CRIOFRACTURA

La criofractura es una técnica muy útil para el estudio de las superficies fracturadas de la
membrana plasmática y orgánulos celulares. El proceso comprende tres pasos:

1. Congelación de la muestra (muy rápida para que no se formen cristales de hielo),

por ejemplo con nitrógeno líquido.
2. Fractura con una cuchilla, en una campana de gran vacío y a muy baja temperatura
(entre -115 y -100º C). No hay corte sino fractura por las líneas de mínima
resistencia (por ejemplo entre las dos capas de la membrana celular, o sea, la
bicapa lipídica). A continuación, se produce la sublimación del hielo a vapor de
agua (a -100º C).
3. Réplica por sombreado metálico, seguida de evaporación de carbono sobre la
muestra. El material biológico se disuelve con detergentes y sólo queda la réplica
para ser observada con el microscopio electrónico.

PREPARACIÓN DE LOS TEJIDOS PARA MICROSCOPIA

Los procesos descritos seguidamente son para conseguir una muestra de tejido lo
suficientemente fina para que la luz del miscroscopio la pueda atravesar y poder
estudiarla adecuadamente.

FIJACIÓN: Es necesaria su fijación, ya que al cortar el riego sanguíneo las enzimas

autolíticas la destruyen, y con la fijación evitamos esto. La fijación es el proceso por el cual
se detienen los procesos autolíticos. Las células de los órganos y tejidos mueren y se
descomponen cuando son extraídas de su medio si no se las mantiene en condiciones
especiales como las que se dan en los cultivos celulares. El proceso de fijación no evita la
muerte celular, pero preserva de la descomposición manteniendo la estructura
morfológica. Para ello se utilizas sustancias como el formol o el formaldehído que
producen un puente entre las proteínas creando una estructura similar a un esqueleto. En
casos de urgencia se puede utilizar nitrógeno líquido, que endurece la muestra. El
endurecimiento es además el siguiente paso. También valen el alcohol y el ácido acético.

INCLUSIÓN: Este paso mediante el cual la muestra es endurecida. Consiste en la

sustitución del agua por otro material más duro, la parafina o resinas. Esto permite que a
la muestra puedan realizársele cortes finos, lo que hace posible que la atraviese la luz al
observarla al microscopio.
Todo este largo proceso lo podemos ahorrar mediante la congelación de la muestra en
nitrógeno líquido. Pero para la morfología de la muestra es mejor el paso descrito.
CORTE: Para este proceso se utiliza el microtomo. Este es un aparato que produce láminas
finas de la muestra mediante cortes precisos y finos con cuchillas de vidrio, metal e incluso
de diamantes. Otro aparato similar es el criostato (sólo utilizado de urgencia), que trabaja
a temperaturas bajas para muestras congeladas. Además es más rápido que el microtomo,
pero produce muestra más gruesas.
Los cortes para muestra del MET se realizan con microtomos más precisos con cuchillas de
diamantes, que producirá muestra más finas.

Tipos (junto al criostato):

- micrótomo: los cortes en esta técnica suelen tener un
grosor entre 2 y 10 micrómetros. Esta técnica es
lenta y laboriosa, requiriendo al menos de 15 o 16
horas para obtenerse una muestra válida para el
corte.
Criostato
- Ultramicrótomo: se utiliza un micrótomo
equipado con una hoja de diamante para
cortar secciones muy finas (típicamente de 60 a
100 nanómetros) y situado en una zona
antivibratoria. Estas secciones se examinan
con microscopía electrónica.

TINCIÓN: Este proceso es la coloración de la

muestra. El colorante de más común es la hematoxilina-eosina. Uiliza un colorante básico
(hematoxilina) y un colorante ácido (eosina). Las sustancias de naturaleza ácida (como los
ácidos nucleicos) tienen afinidad por la hematoxilina y, en general todos los colorantes
básicos, con los que se tiñen, y por eso estas sustancias se denominan basófilas. Por el
contrario, las sustancias de naturaleza básica (como la mayor parte del citoplasma) tienen
afinidad por la eosina y, en general, por los colorantes ácidos, con los que se tiñen, y por
eso se llaman acidófilas o eosinófilas. Existen otros muchos colorantes que se emplean
habitualmente como Mallory-Azán, Orceína y Van Gieson.
El resultado es el núcleo de color azul y el citoplasma de color rosa.

