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Revisar

Biotecnología e ingeniería genética en el

desarrollo de nuevos fármacos.
Parte I.Tecnología del ADN y proteínas recombinantes

Agnieszka Stryjewska1, Katarzyna Kiepura1, Tadeusz Librowski2,

Stanis³aw Lochyñski3

1Departamento de Química Bioorgánica, Facultad de Química, Universidad Tecnológica de Wroc³aw,

Wyb. Wyspiañskiego 27, PL 50-370 Wroc³aw, Polonia

2Departamento de Radioligandos, Facultad de Medicina, Facultad de Farmacia, Universidad Jagellónica, Medyczna 9, PL

30-688 Cracovia, Polonia

3Instituto de Cosmetología, Facultad de Fisioterapia de Wroc³aw, Koœciuszki 4, PL 50-038 Wroc³aw, Polonia

Correspondencia: Stanis³aw Lochyñski, correo electrónico: s.lochynski@wsf.wroc.pl ; Tadeusz Librowski, correo

electrónico: mflibrow@cyf-kr.edu.pl

Abstracto:
La biotecnología farmacéutica tiene una larga tradición y tiene sus raíces en el siglo pasado, ejemplificada por primera vez por la penicilina y la
estreptomicina como compuestos biosintéticos de bajo peso molecular. Hoy en día, la biotecnología farmacéutica todavía tiene sus fundamentos en la
fermentación y el bioprocesamiento, pero el cambio de paradigma afectado por la biotecnología y las ciencias farmacéuticas ha llevado a una definición
actualizada. La revolución biotecnológica rediseñó los procesos de investigación, desarrollo, producción e incluso comercialización de medicamentos.
Potentes nuevos instrumentos y disciplinas científicas relacionadas con la biotecnología (genómica, proteómica) permiten examinar y explotar el
comportamiento de proteínas y moléculas.
Las tecnologías de ADN recombinante (ADNr) (ingeniería genética, de proteínas y metabólica) permiten la producción de una amplia gama de péptidos, proteínas y
productos bioquímicos a partir de células que no producen de forma natural. Esta tecnología, que ahora tiene aproximadamente 25 años, se está convirtiendo en una
de las tecnologías más importantes desarrolladas en los 20th siglo.
Los productos farmacéuticos y las enzimas industriales fueron los primeros productos biotecnológicos del mercado mundial elaborados mediante ADNr. A pesar de
los importantes avances con respecto a las aplicaciones del rDNA en células de mamíferos, las levaduras aún representan huéspedes atractivos para la producción de
proteínas heterólogas. En esta revisión describimos estos procesos.

Palabras clave:

biotecnología, tecnología de ADN recombinante, mutagénesis dirigida, aranesp, activasa

Introducción siglos, como la producción de alcohol, así como el

La biotecnología se define como organismos o
moléculas biológicas, que se utilizan en la producción
industrial. Este término incluye procesos utilizados para
descubrimiento en años más recientes de la ingeniería
genética [30, 40, 46]. La biotecnología en la
farmacología se denomina biotecnología farmacéutica,
que produce biofarmacéuticos. Se trata de proteínas con
significado terapéutico y recientemente nutridas.

