METODO DE CUANTIFICACION DE PROTEINAS POR EL MÉTODO DE

BRADFORD Y EL METODO DE LOWRY

Resumen.

Las proteínas son macromoléculas formadas por residuos de aminoácidos. En este laboratorio , vamos a
determinar la concentración de las proteínas , por el método de bradford y el método de lowry, haciendo
curvas de calibración y determinando su concentracion.

Introducción.

Método de Bradford.

La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la cuantificación de la unión de un

colorante, el Azul de Coomassie , a la proteína, comparando esta unión con la de diferentes cantidades de
una proteína estándar (Albúmina de Suero Bovino (BSA)). La cuantificación se hace midiendo la absorbancia
en un espectrofotómetro, a 595 nm, y graficando la absorbancia vs la concentración de proteínas, obteniendo
una curva de calibración de la proteína estándar. Con esta curva de calibración, se puede interpolar la
concentración de proteínas en una muestra al medir su absorbancia a 595 nm.

Método de Lowry:

Este método consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de
nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además,
provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos
fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución
alcalina en forma de su complejo contartrato.

2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los
residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El
principal constituyente del reactivo de FolinCiocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que
al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.Al producirse dicha
reacción hay un cambio en el color de la muestra que puede ser cuantificado determinando la absorbancia a
660 nm.( Maugeri.Iribarren.2017)

El espectrofotómetro, es uno de los principales instrumentos diagnósticos y de investigación. Utiliza las

propiedades de la luz y su interacción con las sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas.
Determinar la concentración de proteínas en una muestra es una técnica de rutina básica cuando se
aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad
específica de una preparación enzimática.
Metodología.

Método le Bradfrord

-Curva patrón de BSA y gelatina.

1. Para obtener la curva patrón, el tubo 1 contendrá el blanco, del tubo 2 al 6 adicionar los siguientes
volúmenes: 0.1ml, 0.2ml, 0.4ml, 0.8ml y 1.0ml de solución de albumina sérica bovina (BSA),
respectivamente.
2. Finalmente, realizar la cuantificación de la solución por medio de un espectrofotómetro a 595 nm
para el reactivo de Bradford, entre cada medición lavar las celdas; al tener todas las mediciones
realizar la curva de calibración.

Método de Lowry

1. Pesar 5 mg de muestra o tomar una membrana con biomasa

2. Agregar 3 mL de TCA al 24% a cada tuvo y realizar vortex
3. Calentar las muestras con TCA en bloque calentador 95°C/15min
4. Enfriar a temperatura ambiente
5. Diluir el TCA hasta 6% agregando 9 mL de agua ultra pura (o desionizada) a cada muestra
6. Centrifugar a 4500 rpm por 15 min (Realizar este paso dos veces, dejando descansar la centrifuga
entre corridas. Tener cuidado, emite calor). O centrifugar a 15,000 g / 20 min a 4°C.
7. Descartar sobre nadante
8. Re suspender el pellet en 0,5mL de reactivo de Lowry D (Pipeteo repetido o vortex)
9. Dejar el pellet en reactivo Lowry D a 55°C / 60 min
10. Centrifugar a 4500 rpm por 30 min
11. Desechar el sedimento y retener el sobrenadante, Luego se procede con el ensayo Lowry
12. Tomar 175µL del sobrenadante ó estándar a cada tubo
13. Agregar 3.325 µL de Lowry D y realizar inversión inmediata
14. Las muestras se incubaron a 10 min a Temperatura ambiente
15. Agregar 0,35 µLd el reactivo folin ciocalteu diluido a cada tubo y realizar vortex inmediato
16. Dejar 30 min a temperatura ambiente
17. Leer absorbancia a 600 nm.

Resultados y Discucion
Método de bradford

Solución salina.