Los usos combinados de colorantes permiten distinguir mejor los diversos tipos celulares y
componentes titulares. Por ejemplo, existen colorantes indicados especialmente para la
demostración de hidratos de carbono (PAS), DNA (Feulgen) o lípidos (Sudán).
 INMUNOCITOQUÍMICA

Con el paso del tiempo se han desarrollado técnicas que, mediante la producción de
reacciones químicas cuyo producto final puede ser detectado al unirse a un colorante,
permiten demostrar por medios morfológicos las modificaciones que ocurren a nivel
molecular en las células y tejidos. A continuación trataremos dos apartados sobresalientes
de la citoquímica e histoquímica:

- INMUNOCITOQUÍMICA: Las técnicas inmunocitoquímica utilizan anticuerpos como

reactivos específicos para demostrar una multitud de sustancias diferentes. Ahora
pongo un ejemplo porque no he encontrado una manera mejor para explicarlo.
Supongamos que se quiere estudiar la distribución de la actina en células o tejidos
de rata. Se obtiene actina purificada de rata y se usa como antígeno al inyectarla a
un conejo. Éste forma anticuerpos frente a la actina de rata. Estos anticuerpos
anti-actina se unen a un colorante fluorescente y se ponen en contacto con las
células de rata que se quieren estudiar. Donde haya actina habrá anticuerpos que
serán visibles en el microscopio de fluorescencia gracias al colorante.

- En vez de un colorante fluorescente se puede unir al anticuerpo una enzima como

la peroxidasa, que se pone de manifiesto mediante la diaminobencidina,
formándose un precipitado donde hay peroxidasa y, por consiguiente, anticuerpo.

A veces una sustancia es tan escasa que apenas se pone de manifiesto con la técnica
inmunocitoquímica descrita. En estos casos puede amplificarse el efecto usando la
inmunocitoquímica indirecta. Con esta técnica, los anticuerpos del conejo obtenidos
frente al antígeno se usan a su vez como antígenos al inyectarlos a una cabra. Los
anticuerpos de cabra son los que se unen al colorante fluorescente en este caso. De esta
manera conseguimos que a las moléculas en estudio (actina) se unan moléculas del primer
anticuerpo (obtenido en el conejo), al cual, a su vez, se unen varias moléculas del
anticuerpo de la cabra, que es el visible, potenciándose así la imagen obtenida.
Las técnicas de inmunocitoquímica son también aplicables a la microscopía electrónica
con las modificaciones pertinentes. Generalmente se usa inmunocitoquímica indirecta y el
anticuerpo secundario lleva acoplado algún trazador denso para poder visualizarlo en los
lugares donde se produzca la reacción. El trazador más utilizado es oro coloidal, en
partículas esféricas de diámetro comprendido entre 5 y 40 nm.

HIBRIDACIÓN IN SITU

Las técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos se basan en la capacidad de

emparejarse las secuencias complementarias de ácidos nucleicos. No sólo hebras de ADN
entre sí sino también hebras de ARN entre sí o una hebra de ADN con otra de ARN. Tienen
muchas aplicaciones, como por ejemplo la localización de un gen o de una determinada
secuencia de ADN en un tejido. La detección de la secuencia buscada se realiza
introduciendo una sonda, que consiste en un fragmento de ADN o ARN cuya secuencia
de nucleótidos es complementaria de la del fragmento de ADN o ARN que se pretende
localizar. Dicha sonda ha sido previamente marcada (radiactivamente, con una colorante
fluorescente o mediante quimioluminiscencia) para poder ser detectada posteriormente.
Si la secuencia buscada está presente, la sonda se combinará con ella y los híbridos
podrán ser detectados utilizando una técnica que permita visualizar el marcaje empleado
(impresión de una placa fotográfica, microscopía de fluorescencia…).

AUTORRADIOGRAFÍA

Esperamos un tiempo concreto y después sacrificamos al animal. Ahora estudiamos la

posición del elemento radiactivo. Por ejemplo podemos decir que los aminoácidos se
encuentran esta vez en el aparato de Golgi. Repetimos el mismo proceso con otro ratón.
Sin embargo ahora esperamos más tiempo que el anterior. Estudiamos este nuevo caso y
observamos que los aminoácidos se encuentran ahora en los lisosomas. Así con este
proceso se descubre el camino de diversos elementos.

Como en las células no hay elementos radiactivos, si a un tejido se le suministran

moléculas marcadas con isótopos radiactivos (que se seleccionan para que sólo se
incorporen a una o varias sustancias determinadas), se puede seguir el camino de esos
isótopos y dichas sustancias viendo a qué tipos celulares se incorporan o de que orgánulos
forman parte.