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Ácido cleico utilizado en la terapia génica, que se está
produciendo debido a la ingeniería genética o la
biotecnología tradicional.
La industria de la biotecnología se ha desarrollado de
manera más dinámica durante los últimos 30 años del 20th
siglo. En la actualidad, existen más de 10.000 empresas
farmacéuticas que producen en total unos 5.000
biofármacos. Sin embargo, solo 100 de estas empresas
tienen importancia y significado en la industria. El éxito
médico de las sulfonamidas y la insulina dio un nuevo
énfasis a la industria, que fue impulsada aún más por el
comienzo de la fabricación de penicilina a escala industrial a
principios de la década de 1940 [32, 46, 48].
En los años 1971-1973 entró en vigor una nueva tecnología,
que luego se convirtió en un gran punto de inflexión científico.
Se trataba de tecnología de ADN recombinante, también
conocida como ingeniería genética, que hasta hoy es la base de
muchos procesos biotecnológicos. La PCR (reacción en cadena
de la polimerasa) es uno de los elementos de la tecnología
detrás del ADN recombinado. La técnica descubierta en 1985
por Mullis permite a los investigadores producir millones de
copias de una secuencia de ADN específica en
aproximadamente dos horas. Este proceso automatizado evita
la necesidad de utilizar bacterias para amplificar el ADN [11].
Los procesos biotecnológicos básicos más utilizados en la
industria farmacéutica, además de la tecnología del ADN
recombinado, e incluidos dentro de esta mutagénesis dirigida,
son los biocatalizadores, la tecnología de anticuerpos
monoclonales, la tecnología de vacunas, la ingeniería
metabólica y, sólo recientemente, también la terapia génica. Sin
embargo, estos procesos se basan en gran medida en las
herramientas de la ingeniería genética. La biotecnología
también ha tenido un gran impacto en la industria farmacéutica.
Tecnologia de ADN recombinante
La idea del ADN recombinante fue propuesta por primera vez
por Peter Lobban, un estudiante de posgrado del Prof. Dale
Kaiser en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Stanford. La tecnología de ADN
recombinante es la técnica que permite producir ADN
vía medios artificiales. El procedimiento se ha utilizado para
cambiar el ADN en organismos vivos y puede tener usos
incluso más prácticos en el futuro. Es un área de la medicina
que se encuentra actualmente en su fase inicial del esfuerzo
concertado global [32].
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La piedra angular de la mayoría de las tecnologías de
biología molecular es el gen. Para facilitar el estudio de
los genes, se pueden aislar y amplificar. Un método de
aislamiento y amplificación de un gen de interés es
clonar el gen insertándolo en otra molécula de ADN que
sirve como vehículo o vector que puede replicarse en
células vivas. Cuando se combinan estos dos ADN de
diferente origen, el resultado es una molécula de ADN
recombinante [39].
Actualmente, la tecnología del ADN recombinante ha atraído
titulares cuando se ha utilizado en animales, ya sea para crear
copias idénticas del mismo animal o para crear especies
completamente nuevas. Una de estas nuevas especies es el
GloFish ™, un tipo de pez que parece brillar con una coloración
fluorescente brillante. Si bien se han convertido en un pez de
acuario popular, también tienen otros usos. Los científicos
esperan usarlos para ayudar a detectar vías fluviales
contaminadas, por ejemplo.
La tecnología del ADN recombinante no se acepta en ciertos
sectores, especialmente en los conservadores sociales, que
sienten que la tecnología es una pendiente resbaladiza para
devaluar la singularidad de la vida. Además, debido a que
algunos trabajos de ADN implican el uso y destrucción de
embriones, se genera más controversia. Aún así, los defensores
de la tecnología dicen que el objetivo final es beneficiar la vida
humana, no destruirla.
¿Cómo obtener genes?
Dos categorías principales de enzimas son herramientas
importantes en el aislamiento de ADN y la preparación de
ADN recombinante: endonucleasas de restricción y ligasas
de ADN. Las enzimas de restricción son enzimas que cortan
el ADN que se encuentran en las bacterias. Debido a que
cortan dentro de la molécula, a menudo se les llama
endonucleasas de restricción. Para poder secuenciar el
ADN, primero es necesario cortarlo en fragmentos más
pequeños. Muchas enzimas que digieren ADN pueden
hacer esto, pero la mayoría de ellas no sirven para el trabajo
de secuencia porque cortan cada molécula al azar. Esto
produce una colección heterogénea de fragmentos de
diferentes tamaños. Lo que se necesita es una forma que
rompa la molécula de ADN en unos pocos sitios ubicados
con precisión para que se produzca un pequeño conjunto
de fragmentos homogéneos. Las herramientas para esto
son las endonucleasas de restricción. Cuanto más raro sea
el sitio que reconoce,
Al usar la transcriptasa inversa de una enzima de
retrovirus, el ARN-ADNc híbrido producido y el
siguiente ARNsa H digiere el hilo parcialmente ARN

