FUNDACION INSTITUTO HIPOLITO UNANUE

PROYECTO DE INVESTIGACION

Determinación de las tasas de translocación de pirazinamida y

ácido pirazinoico en M. tuberculosis y su relación con el nivel de
resistencia a pirazinamida en aislados clínicos

Resumen
Problema: Pirazinamida (PZA) es una de las drogas antituberculosas más importantes. Pero
su mecanismo de acción y resistencia aún no está completamente entendido. PZA es una pro
droga que necesita ser convertida en ácido pirazinoico (POA) por la pirazinamidasa (PZasa)
dentro del bacilo para ser efectiva. Mediante un mecanismo de eflujo, el POA es transportado
fuera del bacilo donde es protonado en un medio ácido (pH 5.5 aproximadamente) y regresa
al interior liberando el protón y repitiendo el ciclo. La perdida de actividad de PZasa,
usualmente causadas por mutaciones en el gen pncA, que codifica a la PZasa, está asociada
altamente con la resistencia a PZA. Se ha demostrado que la simple presencia de mutaciones
en la PZasa (presencia vs. ausencia de mutación) está asociada con una clasificación
dicotómica de resistencia a PZA (resistente vs. susceptible).
Si el malfuncionamiento de la PZasa es el principal mecanismo de resistencia a PZA, la
asociación entre mutaciones de PZasa y la resistencia a PZA debería mostrar un efecto de
dosis-respuesta entre la eficiencia enzimática de la PZasa (el cual es un parámetro
cuantitativo), y el nivel de resistencia a PZA, medido igualmente por un parámetro
cuantitativo.
Datos preliminares: En estudios previos exploratorios se analizaron 12 muestras de
Mycobacterium tuberculosis resistentes a PZA y la cepa susceptible H37RV, obtenidas de
aislados clínicos. Se clonó, expresó y purificó la enzima PZasa y se encontró que la eficiencia
enzimática (Kcat/Km) esta significativamente asociada con el nivel de resistencia a PZA
estimada por el MIC en cultivo en medio 7H9. Sin embargo se ha encontrado que la
variabilidad de los niveles de resistencia a PZA explicada por la eficiencia de PZasa fue
escasamente 27%. Interesantemente se han encontrado 2 cepas que fueron resistentes a PZA y
cuyas PZasas recombinantes mostraron actividad.
Especulamos que la variabilidad de la resistencia a PZA no estaría principalmente explicada
por la falla funcional de la PZasa de manera exclusiva, por lo cual existiría un mecanismo
alternativo de resistencia. El mecanismo alternativo de resistencia a PZA más probable, sería
una alteración del mecanismo eflujo de POA. Una cepa de M. tuberculosis con un mecanismo
alterado de eflujo de POA sería resistente a PZA a pesar de su habilidad de convertir PZA en
POA por su enzima PZasa activa. Para contrastar esta hipótesis se propone determinar las
tasas de flujo y eflujo de POA y PZA y evaluar la relación múltiple con la eficiencia
enzimática de la PZasa, y los niveles de resistencia microbiológica a PZA en muestras
clínicas de M. tuberculosis.
Hipótesis M. tuberculosis presentaría un mecanismo de resistencia a PZA alternativo y
distinto a la falla funcional de la enzima PZasa. Una alteración de la tasa de translocación de
POA por medio de la bomba de eflujo explicaría parte de la resistencia a PZA.
Objetivo: En el presente estudio deseamos estimar la tasa de flujo y eflujo de PZA y POA y
buscar su relación con la resistencia a PZA en muestras aisladas de Mycobacterium
tuberculosis.

1
Resultados esperados e importancia: La medición de las tasas de translocación de PZA y
POA en diversas cepas para las cuales tenemos conocimiento previo de la resistencia
microbiológica y la eficiencia enzimática de la PZasa, permitirá obtener un mejor
entendimiento del mecanismo de resistencia a PZA. Esta información nos brindará
información sobre la real importancia de la PZasa y de la bomba de eflujo de POA en la
resistencia a PZA, lo cual daría un potencial impacto en el desarrollo de nuevas drogas
antituberculosas análogas a la PZA, mejorando los tratamientos contra tuberculosis latente.

