NOTA: 3.

VARIABLES QUE AFECTAN EL COMPORTAMIENTO DE UNA ENZIMA

Juan Esteban Cardozo Rivera, Anderson Patiño y Kevin Valencia

Estudiantes de tecnología biomédica

Laboratorio de bioquímica. Universidad de Antioquia, Seccional Oriente

Enviado: Agosto 26 de 2019

1. INTRODUCCIÓN

A medida que las especies vegetales envejecen, se hace evidente uno de los procesos naturales
más importantes, como lo es el pardeamiento causado por la enzima polifeniloxidasa (PPO).
La posibilidad de controlar el pardeamiento de los vegetales tendrá importancia en el control
de la maduración, almacenamiento, transporte y en la calidad final de los productos naturales
exportables con un apreciable valor agregado. La enzima tirosinasa, resulta ser útil y práctica
para los estudios del pardeamiento y madurez debido a las PPOs. La tirosinasa se encuentra en
los tejidos vegetales, principalmente en las mitocondrias y cloroplastos de las células, también
se encuentra en las vacuolas como parte soluble. Esta enzima es la responsable del
pardeamiento enzimático, la cual es una reacción de oxidación en la cual actúa como sustrato
el oxígeno molecular.

La actividad de una enzima determina la capacidad de dicha enzima para provocar una reacción
química determinada, y se expresa en moles o unidades de actividad enzimática. La velocidad
de la reacción catalizada enzimáticamente es directamente proporcional a la concentración del
sustrato que interactúa en la reacción, por lo tanto, la velocidad de una reacción puede ser
medida, mediante la disminución de concentración de sustrato en un determinado tiempo, o el
aumento de la concentración del producto, midiendo dichas concentraciones por el método
espectrofotométrico.
Esta práctica se realizó con el objetivo de extraer la enzima tirosinasa de diferentes fuentes
vegetales, determinar la actividad de la tirosinasa, usando como sustrato L-Dopa, comparar la
actividad de la enzima a diferentes concentraciones con y sin calentamiento.

Recuerden que deben plantear los objetivos alcanzados durante la practica, no los objetivos
descritos en la guia de laboratorio

Objetivos alcanzados: 7/10

 2. MATERIALES Y MÉTODOS

Para la extracción de la enzima se tomaron 10 gramos de banano con 10mL de buffer fosfato
y 3g de silica gel se trituró y centrifugó a 1500rpm por 5 minutos Finalizado este proceso se
preparó una dilución de 50mL empleando el buffer usado inicialmente y el sobrenadante,
tomando esta solución como extracto diluido 10 veces.
Para la medida de la actividad enzimática en condiciones normales, se calibró el
espectrofotómetro en absorbancia igual a cero (λ = 420 nm) utilizando el blanco
correspondiente para el extracto de banano. El blanco fue elaborado con 1mL del extracto
enzimático, 4mL de solución buffer pH 6.0 y 1mL de agua destilada o solución salina. Después
de calibrado el equipo, se preparó la mezcla de reacción adicionando 1mL del extracto
enzimático, 4mL de solución buffer pH 6.0 y 1mL de solución de L-metildopa. Inmediatamente
agregado este último compuesto, se registraron las medidas de la absorbancia, una cada 30
segundos. Se preparan otras tres mezclas variando el extracto enzimático de la siguiente
manera: 1.5, 2 y 2.5 mL respectivamente y variando la cantidad de buffer pH 6.0 de la siguiente
manera: 3.5, 3 y 2.5 mL respectivamente, a cada tubo se le adiciono 1mL de solución de L-
metildopa. Inmediatamente agregado este último compuesto, se registraron las medidas de la
absorbancia cada 30 segundos.
Luego de la toma de los datos anteriores se preparó una mezcla para ser sometida a agua
hirviendo durante 5 minutos para observar como variaba la actividad enzimática por el aumento
de la temperatura, esta mezcla era:

● 2 mL de extracto de enzima.
● 3 mL de solución de buffer pH = 6.
Luego de que el tubo se enfriara se le agrego 1mL de solución de L-metildopa Inmediatamente
después de agregar el L-metildopa se agitaba y se medía la absorbancia cada 30 segundos.
Imagen 1. Flujogramas. 10/10