[11]. El cDNA incurrido está privado de intrones y
secuencias de control [1]. Los fragmentos de ARN restantes
sirven como cebadores para la polimerasa ADN I, que
sintetiza la otra cadena de ADNc [11]. Los procedimientos
posteriores son los mismos que en la formación de la
biblioteca genómica; aunque los clones incurridos
contienen el conjunto de solo estos genes, que se rindieron
a la expresión en la célula utilizada.
La creación de fragmentos falsos basados en la
secuencia de aminoácidos conocida de la proteína
requiere codones de ajuste que se correspondan
con un aminoácido particular. Para péptidos
cortos, será suficiente crear ADN monocatenario e
hibridar con un segundo hilo complementario.
Para péptidos largos, muchos oligonucleótidos
encapsulados químicamente experimentan
hibridación; polimerasa (una polimerasa es una
enzima cuya función biológica central es la síntesis
de polímeros de ácidos nucleicos. La ADN
polimerasa y la ARN polimerasa se utilizan para
ensamblar moléculas de ADN y ARN,
respectivamente, copiando generalmente una
cadena de plantilla de ADN o ARN mediante
interacciones de emparejamiento de bases ) y
ligasa (la ligasa es una enzima que puede catalizar
la unión de dos moléculas grandes formando un
nuevo enlace químico,
La selección del gen correspondiente de la biblioteca se
produce debido al uso de la sonda que es complementaria
al fragmento dado de un hilo marcado de ADN [1]. Los
clones se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o
nailon y se llevan a desnaturalizar el ADN mediante
temperatura (80 ° C para nitrocelulosa) o UV (para nailon).
Después de agregar la sonda marcada, se produce la
hibridación con las cadenas de ADN desnaturalizadas. A
continuación, las sondas no unidas se lavan y la muestra se
seca y se somete a autorradiografía. La franja visible
corresponde al gen buscado.
[8]. La sonda puede ser homóloga, que es
perfectamente complementaria al fragmento de ADN
dado, o la sonda puede ser heteróloga cuando la
secuencia es muy similar a la partícula estudiada [5, 38].
La PCR permite obtener una gran cantidad de fragmentos
seleccionados de la cadena polinucleotídica. Esta secuencia
permanece desconocida. Sin embargo, es suficiente el
conocimiento de las secuencias flanqueantes, que se
encuentran a ambos lados de la sección, destinadas a la
amplificación. Para la mezcla de reacción, además del ADN,
grandes cantidades de dos tipos de oligonucleótidos cortos,
que son complementarios a las secuencias flanqueantes y
Tecnología de ADN en el desarrollo de nuevos fármacos.
AgramonorteImiszka Stryjmiwska mit al.
sirven como imprimaciones y se añaden polimerasa Taq
resistente al calor. Calentar el contenido del tubo a 94 ° C
provoca la desnaturalización del ADN de doble hélice. El
enfriamiento a 50-60 ° C hace que los oligonucleótidos
monocatenarios se unan. Después de recalentarse a 74 ° C,
la polimerasa Taq comienza a actuar y sintetiza la nueva
cadena. Múltiples (25-30 veces) repeticiones de estos pasos
provocan la creación de millones de copias del segmento
amplificado [11].
Introducción de un gen en un vector
Un plásmido bacteriano puede ser el vector: ADN de
partículas autónomas esféricas, bacteriófagos (fagos l,
ej., M13), que es un virus que infecta la bacteria y el cósmido de
las células, un plásmido con acogedor termina [11]. En el caso
de las moléculas largas del ADN de los mamíferos, se crean
vectores cromosómicos artificiales (YACi, Baci, MACS) que
pueden caber en grandes fragmentos [1, 31].
Los fragmentos de ADN, incurridos a través de cortes de
endonucleasas, no siempre tienen los extremos pegajosos
necesarios para conectar las dos moléculas de ADN.
También faltan en el caso del ADNc. Posteriormente, se
forman homopolímeros complementarios monocatenarios
que luego se unen hasta los extremos 3 'y 5' de la segunda
cadena de la partícula con extremos romos con la ayuda de
la transferasa terminal. El otro método consiste en conectar
enlazadores, la secuencia de extremos romos bicatenarios
que contienen al menos un punto de restricción. Después
de ligar los enlazadores al ADN, son digeridos por la
endonucleasa apropiada, lo que crea extremos pegajosos
[8]. Los adaptadores se utilizan cuando la partícula de ADN
clonada tiene el mismo punto de restricción que los
enlazadores. Los adaptadores tienen un extremo romo y un
extremo cohesivo. El extremo 5 'está privado del grupo
fosfórico, y los adaptadores, por lo tanto, no se conectan
juntos en una mezcla antes de conectarse al ADN. Después
de que los extremos romos de los adaptadores y el
fragmento del ADN se unan, la polinucleótido quinasa une
el grupo fosfórico al lugar recordado y luego puede alcanzar
la ligadura del ADN examinado del ADN del vector [11].
Otro ejemplo es un vector del polímero. Los vectores
basados en polímeros son biológicamente seguros, tienen
bajos costos de producción y son herramientas eficientes
para la terapia génica. Aunque los polyplexes no
degradables exhiben altos niveles de expresión génica, su
potencial de aplicación es limitado debido a su incapacidad
para ser eliminados de manera efectiva, lo que resulta en
citotoxicidad. El desarrollo de polímeros biodegradables ha
permitido altos niveles de transfección sin citotoxicidad [24].
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 Transferencia de vector recombinante a la célula
Para facilitar la entrada del vector en la célula
bacteriana, se debe hacer que la célula sea competente.
Sumergir la celda en CaCl2 solución o algunas otras sales
y luego calentar durante 2 min a 42 ° C hace que se
vuelva más susceptible a aceptar el nuevo ADN del
entorno. La introducción del plásmido recombinado en
la célula bacteriana se conoce como transformación.
Los vectores de fagos se introducen en el proceso de
transfección o empaquetado. in vitro. La transfección también
consiste en crear células bacterianas competentes y calentar la
solución, pero introduce la RF (forma replicativa) o M13. Durante
in vitro embalaje, soporta estar en una mezcla de material
recombinante de l fagos en el borde proteico. Utiliza los genes
del fago que son responsables de la producción de proteínas de
la cápside y la cola.
Después de obtener una cantidad suficiente de proteínas
necesarias para el envasado, se completan los fagos
recombinados, cuyas bacterias se forman, que atacan a
través de la forma natural de infección e ingresan su
muestra de ADN en ellos [11].
Es posible implementar el vector de esta manera poniéndolo
primero en leptosomas, y luego por fusión natural de
leptosomas con la célula o por precipitación de moléculas en el
fosfato de calcio en la superficie de la célula. Los hongos, las
levaduras y las plantas tienen paredes celulares que se
destruyen con enzimas. Se forman protoplastos que pueden
entrar fácilmente en los fragmentos de ADN. El tratamiento de
la celda por electroporación, breves pulsos eléctricos, aumenta
la eficiencia de la transformación. La lixiviación de enzimas que
destruyen la pared celular hace que la pared comience a
reconstruirse y surja el recombinante objetivo.
La microinyección es un método que permite que el
nuevo ADN entre directamente en el núcleo de la célula con
la micropipeta. Esto se aplica a las células animales y
vegetales. La biolística se basa en precipitar la célula con
rodajas de tungsteno u oro asociado con el ADN [11].
Selección de transformantes e
identificación de recombinantes
Después de implementar el vector, las bacterias se cultivan
a una base peculiar, conocida como selectiva. La
composición depende de cuál sea el factor que permita la
diversidad de organismos en los que se ha implantado un
vector. A menudo, este factor es al menos un plásmido de
un gen que codifica una proteína, excluyendo el antibiótico.
Chapado de transformantes para el combustible que
contiene antibióticos en su composición, que es un sensible,
1078 PAGharmetroaCologramoICal Rmipagorts, 2013, 65, 1075??1085
vacunar cepa salvaje. Permite la identificación de células
mutantes porque crecerá a pesar de la presencia
anterior de sustancias nocivas. Antes de plantar, hay un
período de incubación a 37 ° C durante una hora desde
el inicio de la transformación, configurado para crear el
mayor número posible de recombinantes.
Sin embargo, no todos los vectores contienen un gen
clonado. Para comprobar qué células son recombinantes y
tienen un vector ligado con el gen, se utiliza la inactivación
por inserción I. La clonación del nuevo fragmento de ADN
puede tener lugar en el centro del gen presente de forma
natural en el vector, cuando tiene secuencias restrictivas
características. Si el gen de la hendidura ha codificado
proteínas de resistencia a algún antibiótico, las células del
huésped que contengan dicho vector tampoco serán
inmunes a él. Esto sucede en el caso del plásmido pBR322,
que tiene genes de resistencia a tetraciclina y ampicilina.
El gen de la resistencia a la tetraciclina tiene un punto de
restricción BamHI, que luego se corta. Por tanto, los
recombinantes que contienen este vector son insensibles a
la ampicilina, pero sensibles a la tetraciclina. Al principio, las
bacterias se pliegan hasta la base con ampicilina, donde
sobreviven los transformantes. A continuación, se aplica un
método de réplicas: los transformantes se transfieren a la
base con tetraciclina. Los no recombinados solo sobreviven
y conocemos la posición de los recombinantes en la placa
anterior.
Endonucleasa de restricción BamHI muestra un parecido
sorprendente con la estructura de la endonucleasa EcoRI, a
pesar de la falta de similitud de secuencia entre ellos. El sitio
activo deBamHI es estructuralmente similar a los sitios
activos de EcoRI, pero el mecanismo a través del cual Bam
HI activa una molécula de agua para el ataque nucleofílico
puede ser diferente [35].
En el caso del plásmido pUC8, no se utilizan genes de
resistencia al antibiótico, aunque tiene un gen de
resistencia a la ampicilina. Presente en su genoma, el
gen lacZ 'que codifica parte delB-galactosidasa
(descomposición de lactosa y su análogo X-gal), es el
factor que permite determinar la presencia de
recombinantes. La inactivación de inserción de lacZ
'provoca laB-galactosidasa no crea. Las células se
plantan en la base con ampicilina y X-gallim, que se
descomponen por enzima y provocan el crecimiento de
los productos azules. En consecuencia, las bacterias no
recombinadas formarán colonias azules, recombinadas:
blancas. Este método se llama selección de Lac.
Muchos l los fagos y todos los M13 también tienen un gen lacZ '.
Los recombinantes pueden identificarse mediante inactivación por
inserción como se describe anteriormente. es másl los fagos son re

