptibles.

El enfoque de resistencia derivada de patógenos (PDR) se convierte en el método de

elección porque logró una resistencia eficaz contra muchos virus de plantas. Parece que
no existe un mecanismo único que explique todos los ejemplos de PDR. Se han
desarrollado varios modelos para explicar el mecanismo de PTGS en la célula. En
general, el mecanismo de la resistencia mediada por proteínas está conectado para inhibir
un paso específico en el ciclo de infección del virus, dependiendo del gen viral utilizado
para la transformación. La mayor parte del ejemplo de PDR a potyvirus es, sin embargo,
mediado por ARN, que está conectado a PTGS de un transgén.
El mecanismo de resistencia variable observada que opera en los transformantes de
nuestros experimentos puede deberse a muchas razones: (i) generalmente se reconoce
que no todas las especies de ARNip son igualmente efectivas contra un ARNm dado y
debido a los efectos posicionales extensos a lo largo del ARNm, algunos ARNip muestran
una eficacia limitada, por ejemplo, estructura secundaria (Overhoff et al., 2005); (ii) se
sabía que la acumulación de ARNip inhibía por variación de temperatura y el
silenciamiento del ARN provocado por virus y transgén se atenúa (Szittya et al., 2003); (iii)
todas las plantas pueden no ser homogéneas en su contenido transgénico, y pueden no
representar el mismo comportamiento o la resistencia en algunas líneas puede estar en
un equilibrio frágil y ser superada a veces por un virus debido a la variación en el inóculo
dormido;
(iv) un posible mecanismo de baja resistencia en algunas líneas es que el escaneo de
ribosomas o la derivación del ARN sentido previene el plegamiento adecuado del ARN en
ARNbc perfecto y, por lo tanto, suprime la función de dicer eficaz (Bucher y Prins, 2006);
(v) la resistencia a menudo se asocia con un nivel bajo de expresión del transgén en
estado estacionario y un número alto de copias del transgén, mientras que la
susceptibilidad se correlaciona con un nivel alto de transcripción en el estado estacionario
y una copia transgénica baja (Fitchen y Beachy, 1993; Lindbo y Dougherty, 1992 ;
Baulcombe, 1996; Goodwin et al., 1996). Los virus se transmiten a través de los vectores
y la CP juega un papel central en la transmisión; una ventaja adicional de la resistencia
mediada por CP es que confiere un obstáculo a la inoculación del vector.

5. Conclusiones
El ChiVMV se caracterizó por primera vez sobre la base del ácido nucleico en Pakistán y
se observó que la mayoría de los genotipos de chile que se cultivan en los campos
agrícolas son vulnerables a esta amenazante amenaza. Se definió el papel del gen CP en
impartir resistencia contra ChiVMV y ahora podría utilizarse para desarrollar medidas de
control efectivas contra ChiVMV. También se requieren más estudios para estimar y
comparar las pérdidas de rendimiento en plantas de chile transgénicas y no transgénicas
y el nivel de resistencia sería desafiado en condiciones de campo. Se comprobará el
papel de otros genes de ChiVMV para conferir resistencia. También es necesario
desarrollar un clon infeccioso de longitud completa de ChiVMV y determinar la
recombinación genética del aislado ATIPK de ChiVMV paquistaní.