0,1 0,289 X=[(0,289-0,275)/0,390]=0,035 mg

0,2 0,354 X=[(0,354-0,275)/0,390]=0,202 mg
0,4 0,482 X=[(0,482-0,275)/0,390]=0,530 mg
0,6 0,500 X=[(0,500-0,275)/0,390]=0,576 mg
0,8 0,574 X=[(0,574-0,275)/0,390]=0,766 mg

Solución salina
0,7
y = 0,3906x + 0,2757
0,6
R² = 0,9351
Título del eje

0,5
0,4 Solución salina
0,3
0,2
Lineal (Solución
0,1 salina)
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Título del eje

Buffer de Fosfato

0,1 0,311 X=[(0,311-0,350)/0,440]=0,088 mg

0,2 0,492 X=[(0,492-0,350)/0,440]=0,322 mg
0,4 0,586 X=[(0,586-0,350)/0,440]=0,536 mg
0,6 0,631 X=[(0,631-0,350)/0,440]=0,638 mg
0,8 0,659 X=[(0,659-0,350)/0,440]=0,702 mg
 Buffer de Fosfato
0,8
0,7 y = 0,4406x + 0,3507
0,6 R² = 0,8039
0,5 Buffer de Fosfato
0,4
0,3 Lineal (Buffer de
0,2 Fosfato)
0,1
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Método de Lowry

Solución salina.

0,1 0,007 X=[(0,007+0,012)/0,24]=0,079 mg

0,2 0,037 X=[(0,037+0,012)/0,24]=0,204 mg
0,4 0,076 X=[(0,076+0,012)/0,24]=0,366 mg
0,6 0,159 X=[(0,159+0,012)/0,24]=0,712 mg
0,8 0,165 X=[(0,165+0,012)/0,24]=0,737 mg
 Solución salina
0,2
y = 0,2421x - 0,0129
R² = 0,9486
0,15
Solución salina
0,1
Lineal (Solución
0,05 salina)

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Buffer de Fosfato

0,1 0,033 X=[(0,033-0,023)/0,092]=0,108 mg

0,2 0,029 X=[(0,029-0,023)/0,092]=0,065 mg
0,4 0,080 X=[(0,080-0,023)/0,092]=0,619 mg
0,6 0,078 X=[(0,078-0,023)/0,092]=0,597 mg
0,8 0,092 X=[(0,092-0,023)/0,092]=0,75 mg

Buffer de Fosfato
0,12
y = 0,0929x + 0,0234
R² = 0,8297
0,1

0,08
Buffer de Fosfato
0,06
Lineal (Buffer de
0,04 Fosfato)

0,02

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Al realizar los dos método se obtuvieron 4 curvas de calibrado diferentes, de las cuales todas están en un
rango aceptable debido a sus correlaciones las cuales son bastante cercanas a 1 (variando en una rango de
[0,803-0,948]), dentro de estas existen algunas más cercanas que otras, pero en general, se puede decir que
los métodos son eficaces.

El método de Bradford tiene muchas ventajas, incluyen una alta estabilidad, sensibilidad y una respuesta
altamente lineal, encontrando valores de coeficientes de determinación de 0,994, similares a los reportados en
este trabajo.

En ambos métodos se denota una clara relación proporcional entre la absorbancia de la muestra y la
concentración proteica de la misma, además de haber una mayor sensibilidad por parte del método de
Lowry, sin embargo se observó que la relación absorbancia-concentración también depende de la
reactividad de la proteína ante los reactivos utilizado. (Carrizosa.Chavira.Hernandes.Torres.201677

Conclusiones.

Por medio del método de lowry y Bradfrord determinamos la presencia de las proteínas y analizamos la
absorbancia a cada uno de los tubos y mediante los cálculos determinamos la concentración de la muestra.

La espectrofotometría ofrece una estimación bastante aceptable en la realización de curvas de calibración

y la consecuente determinación de la concentración proteica de una muestra.

Bibliografia.

Kit para determinación de proteínas, Método de Bradford. Recuperado de http://winklerltda.cl/quimicav2/wp-

content/uploads/2017/04/kit-proteinas-bradfor.pdf

Maugeri,D.Iribarren,P.2017.Determinación de proteinas.Recuperado de
http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/QuimicaBiol/1489768358.pdf

Carrizosa,M.Chavira,T.Hernandes,B.Torres,S.2016.Revisión de métodos espectroscopicos y elaboración de

curva estándar de proteína.Recuperado de https://www.studocu.com/es/document/universidad-nacional-
autonoma-de-mexico/bioquimica-experimental/practica/practica-metodos-espectroscopicos-y-curva-estandar-
de-proteina/572206/view