TECNICAS Y METODOS DE AISLAMIENTO Y

SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS
TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y ESTUDIO DE
BACTERIAS
INTRODUCCIÓN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que
permiten cultivarlos bajocondicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo
condiciones experimentales y manejar un solo tipo demicroorganismo. Una de las técnicas
más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir unamuestra
microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener
cultivosmicrobianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área
de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar
precauciones para impedir que éstos penetren ycontaminen los cultivos en estudio. Por otra
parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también lascondiciones
ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH
yconcentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura,
aireación, la luminosidad. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los
microorganismos en cultivos mixtos, así comosu aislamiento y la obtención de cultivos puros,
facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La
forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósitoespecífico
del estudio.
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en
medios de cultivo ycondiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos
desarrollada en un medio se denominacultivo. Cuando éste contiene una sola especie de
microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuandocontiene más de una especie de
microorganismos se denomina cultivo mixto.
.Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el
laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.Un cultivo axénico consiste en una sola
especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicosson muy raros en la
naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-
existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma
conjunta.

Un cultivoaxénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo

axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas
partes, en la naturaleza, en el laboratorio yen los instrumentos y recipientes usados en los
experimentos. Estos microorganismos no deseados ocontaminantes deben ser eliminados de
un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso paraobtener un cultivo axénico
es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido,
esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se
podrámultiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población de
células descendientes de unsolo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente
grande como para ser visible sobre la superficiede un medio sólido.Un cultivo microbiano que
ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferidoa un
medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar.
En estatransferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir
microorganismos indeseables(contaminantes) y concentración o carga microbiana de la
muestra (inóculo) a sembrar.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:

Los utensilios utilizados para la transferencia de muestras son los siguientes:

Hisopo, pipeta (para uso microbiológico sonterminales y la parte superior o boquilla debe
estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre
de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.
En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos,
pipetas o pipetaspasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos
dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por
ejemplo:
Los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón
o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa
microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o
medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular
que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que
presenta este tipo de cultivo se refiere a laposibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de
microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se
encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar
laconcentración del inóculo. La desventaja que presentan, es que en ellos e difícil detectar
contaminación a simple vista.
Los medios semisólidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o
pipeta pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en
estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se
homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los
microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes
requerimientos de oxígeno.
Los medios sólidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las
necesidades, despuésde esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra
se realiza con el asa, inoculando lasuperficie del agar con mucha suavidad; en estos medios,
los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a
estos agregados se les denominan colonias, las que presentancaracterísticas que varían con
el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de
cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría de
losmicroorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido,
por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo
de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se
deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismoen estudio. El
crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de
las veces están relacionadas con la de su hábitat natural. Algunos microorganismos crecen
por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta
80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora
microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo
microorganismos que presentan su crecimientoóptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se
pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperaturaambiente. En general las
incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de
temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos
aparatos funcionan con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo.
Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora
no debe prolongare por más de nueve días.
Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de
oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se llaman aerobios obligados;
los que sólo crecen en ausencia de oxígeno sedenominan anaerobios obligados o estrictos,
un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conocecomo facultativos. Existe una
cuarta categoría que comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo loutilizan cuando
éste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos.

El desarrollo de estos diferentes grupos se favorece mediante la agitación de los cultivos o

mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos
especiales.Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente
distribuidas en la naturaleza, habitan enel agua, el suelo, en la superficie o en el interior de
plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros
organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas.Fisiológicamente este grupo
presenta características muy variables, hay bacterias móviles e inmóvilesfotosintéticas y
quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de
temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los
criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma de
agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de
inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos en los que
presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las
colonias.
Técnicas de siembra
Método de siembra por estría en placa
 Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa
de siembra se tomauna muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre
la superficie de un medio sólidopreparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les
denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada
vez se van depositando en la superficie del medio menosmicroorganismos. A continuación,
se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimasestrías y se continúa
la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo
esteproceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se
incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número
suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente
representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células
quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para
asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a
partir deuna colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la
segunda vez, serán, casi con todaseguridad, cultivos axénicos.
Métodos de vertido en placa y extensión en placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en

placa. Se siguenestas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la
dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones
de células por mililitro debe ser diluida 10

veces paraobtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se
realizan diluciones seriadas (envarias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de
cien en cien.
Para realizar diluciones de diez endiez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (de
medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las
células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, sepuede proceder
de dos maneras diferentes.
En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se
vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la
superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes.
En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembrandirectamente
en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal
estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la
superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como
en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen
en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del
vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de
siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número
decolonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de
seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. Para
obtener un cultivo axénico mediante este método:
 (a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con
sólo unos pocoscientos de bacterias-
(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una
placa Petri.
(c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su
superficie (más grandes).
Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico:

(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.

(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra.
(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y
(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo
grupo de estrías enuna región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta
vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas.
(e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el
cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por
estrías una segunda placa.

3.2.4 El crecimiento de los cultivos axénicos

Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de
nuevo). Seguramente, el investigador deseará obtener más células para poder trabajar con
ellas. Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo,
líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos
se hacen generalmente, añadiendo agar a los líquidos (
LA IMPORTANCIA DE SER CULTIVO PURO
Todos los microbiólogos saben que han de trabajar con cultivos axénicos (puros) para que sus
experimentos sean significativos. Pero incluso los microbiólogos más experimentados han
cometido errores alguna vez. Esto le sucedió a Ralph Wolfe, uno de los microbiólogos
americanos más distinguidos.
En 1960 Wolfe obtuvo un cultivo puro de la bacteria Methanobacillus omelianskii. Este
microorganismo es anaerobio estricto, capaz de producir metano (gas natural). Wolfe quería
conocer de qué manera M. omelianskií producía gas metano a partir de etanol y anhídrido
carbónico. El procedimiento estaba claro; tenía que lisar la bacteria y aislar las enzimas que
catalizan la reacción, en un tubo de ensayo. Esto, aunque suena bastante simple, había sido
intentado previamente por otros investigadores y todos habían fracasado. Wolfe lo intentó
durante todo un año y tampoco tuvo éxito. De repente lo consiguió: una solución de enzima.
sintetizaba metano en un tubo de ensayo! Se trataba de un descubrimiento espectacular,
hasta que un colega se preguntó si el cultivo era axénico.
Wolfe decidió volver a aislar el culfivo, pero en vez de añadir etanol yanhídrido carbónico al
mismo, añadió hidrógeno y anhídrido carbónico. En el nuevo medio se desarrollaron colonias,
pero cuando se transfirieron al medio con etanol y anhídrido carbónico no crecieron.
¿Qué había sucedido? Un colega, M.J. Wolin, se dio cuenta de lo que estaba
sucediendo. Aunque M. omelianskii originaba colonias uniformes y aisladas en el medio
original, se trataba de una mezcla de dos bacterias. Una, designada cepa S, convertía el etanol
en hidrógeno gas. La otra, designada cepa M, convertía el hidrógeno gas y el anhídrido
carbónico en metano. Ninguna de las dos podía crecer sola con etanol y anhídrido carbónico.
Todos los experimentos de Wolfe se habían realizado con un cultivo mixto y tuvieron que
repetirse para averiguar qué enzimas pertenecían a la cepa S y cuáles a la cepa M.
¿Qué lección puede aprenderse de la historia de Wolfe? Primero, que los problemas técnicos
(tales como obtener un cultivo axénico), aunque son tan básicos que se explican en los textos
introductorios, son reales e importunan a los más prestigiosos investigadores. Segundo, que
incluso un buen microbiólogo puede equivocarse. Algunas especies pueden crecer juntas
(para formar un consorcio) y parecer un cultivo axénico cuando realmente no lo son.