Figura 1. Pasos para la tecnología de ADN
recombinante
estricto en la secuencia genética de cI, y la inserción en este
lugar de un nuevo fragmento de ADN hace que las colonias
que crecen en la placa queden limpias. Por otro lado,
cuando no se produce una recombinación, las colonias
están embarradas.l los vectores se determinan también
como Spi + cuando no pueden infestar la célula que ya
estaba infectada con el fago P2. Cuandol los fagos se
recombinan, estos se convierten en Spi– y están infectando
bacterias de P2. Ahora sólo estas células crecerán en la
placa (Fig. 1) [11].
También es posible probar la iniciativa de la enzima
directamente, de la cual se clonó el gen mismo, si no se
produce de forma natural en la célula o el uso de
anticuerpos contra la proteína [8] (Tabla 1).
Producción de insulina humana
El éxito inicial de la tecnología del ADN recombinante se
basa en gran medida en la elucidación de las propiedades
biológicas a nivel molecular en los sistemas microbianos. La
primera aplicación comercial se realizó en la producción
microbiana de insulina humana. La función principal de la
insulina es controlar la absorción de glucosa del torrente
sanguíneo en las células donde la glucosa se utiliza como
fuente de energía o se convierte en glucógeno para su
almacenamiento. La función de la insulina es regular el nivel
de glucosa en sangre [3, 6, 12, 14].
Tecnología de ADN en el desarrollo de nuevos fármacos.
AgramonorteImiszka Stryjmiwska mit al.
La insulina se produce y se almacena en el B células de los
islotes de Langerhans del páncreas. La insulina se libera del
almacenamiento en el páncreas al torrente sanguíneo [32].
Antes del advenimiento de la biotecnología, la insulina utilizada
para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo I
(insulinodependiente) se obtenía extrayendo la hormona de los
tejidos pancreáticos porcinos o bovinos. A principios de los años
ochenta, la insulina humana producida mediante tecnología
recombinante ingresó al mercado farmacéutico. En uno de los
enfoques, las secuencias para las cadenas A y B se sintetizaron
químicamente y se insertaron por separado aguas abajo delD
-gen estructural de la galactosidasa controlado por el X lac
promotor. La construcción fue tal que las cadenas de insulina se
formarían como proteínas de fusión unidas por una metionina
al final de la proteína P-galactosidasa. El vector de expresión
también contenía un marcador Amp '. A continuación, los
transformantes se cribaron sembrando en placas sobre un
medio de cultivo que contenía X-gal y ampicilina. Los
transformantes de la cadena A y la cadena B de la insulina se
cultivaron para recolectar las células en gran cantidad. Las
células se lisaron y la cadena A y la cadena B de la insulina se
purificaron por separado. Debido a que el gen de la insulina A
se fusionó con elDgen -galactosidasa, por lo tanto, la proteína
de insulina producida fue por lo tanto un D-híbrido
galactosidasa-insulina (Fig. 2) [7, 12, 23].
PAGharmetroaCologramoICal Rmipagorts, 2013, 65, 1075??1085 1079
Pestaña. 1.Ejemplos de medicamentos producidos por tecnología recombinante