1. Título del proyecto.

Determinación de las tasas de translocación de PZA, POA y POAH en M. tuberculosis

y estudio su relación con la eficiencia de la PZasa y el nivel de resistencia a PZA en aislados
clínicos

2. Objetivos del proyecto

Objetivo General

Determinar las tasas de flujo y eflujo de PZA, POA y HPOA en cepas de M.

tuberculosis previamente estudiadas por nuestro grupo y estudiar su relación con los niveles
de resistencia a PZA en muestras de M. tuberculosis de cepas clínicas, así como su
interacción con la eficiencia enzimática de la PZasa.

Objetivo Específico

 Desarrollar una metodología para cuantificar las concentraciones de PZA y

POA/POAH a nivel extracelular e intracelular en un cultivo de M. tuberculosis.
 Determinar las tasas de flujo y eflujo de POA/HPOA y PZA de las cepas clínicas en
buffer citrato a pH 5.5.
 Buscar una relación entre el mecanismo de flujo/eflujo y la eficiencia enzimática de
la PZasa, en la capacidad colectiva para explicar la variabilidad de la resistencia a
PZA.

3. Planteamiento del problema y justificación.

La tuberculosis es una enfermedad re-emergente con gran importancia a nivel mundial

causando la muerte de más de 3 millones de personas en cada año, más que cualquier otra
enfermedad infecciosa. La prevalencia global de la tuberculosis es de 1.7 billones, con una
incidencia de 8 millones de casos en total [1]. Estas tasas de mortalidad y morbilidad se han
visto incrementadas en los últimos años debido al sinergismo desarrollado con el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y la aparición creciente de cepas resistentes a
antibióticos TB-MDR [2].

Pacientes con TB-MDR presentan un pronóstico de recuperación pobre debido a que

las drogas de segunda línea no son tan efectivas, producen serios y frecuentes efectos

2
secundarios y presentan un costo elevado. La alta tasa de transmisión de TB sumado a la
emergencia de TB-MDR son actualmente los mayores obstáculos para el control de la
tuberculosis. El 30% de personas sanas pueden infectarse después de haber tenido contacto
con un paciente con TB, el 5% de estos desarrollan la enfermedad en los dos primeros años
mientras que el 40% de personas co-infectadas con VIH lo hacen [3].

3
 La pirazinamida (PZA), junto con la isoniacida (INH) y rifampicina (RIF) forman los
pilares de la terapia antituberculosa [4]. Mientras INH y RIF eliminan a los bacilos en estado
de crecimiento activo, la PZA elimina a los bacilos en estado latente. Debido a esta
importante característica la PZA ha permitido reducir el tratamiento de 9 a 6 meses [5].

Pirazinamida (PZA) es además una de las drogas antituberculosis más importantes, por
que es la única droga con alta efectividad conocida frente a M. tuberculosis en estado latente
[6]. Considerando que 2 de cada 3 personas en el mundo en promedio están infectados con M.
tuberculosis en estado latente[7], es muy importante incrementar el conocimiento sobre esta
droga, a nivel del mecanismo de acción y resistencia, el cual potencialmente permitirá
desarrollar estrategias para la generación de nuevos fármacos alternativos.

La perdida de actividad de la enzima pirazinamidasa (PZasa) de M. tuberculosis y

mutaciones en el gen pncA que codifica a la PZasa, están altamente asociadas con la
resistencia a PZA. Se ha demostrado que mutaciones de PZasa (presencia vs. ausencia) están
asociadas con una clasificación de resistencia a PZA (resistente vs. susceptible) [8, 9] . Sin
embargo, se ha demostrado que la variabilidad de la resistencia a PZA explicada por la falla
funcional de la PZasa no es en realidad muy alta [10]. Esto deja abierta la posibilidad de
mecanismos de resistencia alternativos que merecen ser estudiados. En el presente estudio
proponemos estudiar el mecanismo de eflujo del ácido pirazinoico como potencial factor que
determina resistencia a PZA.

4. Marco teórico

Tuberculosis (TB) es una enfermedad re-emergente con una enorme importancia en el

mundo ya que causa la muerte de 2 millones de personas cada año. Más de cualquier otra
enfermedad infecciosa. Estas estadísticas de mortalidad han continuado incrementándose
continuamente en los últimos años como un resultado de sinergismos con co-infecciones por
VIH y el alarmante crecimiento de cepas que son resistentes a los antibióticos de primera
línea (MDR-TB) [11].