3. RESULTADOS 10/20

Tabla 1. Lecturas de la absorbancia para el extracto enzimático de banano

Tiempo(min)/Tub 0 1 2 3
o
ABSORBANCIAS
0.5 0.239 0.32 0.277 0.336
1 0.262 0.363 0.328 0.337
1.5 0.287 0.412 0.382 0.457
2 0.311 0.455 0.432 0.514
2.5 0.332 0.495 0.478 0.567
 3 0.353 0.533 0.524 0.617
3.5 0.372 0.566 0.563 0.660
4 0.39 0.6 0.6 0.698
4.5 0.407 0.627 0.632 0.711
5 0.423 0.649 0.649 0.717
m (pendiente) 0,0411 0,0742 0,0849 0,0938
Actividad enzimática 0,4110 0,4947 0,4245 0,3752

ABSORBANCIA v/s TIEMPO ABSORBANCIA v/s TIEMPO

TUBO 1 TUBO 2
0,5 1
Absorbancia

0,4 y = 0,0411x + 0,2246

y = 0,0742x + 0,298

Absorbancia
0,3 0,5
0,2
0,1 0
0 0 2 4 6
0 2 4 6
Tiempo
Tiempo
Figura 1. Absorbancia en el tubo 1 Figura 2. Absorbancia en el tubo 2

ABSORBANCIA v/s TIEMPO ABSORBANCIA v/s TIEMPO

TUBO 3 TUBO 4
0,8 1
y = 0,0938x + 0,3034
Absorbancia

Absorbancia

0,6 y = 0,0849x + 0,253

0,4 0,5
0,2
0 0
0 2 4 6 0 2 4 6
Tiempo
Tiempo

Figura 3. Absorbancia en el tubo 3 Figura 4. Absorbancia en el tubo 4

1. Actividad enzimática

0.0411∗10
Tubo 1 = = 0.4110
1
0,0742∗10
Tubo 2 = = 0.4947
1.5
0,0849𝑥 ∗10
Tubo 3 = = 0.4245
2
0,0938∗10
Tubo 4 = = 0.3752
2.5
2. Actividad enzimática en los tubos 1-4

La mayor actividad enzimática se obtuvo donde la concentración de enzima era de 1,5mL,

mientras que en la mayor concentración (2.5mL) se obtuvo la menor actividad enzimática, ya
que la actividad enzimática depende claramente de las concentraciones de sustrato, sin
embargo, lo hace hasta cierto punto. En el caso del tubo 2 obtuvimos la mayor actividad
enzimática porque las concentraciones de sustrato no superaron el límite que conduce a un
estado de saturación de la reacción, en cambio en el tubo 4 se obtuvo la menor actividad
enzimática porque la reacción llego a un estado de saturación, en donde se alcanza la velocidad
máxima de la reacción, por más concentración que haya de sustrato, la actividad enzimática no
se alterara debido a que el proceso se encuentra en un tope, en el que la velocidad solo pudiera
incrementar si se aumenta la cantidad de enzimas.

3. Actividad enzimática al someterse a calentamiento

Tabla 2. Lecturas de absorbancia después de someterse a un calentamiento

Tiempo(min) Absorbancia
0.5 0.269
1 0.271
1.5 0.270
2 0.270
2.5 0.270
3 0.270
3.5 0.270
4 0.270
4.5 0.271
5 0.271
 ABSORBANCIA VS TIEMPO CON
CALENTAMIENTO
0,2715 y = 0,0002x + 0,2696
0,271

ABSORBANCIA
0,2705
0,27
0,2695
0,269
0,2685
0 1 2 3 4 5 6
TIEMPO

Figura 5. Absorbancia al someterse a calentamiento

La actividad enzimática a someterse en calentamiento fue:

M = 0.0002

0.0002
Actividad enzimática = = 0.0001
2𝑚𝐿

La actividad enzimática del tubo con calentamiento se puede aproximar a 0; es decir, la

actividad es casi nula, esto debido a que la elevación de la temperatura incrementa la velocidad
de la reacción, al principio la velocidad de reacción aumenta cuando la temperatura se eleva
debido al incremento de la energía cinética de la energía de las moléculas reactantes; Sin
embargo, al final, la energía cinética de la enzima excede a la barrera energética para romper
los enlaces débiles de hidrógeno que conservan su estructura secundaria o terciaria.