CULTIVO DE CÉLULAS

Una manera de experimentar la acción de diferentes factores sobre las células y los tejidos
es aislarlos de los organismos vivos en que se encuentran y colocarlos en un medio de
cultivo donde proliferan (cultivo celular). Éste es el estudio in vitro que completa el
estudio in vivo tradicional. El cultivo puede ser de fragmentos de tejidos o bien de uno
sólo o más tipos celulares previamente aislados del tejido. Las células más cultivadas son
las sanguíneas.

Los cultivos se realizan sobre la superficie de una capa de plástico sobre la que pueden
crecer las células. Sobre la capa se añaden diversos elementos necesarios para el
desarrollo de las células, como componentes de la matriz, aminoácidos, vitaminas y otras
sustancias como factores de crecimiento. Como los diferentes tipos celulares tienen
necesidades nutritivas distintas, los elementos del medio de cultivo varían dependiendo
del tipo celular.
Un cultivo se conoce como cultivo secundario, porque las células se derivan de un cultivo
previo. Por otra parte, en un cultivo primario las células se obtienen a partir del propio
organismo.

Las células cultivadas sufren un número limitado de divisiones tras las cuales mueren. Sin
embargo, es frecuente que se produzca alguna variante celular capaz de reproducirse
indefinidamente, constituyendo una línea celular. Si se desea puede aislarse una célula de
esta variante, cultivarla aparte y obtener una descendencia de ella, obteniendo así un clon
de ese tipo celular.
Un comportamiento especial es el de las células cancerosas que, además de reproducirse
indefinidamente, lo hacen con gran rapidez y sin necesidad de fijarse sobre una superficie.
Estas células se pueden obtener a partir de tumores, pero también se logra inducir la
transformación neoplásica (cancerosa) de las células normales mediante virus o sustancias
químicas.

Otra posibilidad de los cultivos celulares es la fusión de dos tipos celulares diferentes
formando una célula binucleada llamada heterocarion. Cuando un heterocarion se divide,
se reúnen los cromosomas de ambos núcleos y, tras la mitosis, se forma un nuevo tipo
celular que reúne los cromosomas de ambos tipos celulares (células híbridas). Estas
células son útiles para estudiar la interacción entre dos tipos celulares y la localización de
determinados genes.

MANIPULACIÓN DE CÉLULAS VIVAS

Una forma de manipulación de células vivas es mediante la tinción vital y supravital, que,
evidentemente, son aquellas que se practican sobre células, ya se encuentren en un
organismo vivo (vital) o procedan de este (supravital).

Por otro lado, para el estudio de las manifestaciones vitales de las muestras suelen
emplearse una serie de microinstrumentos que facilitan la introducción, al interior de las
células, de sustancias o la extracción de ciertos componentes mediante microinyectores,
micropipetas, microeléctrodos. Esto se conoce como micromanipulación mecánica.

SEPARACIÓN DE CÉLULAS

Las células se pueden separar mediante algunas técnicas, como el uso de un clasificador
celular fluorescente activado. En esta ultima técnica, la suspensión de células se trata con
un anticuerpo fluorescente que se enlaza específicamente a la superficie del tipo de célula
que se intenta cultivar y luego se pasa la suspensión a través de un instrumento
electrónico capaz de apartar en un tubo separado células marcadas con fluorescencia de
aquellas que carecen de marca.

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

La mayor parte de las células contienen gran variedad de diferentes tipos de orgánulos.
Cuando se pretende estudiar una función particular de las mitocondrias o aislar una
enzima particular del complejo de Golgi, es de suma utilidad poder aislar el orgánulo
relevante en estado puro. El aislamiento de un orgánulo particular en cantidad apreciable
por lo general se logra mediante la técnica de centrifugación diferencial, que depende del
principio siguiente: si se colocan partículas materiales más densas que el medio que las
rodea en un campo de centrifugación, las de diferente tamaño y forma viajan hacia el
fondo del tubo de la centrífuga a diferente velocidad.
Primero las células se rompen mediante alguna técnica, casi siempre agitación mecánica
en solución isotónica amortiguada (con frecuencia contiene sacarosa) utilizando un
homogeneizador mecánico. A continuación se somete el homogeneizado a una serie de
centrifugaciones secuenciales. Al principio, el homogenado se somete a fuerzas
centrífugas de baja intensidad durante un breve periodo, de modo que sólo los orgánulos
celulares de mayor tamaño, los núcleos (y algunas células residuales completas) se
sedimenten para formar un pellet. Con fuerza centrífuga sucesivamente mayor se pueden
aislar de la suspensión los orgánulos citoplasmáticos más grandes (mitocondrias,
cloroplastos, lisosomas y peroxisomas) a continuación se separan los microsomas
(fragmentos de membranas vacuolares y reticulares del citoplasma) y por último los
ribosomas.