Molécula activa Nombre de la droga Enfermedad

Insulina Humalog, NovoRapid, Gensulin para diabéticos

R,
Humulin R, Actrapid HM
Factor VIII Factor VIII de Bayer Factor IX de para hombres que padecen hemofilia A

Factor IX Bayer Genotropin, Humatrop, para hemofilia B

Hormona de crecimiento humano (HGH) Serostin para la deficiencia de la hormona del crecimiento

Eritropoyetina (EPO) Eprex, Epogen para tratar la anemia

Interferón Avonex, Rebif, Betaseron el virus de la hepatitis B

a-L-iduronidasa (rhIDU; Aldurazyme mucopolisacaridosis tipo I (MPS I; deficiencia de

laronidasa) a-L-iduronidasa) para el tratamiento de síntomas no
neurológicos

N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa Naglazyme mucopolisacaridosis VI (MPS VI deficiencia de 4-sulfatasa

(rhASB; galsulfasa) de N-acetilgalactosamina, síndrome de Maroteaux-Lamy)

Factor estimulante de colonias de Neupogen estimular la producción de neutrófilos (p. ej.,

granulocitos (G-CSF) después de la quimioterapia) y para movilizar las células
madre hematopoyéticas de la médula ósea a la sangre

Activador tisular del plasminógeno (TPA) Activase para disolver coágulos de sangre

Adenosina desaminasa (ADA) para el tratamiento de algunas formas de

inmunodeficiencia combinada grave (SCID)

Dornase alfa Pulmozyme para la fibrosis quística

Glucocerebrosidasa Ceredase para la enfermedad de Gaucher tipo 1

Superficie de la hepatitis B Engerix B vacunar contra el virus de la hepatitis B

antígeno (HBsAg)

Inhibidor de C1 (C1INH) utilizado para tratar el angioedema hereditario

Hormona estimulante del folículo (FSH) Pergonal para tratar problemas de fertilidad en mujeres, especialmente mujeres que
son anovulares y oligoovulares