La PZA es una droga importante de primera línea para tuberculosis y parece ser las
más importante matando bacilos latentes. La inclusión de PZA con Isoniasida y Rifampicina
ha permitido acortar el periodo de tratamiento de 9 meses a 6 meses [12]. Las cepas
resistentes a PZA emergentes representan un importante problema de salud pública ya que
ambas etapas del tratamiento incluyen PZA. Casi el 30% de las cepas peruanas MDR TB son
también resistentes a PZA[13] . En Perú también como en muchos países en desarrollo, la
PZA es parte del tratamiento de segunda línea anti tuberculosis en pacientes donde falla el
tratamiento de primera línea[14].

4
 Los mecanismos de acción y resistencia a PZA en M. tuberculosis son
incompletamente entendidos debido a sus propiedades inusuales. Aislados susceptibles a PZA
de M. tuberculosis poseen una enzima nicotinamidasa / pirazinamidasa que hidroliza PZA en
ácido pirazinoico (POA) [15] . El POA es transportado fuera del bacilo por un mecanismo de
eflujo deficiente y bajo condiciones ácidas extracelulares del medio es protonado y convertido
en HPOA, el cual posteriormente reingresa al bacilo liberando el protón en el citoplasma. Este
ciclo es repetitivo y el resultado es la reducción letal del pH intracelular y la acumulación de
POAH el cual altera la permeabilidad de membrana celular (figura 1), [16] .

Figura 1: Mecanismo de acción

de la PZA en MTB.
POA: ácido pirazinoico
HPOA: ácido pirazinoico
protonado

El principal mecanismo de resistencia a PZA se piensa que se debe a la pérdida de

actividad de la PZasa causando una falta de hidrólisis de PZA en POA. Diversos estudios han
demostrado una asociación entra la resistencia a PZA y mutaciones en el gen pncA [8],
sugiriendo que el secuenciamiento de ADN (i.e. del gen que codifica a la PZasa), podría ser
usado para predecir resistencia. En previos estudios se ha encontrado que mutaciones
silenciosas en el gen pncA de aislados peruanos de M. tuberculosis son raras y que otras
mutaciones están altamente asociadas con la resistencia a PZA (sensibilidad del 93.5% y una
especificidad del 96.4%) [10].

Los residuos catalíticos parecen afectar un sitio activo y un sitio de unión metálica. Se
piensa que los residuos de aminoácidos del sitio activo son D8, A134, C138 y K96 y los del
sitio de unión metálica son D49, H51 y H71. Esto sugiere que las mutaciones que causan una
gran pérdida de actividad de PZasa son las que producen una alteración en el sitio activo y de
unión metálica. Mutaciones localizadas lejos de estos sitios tienen un menor efecto en la
actividad PZasa [17].

5
 Lemaitre [18] y Zhang [19] clonaron y expresaron PZasas mutantes obtenidas de
aislados clínicos de M. tuberculosis así como también generadas por muta-génesis dirigida,
respectivamente. Estos estudios mostraron que la actividad específica de las enzimas varían
dependiendo del sitio de la mutación. Los que tuvieron mutaciones en el sitio catalítico
estuvieron asociados con la menor actividad enzimática.

Solamente un estudio ha correlacionado la actividad de PZasa con la resistencia

microbiológica. Pero sin estimar los parámetros cinéticos o una medición cuantitativa de la
resistencia. Este estudio encontró una débil actividad de PZasa en aislado resistentes con
mutaciones de pncA sugiriendo que las mutaciones pueden afectar la actividad de PZasa
diferencialmente según su localización.

Es claro que la resistencia a la PZA puede deberse entonces a varios posibles factores,
desde el mal funcionamiento de la enzima pirazinamidasa debido a mutaciones en el gen
pncA, hasta defectos en cualquiera de los canales o bombas mencionadas. Se presume que un
80% de los casos de resistencia a PZA se deben a fallas en la enzima PZasa, mientras que un
20% de cepas resistentes muestran una actividad completa de de la enzima, en cuyo caso
habría problemas asociados a las bombas. Estos canales o bombas responsables del tránsito
intra-extra-intra celular del ácido pirazinoico son hasta el momento desconocidos, y son un
tema de especial interés actualmente.