CROMATOGRAFÍA

La cromatografía comprende una gran variedad de técnicas para fraccionar una mezcla de
componentes disueltos conforme se desplazan a través de algún tipo de matriz porosa.
Una técnica cromatográfica ofrece a los componentes de la mezcla dos fases alternativas
con las cuales pueden asociarse: una fase móvil que contiene el solvente que se desplaza y
una fase inmóvil que consta de la matriz a través de la cual se desplaza el solvente. La fase
inmóvil consta de materiales empacados en una columna. Los materiales que constituyen
la fase inmóvil contienen sitios a los cuales se pueden unir las proteínas disueltas.
Conforme las moléculas individuales interactúan con los materiales de la matriz, su avance
a través de la columna se retrasa.
Por lo tanto, cuanto mayor sea la afinidad de una molécula particular por el material de la
matriz, más lento será su paso a través de la columna. Puesto que los diferentes
componentes de la mezcla poseen distinta afinidad por la matriz, serán retardados
diferencialmente. A medida que el solvente pasa por la columna y se desliza hacia el fondo
se puede recolectar como fracciones en una serie de tubos. Los componentes de la mezcla
con menor afinidad por la columna aparecen en las primeras fracciones que emergen de
dicha columna.

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

La electroforesis es una técnica muy utilizada para fraccionar proteínas y depende de la

capacidad de molécula con carga para desplazarse cuando se colocan en un campo
eléctrico. La separación de proteínas por electroforesis se logra mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida (EGPA), en la cual las proteínas se mueven por acción de una
corriente eléctrica aplicada a través de un gel. El gel puede formarse como una delgada
capa entre dos placas de vidrio o como un cilindro dentro de un tubo de cristal. Una vez
polimerizado el gel, la placa se suspende entre dos compartimentos que contienen
amortiguador dentro del cual se sumergen electrodos de carga opuesta. La muestra con
las proteínas concentradas se extiende en una placa de gel en surcos situados a lo largo de
la parte superior del gel. La muestra de proteínas se prepara en solución de sacarosa o
glicerol cuya densidad evita que la muestra se mezcle con el amortiguador en el
compartimiento superior. Entonces se aplica un voltaje entre los compartimientos de
amortiguador y la corriente fluye a través de la placa causando que las proteínas se
desplacen hacia electrodos con carga opuesta. El movimiento relativo de proteínas a
través de un gel de poliacrilamida depende del tamaño, forma y densidad de carga de las
moléculas. Así mediante la electroforesis se puede determinar el tamaño y la
composición de las subunidades de una proteína.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Clonación del ADN
A) Transferencia de genes en células eucarióticas y embriones

B) Amplificación enzimática de ADN por PCR

Los métodos y técnicas aplicados a la tecnología del ADN recombinante son, principalmente:

- Análisis de ADN (utilizada a la hora de distinguir a dos individuos distintos de una misma
especie)

- Secuenciación de ADN (cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos en un

fragmento de ADN)

- Clonación de genes (técnica utilizada en producción de insulina o somatotropina que es la

hormona del crecimiento)

Southern blot (permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla
compleja de este ácido nucleico)

Northern blot (variante de la anterior, pero aplicada a la identificación de determinadas

secuencias de ARN)

Microarrays (con esta tecnología podemos observar de forma casi instantánea la presencia de
todos los genes del genoma humano).

A) Clonación del ADN

El método más común de clonación génica utiliza como vector de clonación un plásmido de una
bacteria, como la Escherichia coli, la cual usaremos de célula hospedadora. El procedimiento para
clonar un gen humano es el siguiente:

1. Se inserta uno o más genes marcadores en el plásmido que se utiliza como vector.

2. Se aíslan el ADN humano y el plásmido, y se cortan con la misma enzima de restricción.

3. Se mezclan los fragmentos de ADN humano con los plásmidos cortados. El ADN
humano se inserta en alguno de los plásmidos ya que, al haber sido cortados con la misma
enzima de restricción existen extremos cohesivos que pueden unirse por
complementariedad de bases. La acción de una ADN ligasa cataliza la formación de
enlaces covalentes entre las bases nitrogenadas (A, G, C, T o U) complementarias, y así
se cierra el plásmido. El resultado final es la obtención de plásmidos recombinantes.

4. Se mezclan los plásmidos con bacterias, y éstas últimas se siembran sobre una placa
de Petri, donde se incuba en una estufa hasta que proliferen las bacterias y se formen
colonias visibles.