Donde esta el analisis de los resultados?

Preguntas Analisis de resultados 17/35

1. Cuando se trabaja con manzana no es recomendable diluir el extracto ¿Por qué?

No es recomendable diluir el extracto debido a la gran cantidad de agua presente en la manzana,
correspondiente a un 89% por lo que se podía extraer fácilmente mayor cantidad sin necesidad
de diluirlo con sustancias externas a la enzima.
2. ¿Cuál es la función de la tirosina en los animales superiores?
En los mamíferos es el responsable de la producción de melanina; esta es la encargada de
determinar el color de la piel, y también se encuentra en el pelo, el iris del ojo, el oído interno
y el cerebro. En los cefalópodos produce el pigmento de la tinta, y en el artrópodo participa en
el endurecimiento de las cutículas del caparazón, al formar quinonas que reaccionan con las
proteínas, insolubilizándolas.

3. De acuerdo con los resultados obtenidos en la práctica, ¿Cuál es la interpretación y

explicación que se le da a la fruta o frutas que tienen una mayor concentración de
tirosinasa?

La concentración de la tirosinasa determina la velocidad con la que se produce el pardeamiento

enzimático en las frutas y algunos vegetales, a mayor concentración se presentará con mayor
facilidad el color café oscuro que es conferido gracias a la melanina, el cual indica la oxidación
de la enzima.

4. ¿Qué se podrá recomendar (y que no se podrá recomendar), para evitar el

pardeamiento de las frutas y las verduras cortadas?
● Empacar al vacío: Este método funciona muy bien pues elimina el principal
protagonista del proceso: el oxígeno.
● Congelar: La disminución brusca de la temperatura inhibe la acción de la enzima
Polifenol oxidasa, que acelera el oscurecimiento, pero al descongelar la fruta pierde
muchas de sus propiedades organolépticas.
● Ácido cítrico: El ácido inhibe de inmediato a la enzima y la oxidación es tan lenta que
parece que no sucediera.
● Mecanismo de barrera: Bañar las frutas con miel o yogurt, ambos líquidos impiden el
contacto del oxígeno con los fenoles de la fruta.
No se recomienda dejar los alimentos expuestos al aire.
 4. CONCLUSIONES 15/25
● Se puede concluir que la actividad de la tirosinasa se ve disminuida por el aumento
de la temperatura. La disminución en la actividad debida al calentamiento se debe
a la poca resistencia estructural de la tirosinasa a la temperatura, por lo que al
someterla a calentamiento esta empieza a desnaturalizarse perdiendo su capacidad
de mediar la conversión de tirosina a dopacromo.

● En el tubo dos se da la mayor actividad enzimática, ya que el sustrato presenta una

mayor afinidad con la enzima, por lo que el sustrato se logra unir más fácilmente al
sitio activo donde se da la acción catalítica, provocando una disminución de la
energía de activación, lo que permite que la reacción transcurra a una mayor
velocidad.

5. REFERENCIAS

Casañola-Martín, G., Marrero-Ponce, Y., Le-Thi-Thu, H., Hassan Khan, M., Torres, F., Rescigno, A.
and Abad, C. (2013). La enzima tirosinasa: 2. Inhibidores de origen natural y sintético. [online]
Recuperado de: https://www.raco.cat/index.php/afinidad/article/download/273744/361894.

Dos Santos, V., Mendonça, C., dos Santos, R., Mihos,, F., Torres, A., Pereira, K. and Salgado, A.
(n.d.). INMOVILIZACIÓN DEL EXTRACTO ENZIMÁTICO DE LA TIROSINASA DE AGARICUS
BISPORUS EM MEMBRANA DE NYLON Y ESFERAS DE QUITOSANA. [online] Aaiq.org.ar.
Recuperado de: http://www.aaiq.org.ar/SCongresos/docs/06_029/papers/04a/04a_1828_340.pdf

ref: Ortiz, J. (13 de Noviembre de 2016). Determinación de actividad enzimática de la

tirosinasa. Recuperado de Scribd: https://es.scribd.com/document/330957513/Determinacio-
n-de-actividad-enzima-tica-de-la-tirosinasa.