Para probar que la falla funcional de la enzima PZasa es la principal causa de

resistencia, no solamente se debe probar la asociación entre la presencia/ausencia de
mutaciones de PZasa y la resistencia dicotómica a PZA. Para verificar rigurosamente esta
idea, es es necesario demostrar un efecto de dosis respuesta, verificando que la eficiencia de
PZasa (la cuál depende del tipo de mutación), está correlacionada con los diferentes niveles de
resistencia a PZA. En nuestros estudios previos hemos demostrado una falta de alta
correlación. Menos del 30% de la variabilidad de la resistencia a PZA puede ser explicada por
la eficiencia de la PZasa. Esto deja abierta la posibilidad de un mecanismo de resistencia
alternativo.

Zhang probó que el POA es acumulado dentro de M. tuberculosis en comparación con

mycobacterias naturalmente resistentes, esto es causado por una bomba deficiente de eflujo de
POA[20]. Esto sugiere que la bomba de eflujo encargada de transportar el POA intracelular al
ambiente extracelular, es importante para la actividad de la PZA.

Hasta el momento, ningún trabajo previo ha medido cuantitativamente las tasas de

translocación de PZA, POA y HPOA en células vivas de M. tuberculosis, y visto su
correlación con la resistencia microbiológica a PZA y con la eficiencia enzimática de la
PZasa, para determinar la real importancia de la PZasa en la resistencia a PZA.

6
5. Estudios preliminares:

En estudios previos exploratorios se analizaron 12 muestras de Mycobacterium

tuberculosis resistentes a PZA y la cepa susceptible H37RV. Se clonó, expresó y purificó la
enzima PZasa y se encontró que la eficiencia cuantitativa de la PZasa (Kcat/Km) esta
significativamente asociada con la resistencia microbiológica a PZA, obtenida por el MIC, en
aislados clínicos cultivados en medio 7H9. Sin embargo, a pesar de que la asociación es
significativa, se ha encontrado que la variabilidad de los niveles de resistencia a PZA
explicados por la eficiencia de la PZasa fue escasamente 27% (Tabla 1).

Interesantemente se han encontrado 2 cepas que fueron resistentes a PZA y cuyas

enzimas PZasa recombinantes mantuvieron su actividad relativamente alta. Este hallazgo
sugiere que la variabilidad de la resistencia a PZA no estaría exclusivamente explicada por la
falla funcional de la PZasa, por lo cual existiría un mecanismo alternativo de resistencia. El
mecanismo alternativo de resistencia más probable sería una alteración de la tasa de
translocación de POA por la bomba de eflujo. Una cepa de M. tuberculosis con un mecanismo
alterado de eflujo de POA sería resistente a PZA a pesar de tener habilidad de convertir PZA
en POA gracias a una enzima PZasa activa.

7
Tabla 1. Resistencia microbiológica de aislados clínicos de M. tuberculosis, y parámetros cinéticos de la enzima PZasa recombinante.

M. tuberculosis sputum isolate Recombinant PZase

Wayne Activitiy
Mutation MIC Bactec 460TB - Km kcat Efficiency
Mutation PZase (μmol POA·min-
Region PZA PZA (mM) (min-1) (mM-1· min-1)
activity 1
· mg-1 protein)
% Suscep- 95% CI 95% CI 95% CI P-value
Median IQR Mean Mean Mean
Growth tibility (+/-) (+/-) (+/-)
T135P Close AS >800 Negative 98 R 0.02 0.02 0.93 0.45 0.45 0.25 NS 0.000
H51R MBS >800 Negative 90 R 0.006 0.001 1.41 0.18 0.17 0.01 0.12 0.70 0.000
D49N MBS 400 Negative 74 R 0.045 0.014 3.09 1.19 1.53 0.45 0.55 0.50 0.000
T76P Close MBS 200 Negative 89 R 8.99 0.95 0.31 0.05 202.98 7.8 650.33 89.71 0.34
L116P Distant 100 Negative 46 R 50.15 5.68 1.56 0.15 1324.5 85.19 847.66 37.11 0.820
D12A Close AS 400 Weak 77 R 9.24 3.19 0.99 0.16 245.17 19.20 248.79 20.04 0.000
D12G Close AS 400 Weak 70 R 14.00 2.52 0.55 0.06 368.46 14.96 716.83 64.78 0.042
F94L Close AS 400 Weak 70 R 21.19 8.89 2.00 0.47 712.92 111.46 348.6 30.48 0.010
G24D Distant 200 Weak 68 R 4.28 3.25 0.42 0.25 100.13 16.30 236.2 107.40 0.046
Y34D Distant 100 Weak 78 R 20.58 8.35 0.83 1.05 386.4 210.06 460.19 362.01 0.568
G78C Distant 100 Weak 27 R 6.96 0.83 1.07 0.14 105.16 7.02 97.65 6.10 0.000
K48T Close MBS ≤50 Positive 20 R 10.45 1.06 0.44 0.05 241.82 8.34 551.2 40.03 0.036
D136G Close AS ≤50 Positive 3 S 12.34 6.84 3.68 0.81 490.27 86.62 133.03 72.90 0.000
Wild type Nomutation ≤50 Positive 1 S 38.40 18.36 1.24 0.44 1005.41 199.91 806.6 144.60