El resultado es un cultivo de bacterias transformadas con plásmidos recombinantes, poseedoras

del gen de interés. Este procedimiento es usado a la hora de producir hormonas como la insulina o
la somatotropina.
 B) Ratones transgénicos (Knockout)

Son unos ratones que, tras ser manipulados genéticamente, poseen un gen más o un gen
menos de los que poseerían en condiciones normales. Se obtienen tras un complicado
proceso (explicado a continuación).

Un ratón transgénico es un ratón al que se le ha modificado su ADN y por tanto su

información genética. Estas modificaciones consisten en la introducción de un gen nuevo
o en la eliminación de un gen propio. La obtención de ratones transgénicos facilita el
estudio de la función básica de un gen determinado. A los ratones en los que la expresión
de un gen propio se elimina por completo se les denomina ratones knockout.

Los ratones son utilizados como modelo en experimentos de laboratorio. Un ratón

transgénico es un ratón al que se le ha modificado su ADN y por tanto su información
genética. Frecuentemente estas modificaciones consisten en la introducción o en la
eliminación de un gen (fragmento de ADN o cadena de nucleótidos que codifica la
información para producir una proteína). Mientras que insertando un gen de otro
organismo podemos obtener ratones que producen proteínas que antes no
producían, eliminando un gen podemos averiguar qué función desempeñaba la
proteína que codificaba. Existen diferentes métodos para la obtención de un ratón
transgénico. Una de las técnicas más conocidas en el campo de la biomedicina y en la
biología del desarrollo es la microinyección. Un gen de un organismo puede insertarse en
un vector, que sirve como vehículo de transporte, y ser introducido en una bacteria.
Sucesivas divisiones de la bacteria darán como resultado una población (un clon) que
porta el vector con el gen que hemos introducido. Existen métodos sencillos de extracción
de estos vectores. El gen puede ser liberado de nuevo de estos vectores empleando
enzimas de restricción que catalizan el corte del ADN en puntos con secuencias
específicas. Obtenemos de este modo un gran número de copias del gen que queremos
insertar en el ratón. El ADN lineal que incluye el gen a estudiar es entonces inyectado en
uno de los pronúcleos (generalmente el masculino, por ser de mayor tamaño) de un
ovocito de ratón fecundado, en una fase anterior a la fusión pronuclear. El paso posterior
es la fusión de los pronúcleos. El fragmento de ADN inyectado puede integrarse al azar
en el ADN del ratón. El desarrollo del embrión conducirá a la obtención del ratón
transgénico en aquellos casos en los que se den las condiciones adecuadas. La inserción
debe producirse en un fragmento de ADN del ratón que no impida la expresión del gen
introducido. Por otro lado la inserción del gen a estudiar no debe alterar la expresión de
genes del ratón que puedan enmascarar el efecto de la inserción. También es
fundamental que la inserción del gen no tenga un efecto letal en el ratón. Una estrategia
similar pero orientada a bloquear la expresión de un gen concreto de forma específica se
utiliza para obtener ratones knockout que permiten estudiar el efecto que produce la
eliminación de la expresión de un gen.

C) Amplificación de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Esta técnica tiene como finalidad aislar y amplificar un determinado fragmento de ADN a
partir de una mezcla compleja de secuencias de ADN, por medio de una enzima
polimerasa estable.

El procedimiento de esta técnica es el siguiente:

El ADN es incubado junto con los desoxinucleótidos o sus análogos, la enzima ADN
polimerasa que actúa a temperatura elevada (polimerasa Taq), y las dos secuencias de
ADN, que actúan como cebadores (=partidor=iniciador=primer, que es una molécula de
ácido nucleico que sirve como punto de partida para la replicación de ADN) específicos
para la replicación de ese fragmento de ADN. Se utiliza un cebador distinto para cada uno
de los extremos del fragmento de ADN porque las dos hebras de ADN se disponen con
direcciones opuestas y son copiadas en direcciones opuestas. La incubación se somete a
ciclos de temperatura en los que 1) el ADN se desnaturaliza, separándose en sus dos
hebras, 2) los cebadores se disponen sobre sus secuencias complementarias en las
hebras de ADN y 3) actúa la Taq polimerasa, que comienza a copiar las dos cadenas de
ADN.

El resultado es que en los ciclos siguientes cada una de las copias del fragmento de ADN
es copiada de nuevo, con lo que en cada ciclo que transcurre se multiplica por dos el
número de copias. De esta manera se sintetizan grandes cantidades de ADN a partir de
una única molécula.

Aplicaciones

1. En medicina forense: Nos permite estudiar la muestra de ADN que posea

una prueba e identificar a quien pertenece este ADN; mediante la
electroforésis de varias muestras de ADN de los sujetos sospechosos, y su
posterior comparación con el ADN de las pruebas.