Un método más efectivo, también usando una cepa de MI.
coli, implica la producción de proinsulina completamente
entera, en lugar de fragmentos separados de síntesis de
insulina. La proinsulina consta de las cadenas A y B,
conectadas con la cadena C [16]. El gen que codifica la
proinsulina clonado aE. coli las células también se expresan
allí. La hormona resultante se elimina y luego la cadena C se
elimina proteolíticamente [28, 43].
Insulin Lispro fue el primer análogo de insulina recombinante de
acción rápida en obtener la aprobación de comercialización. Muestra
una secuencia de aminoácidos idéntica a la insulina humana nativa,
con una alteración: una inversión de la secuencia natural de prolina-
lisina que se encuentra en las posiciones 28 y 29 de la cadena B de la
insulina. Esta simple alteración disminuyó significativamente la
propensión de las moléculas de insulina individuales a autoasociarse
cuando se almacenan en concentraciones de dosis terapéuticas. La
dimerización
La constante de Insulina Lispro es 300 veces menor que la mostrada
por la insulina humana sin modificar. Estructuralmente, esto parece
ocurrir como el cambio de secuencia que interrumpe la formación
de interacciones hidrofóbicas entre cadenas críticas para la
autoasociación. Insulin Lispro fue desarrollado por científicos de Eli
Lilly (que, junto con Novo Nordisk, son los mayores productores
mundiales de insulina terapéutica) [22]. La razón fundamental que
subyace a la alteración de la secuencia se basa en estudios, no de la
insulina, sino del factor de crecimiento similar a la insulina-1. Este
último muestra un fuerte parecido estructural con la proinsulina,
con hasta el 50% de los residuos de aminoácidos dentro de los
dominios A y B de IGF-1 que son idénticos a los que se encuentran
en posiciones comparables en las cadenas A y B de la insulina. En
comparación con la insulina, Las moléculas de IGF-1 muestran una
propensión significativamente menor a la autoasociación. Estudios
de secuenciación auricular