P-value: Significancia estadística de la comparación de la eficiencia enzimática de cada mutante y la correspondiente

a la cepa silvestre de referencia, susceptible a PZA (H37RV)

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6. Metodología:

Explicación Teórica
La dinámica del mecanismo de acción de PZA podría ser simplificado como tres
procesos de translocación de moléculas con tasas características constantes: (1) La entrada de
PZA en el ambiente intracelular de mycobacterium con una tasa constante I, en donde la PZA
es convertida a POA a una tasa no limitante, (2) la salida de POA a través de un mecanismo
de eflujo al medio extracelular a una tasa constante E, donde es protonado (POAH) a una tasa
no limitante y (3) la reentrada del POAH protonado al medio intracelular a una tasa constante
F donde el protón es liberado a una tasa no limitante.

Dependiendo de las mutaciones en las proteínas asociadas a la bomba de eflujo o los

mecanismos involucrados en los procesos de translocación de PZA o POAH, una
determinada cepa tendrá valores específicos para las tasas I, E y F.

Se ha demostrado que cepas con altos valores de tasa de eflujo E son naturalmente
resistentes a PZA, como M. smegmatis. También se espera que las cepas con tasas E menores
que las correspondientes a cepas susceptibles H37RV sean resistentes a PZA dado que el
POA no es bombeado fuera de la bacteria. En principio, cualquier alteración del delicado
balance de las tasas de translocación mencionadas, podría comprometer la susceptibilidad a
PZA en la micobacteria.

Si consideramos a las células de M. tuberculosis en un medio conteniendo una

cantidad inicial de PZA (Z0) y si la cinética de translocación avanza linealmente en cierto
periodo de tiempo de incubación dt, parte de la pirazinamida inicial se encontrará dentro de la
bacteria (Zi) mientras que cierta cantidad de PZA se encontrará en el medio extracelular (Ze).
Al mismo tiempo, parte de la PZA estará siendo convertida a POA, el cuál se encontrará en el
medio intracelular (Pi) y en el medio extracelular (Pe) en su forma protonada.

Resolviendo un sistema de ecuaciones diferenciales para las tasas de cambio de PZA,

POA y POAH en primera aproximación, se puede mostrar que se reducen a un sistema de
ecuaciones algebraicas múltiples, en donde las tasas de translocación I, E y F pueden ser
calculadas, a partir de la medición de las concentraciones intra y extra celular de PZA y
POA.

Z0 – Ze = - dt ( I Ze)
Zi + Pi = dt ( I Ze + E Pe – F Pi )
Pe = dt ( F Pi – E Pe )

Por lo tanto, para lograr estimar los parámetros I, E y F, es necesario medir la

concentración de PZA y POA, en el medio intracelular y extracelular, después de un tiempo
de incubación dt con una cantidad inicial de PZA (Z0).

