PRÁCTICA No.

9B
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS
IgM E IgG PARA EL
DIAGNOSTICO DE COVID-19
Clasificación

Mamíferos Aves Delta

Aves y
Coronavirus cerdos

Human coronavirus 229E (HCoV-229E) Human coronavirus OC43 (HCoV-OC43)

Human coronavirus NL63 (HCoV-NL63) Human coronavirus HKU1 (HCoV-HKU1) Resfriado común
Human severe acute respiratory syndrome
coronavirus (SARS-CoV)

SARS-CoV-2 COVID-19
Estructura del virus

Casi esférico – moderado grado de

pleomorfismo

Las partículas virales tiene en

promedio de 80 - 120 nm (50 - 200
nm)

Las espículas del coronavirus

emergen como estacas con un bulbo
en el extremo distal (16 - 21 nm)
 E
Estructura del virus
S
Los Coronavirus contienen una
estructura base formada por
cuatro proteínas estructurales:

Espícula (S) M
Membrana (M)
Envoltura (E)
Nucleocapside (N)
N

Envoltura de
bicapa lipídica
Organización Genómica
Genomas de la familia Coronaviridae: 26 a 32 kb, el más grande entre
los virus de RNA
El genoma de SARS-CoV-2 es 29,903 nt (Wuhan-Hu-1, NC_045512)
El genoma codifica: 5′-replicasa-S-E-M-N-3′ (Polaridad positiva)

3822 nt
El gen Replicasa ocupa 2/3
(21,289 nt) Todos los demás 228 nt
genes son 669 nt
expresados de
mRNA
Proteína traducida subgenómicos
directamente del genoma viral (sgRNA) 1260 nt
Proteína SFacilita la unión del virus a os receptores de superficie del
huésped lo que resulta en la fusión y entrada del virus
La proteína S se inserta en la membrana del retículo
endoplásmico por medio de un péptido señal.
Es modificado co-traduccionalmente por N-glicosilaciones, lo
que permite su adecuado plegamiento y trimerización
La proteína S es cortada Se presenta un corte alternativo
por una proteasa furina (S2′) por TMPRSS2
del huésped en S1 y S2.

RBD

438 527
 Proteína M
Le da forma a la envoltura del virus
El extremo N-terminal tiene un pequeño ectodominio,
variable con N-glicosilaciones
El endodominio C-terminal esta situado en el interior del
virion o en la cara intracelular de membranas.

Proteína E
Es una proteína integral de membrana, pero no tiene
peptide señal ni presenta glicosilaciones.
Tiene una arquitecturea común: un extremo corto N-terminal
hidrofilico, seguido por una region hidrofóbica grande, y una
cola en C-terminal hidrofílica.
 Proteína N
La proteína N es una fosfoproteína, modificada en serinas y treoninas.
Los monómeros tienen dos dominios [dominio N-terminal (NTD) y el dominio
C- terminal (CTD)] y una región rica en serina y arginina (región SR).
En la formación de la nucleocápside participan dos secuencias específicas
(Secuencia de regulación de la transcripción –TRS- y la señal de
empaquetamiento de RNA genómico).
Ciclo biológico: adhesión,
replicación y expresión
Adhesión
SARS-CoV-2 requiere la serin proteasa TMPRSS2 para iniciar la
entrada a la célula.
La proteólisis sucede en el sitio S2′, antes del péptido de fusión.
El péptido de fusión interactúa con la membrana celular.
Una estructura de seis hélices antiparalelas (repeticiones de heptadas)
interactúan con la membrana de la célula huésped

Arg815/Ser816

Mushtaq Hussain et al. AIMS Microbiol. 2020;6:350–360.

Rinki Minakshi et al. Front Cell Infect Microbiol. 2020;10:575404.
 Respuesta inmune

Los síntomas aparecen

5 días después de la
infección

La seroconversión inicia entre los días 5-7

En esta etapa (período de y 14, en el período previo es posible que las
ventana) la detección por PCR pruebas serológicas den un falso negativo
puede dar un falso negativo
Diagnóstico con prueba POC
El uso de pruebas de diagnóstico en el punto de atención (Point-of-Care Testing - POCT) se
define como la práctica de realizar ensayos a partir de especímenes clínicos al lado de o cerca
del paciente, bajo la premisa que los resultados de las pruebas estarán disponibles de
inmediato, o dentro de un período de tiempo muy breve (usualmente minutos), con el objetivo
de proveer información útil al personal de salud en la toma de decisiones referentes al
diagnóstico y tratamiento . Esta amplia definición cubre escenarios muy diversos de uso:

Hospitales, usualmente de alta complejidad (salas de emergencia, unidades de cuidado

intensivo, salas de cirugía);

Consultorios médicos; centros y puestos de salud en áreas apartadas, en donde el acceso a

laboratorios clínicos es inexistente;

Hogar del paciente.