1080 PAGharmetroaCologramoICal Rmipagorts, 2013, 65, 1075??1085


Figura 2. Producción de insulina
Iier reveló que la secuencia de ProlineB28-LysineB29
característica de la insulina se invierte en IGF-1. Se sugirió
que, si esta diferencia de secuencia era responsable de las
diferencias en la propensión a la autoasociación, entonces
la inversión de la secuencia de ProlineB28-Lisina-B29 en la
insulina daría como resultado una disminución de la
autoasociación. La experimentación directa demostró que
esta hipótesis era precisa. La insulina Lispro se fabrica
comercialmente de una manera bastante similar a la ruta
de la 'proinsulina' utilizada para fabricar insulina humana
recombinante nativa. Un gen sintético que codifica la
proinsulina LysB28-ProB29 se expresa enE. coli. Después de
la fermentación y recuperación, la proinsulina se trata con
tripsina y carboxipeptidasa B, lo que da como resultado la
escisión proteolítica de la molécula de insulina modificada.
Luego se purifica hasta homogeneidad mediante una serie
de pasos cromatográficos de alta resolución. La formulación
del producto final también contienemetro-cresol
(conservante y estabilizador), óxido de zinc (estabilizador),
glicerol (modificador de la tonicidad) y un tampón a base de
fosfato. El producto comercial tiene una vida útil de 2 años
cuando se almacena entre 2 y 88 ° C [18, 48].
Tecnología de ADN en el desarrollo de nuevos fármacos.
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Producción del medicamento contra la formación de
coágulos de sangre - ACTIVASE®
Activase® es un medicamento producido por Genentech Inc. Este
producto farmacéutico se usa en el tratamiento de la necrosis miocárdica
y la embolia pulmonar y se administra a los pacientes dentro de las tres
horas posteriores a los síntomas del accidente cerebrovascular. Activase®
disuelve los coágulos en los vasos sanguíneos.
Activase® es una alteplasa que es un activador
del plasminógeno tisular (t-PA) y se produce a
escala mundial mediante tecnología de ADN
recombinante. El activador tisular del
plasminógeno es la glicoproteína, que está
compuesta por 527 aminoácidos y pertenece a un
sistema que regula el flujo sanguíneo [39, 41]. El t-
PA es una enzima que activa el plasminógeno
inactivo a su forma catalítica, la plasmina. La
plasmina es responsable de la fibrinólisis, que es
una descomposición de las trombosis [4, 43]. La
producción de métodos biotecnológicos utiliza
ADNc correspondiente al t-PA humano natural
derivado de células de melanoma. Se ha
introducido ADNc en el genoma de las células de
ovario de un hámster chino (CHO, ovario de
hámster chino) y luego se ha llevado a cabo en un
medio de cultivo celular que contiene gentamicina
a una concentración de 100 mg / l. Durante la cría,
la alteplasa se excreta al medio.
Mutagénesis dirigida
Este método permite realizar cambios específicos en la
secuencia de la proteína recombinante, de modo que el péptido
adquiera propiedades nuevas y beneficiosas. Las mutaciones se
implementan con mayor frecuencia en las áreas esenciales para
la función de las proteínas, como el centro activo. Los cambios
pueden afectar incluso a un solo aminoácido [25]. En
consecuencia, la mutagénesis dirigida es parte de la ingeniería
de proteínas [29, 36].
Pueden introducirse mutaciones: inserción, deleción
o sustitución de un aminoácido o del fragmento
significativo completo. Hay muchas variedades de
mutagénesis, pero todas se basan en los mecanismos
fundamentales.
PAGharmetroaCologramoICal Rmipagorts, 2013, 65, 1075??1085 1081
 Mutagénesis usando oligonucleótidos
Este método se utiliza para obtener una mutación puntual.
En el vector se introduce un gen interesante en forma de
oligonucleótido monocatenario: el fago M13 monocatenario
[2]. El gen se clona, luego se purifica y se secuencia [11]. Se
crea un oligonucleótido complementario al original, pero
que contiene una mutación determinada. Éste se introduce
de nuevo en el fago M13. El fragmento de ADN no es
perfectamente complementario al ADN del vector. La
polimerasa se basa en una cadena complementaria. La
cadena crea una doble hélice y contiene el gen clonado, que
es un cebador para la enzima en esa etapa. Los fagos se
introducen en las bacterias y se produce su replicación [21].
La mitad de las partículas resultantes corresponden al ADN
original y la otra mitad contiene las mutaciones. Tras la
liberación de fagos de la célula, además, el 50% de ellos
también tiene una molécula monocatenaria mutada. Luego,
los fagos se siembran en una placa con bacterias para
producir placas y los oligonucleótidos originales se utilizan
como sonda para la hibridación con el gen mutante. El gen
ahora se puede transferir a la bacteria vector para producir
una proteína modificada [8, 20, 22, 47].
Síntesis del gen artificial
Si el gen codifica una proteína con una secuencia corta y
conocida, podemos crearla fácilmente de forma artificial.
Entonces es posible introducir muchos cambios dentro de la
secuencia, además de la mutación puntual, como en la
descripción anterior. Este gen se forma en un tubo y la
mutación se puede realizar en cualquier lugar. Al principio,
están apareciendo oligonucleótidos superpuestos para
longitudes de 150 bases. Las secuencias formarán un gen
debidamente modificado. A continuación, se pliegan y los
huecos se rellenan con ADN polimerasa. La ligasa crea los
enlaces fosfodiéster que faltan, formando una hélice completa
de doble hebra. Si los extremos de las secuencias de la cadena
son restrictivos, después de dividir la enzima correspondiente,
se obtienen extremos pegajosos después de que se divide y se
introduce el fragmento del vector [11, 32].
Reacción en cadena de la polimerasa
Otro método, muy rápido y fácil de realizar es la PCR
(Fig. 3). Como en el caso de la mutagénesis para el uso
de oligonucleótidos [17], la PCR sólo puede producir una
1082 PAGharmetroaCologramoICal Rmipagorts, 2013, 65, 1075??1085
cambio en la secuencia. Se llevan a cabo dos reacciones en
cada uno de los dos tipos de cebadores; uno es
perfectamente complementario a la plantilla, y el principio
del segundo es incomparable, por lo que es una mutación
específica. Estas partículas se mezclan y se someten a otra
reacción de PCR, en la que las secuencias complementarias
se combinan y extienden mediante polimerasa. Sin
embargo, la desventaja de este método es que la
polimerasa Taq comete errores y pueden aparecer nuevas
mutaciones no planificadas. Por tanto, los productos de la
PCR deben secuenciarse para determinar qué moléculas
llevan el cambio correcto [11]. Dicho de manera más simple,
hay tres pasos principales en la PCR, que se repiten durante
30 o 40 ciclos. Esto se realiza en un ciclador automático, que
puede calentar y enfriar los tubos con la mezcla de reacción
en muy poco tiempo.
1. Desnaturalización a 94°C
Durante la desnaturalización, la doble hebra se funde abiertamente
en ADN monocatenario y todas las reacciones enzimáticas se
detienen (por ejemplo: la extensión de un ciclo anterior).
2. Recocido a los 54°C
Los cebadores se mueven debido a los movimientos
brownianos. Los enlaces iónicos se forman y rompen
constantemente entre el cebador monocatenario y la
plantilla monocatenaria. Los enlaces más estables duran
un poco más (cebadores que se ajustan exactamente) y
en ese pequeño trozo de ADN de doble hebra (plantilla y
cebador), la polimerasa puede unirse y comienza a
copiar la plantilla. Una vez que hay algunas bases
incorporadas, el enlace iónico es tan fuerte entre la
plantilla y la imprimación, que ya no se rompe.
3. Prórroga a los 72°C
Esta es la temperatura de trabajo ideal para la polimerasa.
Los cebadores, donde hay algunas bases integradas, ya
tienen una atracción iónica más fuerte hacia la plantilla que
las fuerzas que rompen estas atracciones. Los cebadores
que están en posiciones sin coincidencia exacta, se aflojan
nuevamente (debido a la temperatura más alta) y no
proporcionan una extensión del fragmento. Las bases
(complementarias a la plantilla) se acoplan al cebador en el
lado 3 '(la polimerasa agrega dNTP's de 5' a 3 ', leyendo la
plantilla desde el lado 3' a 5 ', se agregan bases
complementarias a la plantilla) ( Figura 4).