En ensayos preliminares, hemos verificado que la PZA y el POA a concentraciones

entre 0.05 a 0.25 mM absorben característicamente a 268 nm de manera similar y siguen una
tendencia lineal en la gráfica de Lambert-Beer. Adicionalmente hemos verificado que a esas
concentraciones el POA puede reaccionar con SO4NH3 similarmente a lo que se da en la
reacción de Wayne, dando una señal detectable a 450 nm. Basados en esta evidencia, el
protocolo para medir Zi ,Pi, Ze y Pe es el siguiente:

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10
Procedimientos

Realización de mediciones en pruebas con condiciones estándar sin Micobacterium

 Producción de PZasa recombinante

 Pruebas de absorbancia
Se determinará el espectro de absorbancia y el coeficiente de extinción molar de PZA
y POA en buffer citrato a pH 5.5 por espectrofotometría UV

 Pruebas Wayne POA

Se determinará el coeficiente de extinción molar de POA en buffer citrato a pH 5.5
con la prueba Wayne.

 Pruebas Wayne + PZA

Se determinara el la concentración total de PZA y POA en buffer citrato a pH 5.5 con
la prueba Wayne con PZasa activa

Realización de mediciones con las distintas cepas de Micobacterium

 Cultivo de cepas de Micobacterium

Un número determinado de bacilos será incubado en 5 mL de buffer citrato a pH 5.5,
con PZA a 0.20 mM por 1 hora a 37 C. En estas condiciones, la PZA se habrá distribuído a
nivel intra y extra celular, e igualmente una fracción de ella se habrá transformado en POA y
POAH, distribuyéndose igualmente a nivel intra y extra celular.

 Toma de muestras del medio intracelular (pellet) y extracelular

(sobrenadante)
Luego de la incubación, el sistema será calentado a 80 C por 5 min seguido por un
enfriamiento rápido a 4 C para inactivar la actividad de la enzima PZasa. El sistema se
mantendrá a esta temperatura (4 C) durante todas las etapas siguientes. Se realizará en
paralelo una reacción control que será idéntica a la descrita excepto que no tendrá PZA. La
solución de bacterias incubada será centrifugada a 3 000 g por 10 minutos y tanto el
sobrenadante como el pellet se recuperarán

 Medición de PZA y POA extracelular (sobrenadante)

En el sobrenadante se mediará la presencia de PZA y POA usando tres métodos

distintos:

(1) Absorbancia a 268 nm. contra el blanco, con lo cual se determinará la

concentración total de Ze + Pe.

(2) Una alicuota de sobrenadante será incubada con PZasa activa, fresca y purificada
durante toda la noche, con lo cual toda la PZA será totalmente convertida a POA. Se añadirá
SO4NH3 al 20% y luego de 5 minutos se mediará la abosorbancia a 450 nm, de manera
similar a la prueba de Wayne. Esto determinará nuevamente la concentración total de Ze + Pe.

(3) Para determinar la concentración solamente del POA externo, una alícuota del

11
sobrenadante será incubada directamente con SO4NH3 (el cual reacciona únicamente con
POA y no con PZA), 20% por 5 minutos y luego se medirá la absorbancia a 450 nm. Con esta
absorbancia podremos determinar la concentración del POA externo (Pe), debido a que el
SO4NH3 solamente reacciona con el POA.

 Medición de PZA y POA intracelular (pellet)

El pellet de ambas reacciones (con PZA y el control) será solubilizado en agua milliQ
y luego sonicado a 4 C en 5 ciclos por un periodo total de 30 minutos. Usando la reacción de
control como blanco, se realizarán las mismas tres determinaciones descritas anteriormente
para el control y la muestra. Esto nos permitirá calcular la PZA interna y el POA interno.

Estimaremos las tasas de translocación de cada una de las 12 cepas previamente

estudiadas por nuestro grupo (tabla 1), para las cuales ya tenemos la información del nivel de
resistencia a PZA así como información de los parámetros cinéticos de la enzima PZasa
recombinante.

7. Análisis

 Calcularemos las tasas de translocación I, E, F, con sus respectivos intervalos 95%

de confianza, para cada cepa de M. tuberculosis seleccionada
 Calcularemos la correlación lineal entre la actividad de flujo/eflujo de POA y la
resistencia microbiológica MIC a PZA para las cepas seleccionadas, mediante el
test de correlación de Pearson para variables continuas.
 Se desarrollarán comparaciones de las distintas tasas de flujo y eflujo en las
diferentes cepas en una regresión lineal múltiple, ajustando por potenciales
variables confusoras como los parámetros cinéticos de las PZasas recombinantes.
 Todos los análisis estadísticos se realizarán bajo un nivel de confianza del 95%
usando el paquete estadístico Stata 10.0

8. Resultados e impacto esperados.

La medición de las tasas de translocación de PZA y POA en diversas cepas para las
cuales tenemos conocimiento previo de la resistencia microbiológica y la eficiencia
enzimática de la PZasa, permitirá obtener un mejor entendimiento del mecanismo de
resistencia a PZA. Estos datos nos brindarán información sobre la real importancia de la
PZasa y de la bomba de eflujo de POA en la resistencia a PZA, lo cual daría un potencial
impacto en el desarrollo de nuevas drogas antituberculosas análogas a la PZA, mejorando los
tratamientos contra tuberculosis latente.

12
9. Infraestructura y medios físicos a utilizar (Laboratorios, talleres experimentales,
equipos sofisticados, etc.)

Laboratorio de enfermedades Infecciosas / Laboratorio de Mycobacterium

Este laboratorio con un ambiente ad-hoc de nivel de bioseguridad 3 PL3, el cual
cuenta con cinco cámaras de flujo laminar, dos microscopios fluorescentes, microscopios
múltiples, tres congeladores de –70 grados centígrados incubadores múltiples C02,
refrigeradores, autoclaves, productor de agua milli-Q, centrífugas refrigeradas, centrífugas
regulares y seis termocicladores.

También se cuenta con tres maquinas MB-BAC-T (el equivalente no radioactivo del la
máquina bien conocida como BACTEC) las cuales son usadas diariamente para un cultivo
automatizado y rápido de TB y pruebas de sensibilidad.

El laboratorio tiene acceso a 7 computadores y a Internet de banda ancha. Además hay

un salón con autoclaves y material para lavar herramientas de vidrio. En resumen es un
laboratorio altamente equipado.

Laboratorio de Biología Molecular

Este laboratorio está especializado en trabajo con técnicas microbiológicas y de
biología molecular y desarrolla pruebas de clonación, amplificación de genes entre otras.

Laboratorio de Bioinformática
Este laboratorio participa en los análisis bioinformáticos, estadísticos y teóricos de los
proyectos y tiene un equipamiento de última generación con acceso a software especializado
de bioinformática y estadística.

10. Cronograma de trabajo

MESES
1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12
Determinación del espectro de
absorbancia de PZA y POA y
X
calibración de la prueba de
detección
Determinación del coeficiente
de extinción molar de PZA y
X
POA y calibración de la
prueba de detección
Cultivo de las cepas
seleccionadas de M. XX XX XX
tuberculosis.
Determinación de las tasas de
XX XX XX
translocación de PZA y POA
Análisis estadísticos de datos X XX
Preparación del informe final X
X= 30 días

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11. Presupuesto (en Soles S/.)

Medios de cultivo de M. tuberculosis y E. coli

1Kg Caldo LB 300
500g Caldo 7H9 400
Antibióticos 700

Materiales y Reactivos para la medición de pirazinamida y ácido pirazinoico

500g Citrato 250
2 unidades Cubetas de cuarzo para espectrofotometría UV 1500
500 unidades Cubetas de plástico para espectrofotometría visible 500
1 unidad pipeta 10 uL 810
100g Pirazinamida 750
10g Acido pirazinoico 250

Material plástico y vidrio

Tips, eppendorf, gradillas, guantes, matraces 3000

Materiales de escritorio
Papeles, marcadores y otros 700

Total solicitado: 9160 soles

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12. Bibliografía (estrictamente relacionada al proyecto)

1. Raviglione, M.C., D.E. Snider, Jr., and A. Kochi, Global epidemiology of

tuberculosis. Morbidity and mortality of a worldwide epidemic. Jama, 1995. 273(3): p.
220-6.
2. Dye, C., et al., Consensus statement. Global burden of tuberculosis: estimated
incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveillance and
Monitoring Project. Jama, 1999. 282(7): p. 677-86.
3. Small, P.M. and P.I. Fujiwara, Management of tuberculosis in the United States. N
Engl J Med, 2001. 345(3): p. 189-200.
4. Mitchison, D.A., The action of antituberculosis drugs in short-course chemotherapy.
Tubercle, 1985. 66(3): p. 219-25.
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