Fig. 3. PCR
Figura 4. Pasos en PCR
Producción de la hormona somatostatina
humana.
La somatostatina inhibe la secreción de somatotropina
(hormona del crecimiento) por la glándula pituitaria, así como
algunas otras hormonas como la insulina y el glucagón. Se usa
para tratar la acromegalia (producción excesiva de
somatotropina) y sus análogos se usan como medicamentos
contra el cáncer. Consta de 14 aminoácidos.
Para la producción de somatostatina, se utilizó un
método de fusión de genes, que produjo un ARNm
de fusión. La clonación se realiza con el uso de
plásmidos que tienen el promotor lac y, como tal, el
gen de la somatostatina experimentará la expresión
junto conB-galactosidasa. Dado que el aminoácido se-
Tecnología de ADN en el desarrollo de nuevos fármacos.
AgramonorteImiszka Stryjmiwska mit al.
La secuencia de la proteína es corta y bien conocida,
crea oligonucleótidos artificiales [42].
Sin embargo, ha realizado algunos cambios para facilitar
la clonación:
1. Para el codón de cisteína C-terminal, dos
Se incluyeron codones de parada. Esto asegura que la
traducción terminará después del gen de la somatostatina.
2. Antes de la metionina N-terminal existía
codón de alanina añadido, que separará el fragmento B
-galactosidasa de la proteína deseada y permite su
separación mediante el tratamiento del CNBr.
3. Los extremos del fragmento de restricción incluían se-
secuencias de EcoRI y BamHI, que crean puntas pegajosas.
Por tanto, el oligonucleótido preparado se
introduce en el vector y se lleva a la transfección de
PAGharmetroaCologramoICal Rmipagorts, 2013, 65, 1075??1085 1083

E. coli. Después de la incubación, la proteína de fusión
del Fondo Europeo de Desarrollo Regional.
recombinante se selecciona y se purifica. CNBr lo diseca y
produce somatostatina [26, 27, 37].
Producción de ARANESP™ (DARBEPOETIN ALFA)
Darbepoetin alfa es una forma sintética de eritropoyetina.
Estimula la eritropoyesis (aumenta los niveles de glóbulos
rojos) y se usa para tratar la anemia, comúnmente asociada
con insuficiencia renal crónica y quimioterapia contra el
cáncer. Amgen comercializa la darbepoyetina con el
nombre comercial Aranesp.
Aranesp (darbepoetin alfa) es una proteína estimulante de la
eritropoyesis que se produce en las células CHO mediante
tecnología de ADN recombinante. Aranesp es una proteína de 165
aminoácidos que se diferencia de la eritropoyetina humana
recombinante en que contiene 5 cadenas de oligosacáridos unidas a
N, mientras que la eritropoyetina humana recombinante contiene 3
cadenas. Los 2 adicionalesnorteLos sitios de glicosilación son el
resultado de sustituciones de aminoácidos en la estructura del
péptido de eritropoyetina. El peso molecular aproximado de
darbepoetin alfa es 37.000 D. El producto terminado se administra
por vía intravenosa o subcutánea [25].
Conclusión
Los procesos presentados dominan en los métodos de
producción biotecnológica, la terapéutica y la tecnología del
ADN recombinante como herramienta básica para la mayoría
de ellos, permitiendo su constante desarrollo y mejora.
Mediante la genómica, el estudio de los genomas de los
organismos y la proteómica, además del estudio de las
proteínas que normalmente se sintetizan en la célula, se
obtiene una gran cantidad de información que sirve de base
para el diseño de nuevos biofarmacéuticos [13, 38, 43, 48]. Los
fármacos producidos por biotecnología asumen una
participación cada vez mayor entre los terapéuticos. La mayoría
de los biofármacos se producen utilizandoE. coli, S. cerevisiae y
células animales (como CHO).
La biotecnología es, pues, un campo en rápida expansión,
que muestra la posibilidad de un tratamiento eficaz de
enfermedades que hoy pueden parecer incurables.
Reconocimiento:
Este trabajo fue apoyado por el proyecto “Biotransformación para la
industria farmacéutica y cosmética” subvención No. POIG.01.03.01-
1084 PAGharmetroaCologramoICal Rmipagorts, 2013, 65, 1075??1085
00-158 / 09-00, financiado en parte por la Unión Europea dentro
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