 Inmunocromatografía como prueba POC
El ensayo de inmunocromatografía (ICA), también llamado prueba de flujo lateral, es
un dispositivo sencillo diseñado para detectar la presencia o ausencia de un analito.

El concepto de ICA es una combinación de cromatografía (separación de los

componentes de una muestra basada en las diferencias en su movimiento a través de
una superficie adsorbente) y reacciones inmunológicas.

El sistema inmunocromatográfico más empleado en la prueba en tirilla.

Almohadilla de conjugado: es el lugar donde ocurre
la reacción (Ab o Ag marcados con nanopartículas de
oro coloidal). El conjugado se libera al contacto con
la muestra en movimiento.

Almohadilla de absorción: funciona como un

Almohadilla de muestra: permite el desagüe al final de la tirilla. También ayuda a
movimiento de la muestra de una mantener el flujo del líquido sobre la membrana y
manera suave, homogénea y continua evitar que la muestra regrese sobre la membrana.

Membrana sustrato: se colocan sobre ella las

l+ineas de prueba y control, Provee el soporte para
la unión de moléculas que capturarán los complejos,
Soporte sólido: químicamente inerte permite el flujo Ab o Ag. Debe tener una buena calidad para evitar la
lateral evitando la formación de ángulos inclinados. unión inespecífica en regiones vacías.
La muestra clínica de sangre
completa, suero o plasma se
agrega al pocillo. Luego, se agrega La muestraLa llegará
línea Macontiene
la almohadilla
un anticuerpo
La de
línea
conjugado,
G contiene
inmovilizado
La
queun
línea
contiene
anticuerpo
que
de reconoce
control
el antígeno
inmovilizado
eslalaIgM
última
COVID-
humana.
que
línea
reconoce
que encontrará
la la muestra. La línea de control
el tampón de dilución (buffer 19 conjugado
Cualquier
con unanticuerpo
coloide deIgM
nanopartículas
IgGsehumana.
unirá aquí.
Todos
de Sin
contiene
orolos
embargo,
(AuNP)
anticuerpos
un de
anticuerpo
solo
40 los
nm.
IgGcomplejos
Durante
se
inmovilizado
uniránde aquí.
que
Sinreconoce IgG de conejo, el anticuerpo de
salino con fosfato 10 mM). esta etapa,
nanopartículas
cualquier anticuerpo
de oro/antígeno
embargo,
en la muestra
COVID-19
solo con
loscontrol.
complejos
especificidad
/ anticuerpo
Paradeque
nanopartículas
IgM
para
sirva
humano
COVID-19
como producirán
control
deseoro/antígeno
de procedimiento,
una siempre debe aparecer una
unirá al antígeno
línea de ycolor
su nanopartícula
visible. COVID-19
de oro conjugada.
/ anticuerpo
líneaEldecontrol
IgG
color
humano
en
del
lakit,
región
producirán
IgGdedela una
línealínea
de control,
de lo que indica que se ha agregado el
conejo, se conjuga con la misma nanopartícula
color visible. de oro
volumen
y viaja
adecuado
con el resto
de muestra
de la y que se ha producido la absorción de la membrana.
muestra de este paso.
Inmunocromatografía en formato de
Sandwich o de Captura
En este formato de ensayo, el anticuerpo acoplado al marcador (enzimas o nanopartículas o
fluorocromos) se inmoviliza en la almohadilla de conjugado.
Se inmoviliza un anticuerpo de captura contra el analito sobre la línea de prueba. Se inmoviliza un
anticuerpo secundario contra el anticuerpo marcado en la zona de control. Para iniciar una prueba,
la muestra que contiene el analito se aplica a la almohadilla de muestra y posteriormente migra a
las otras partes de la tira. En la almohadilla de conjugado, el analito es capturado por el
anticuerpo marcado inmovilizado y da como resultado la formación de un complejo de anticuerpo
marcado con analito. Este complejo llega ahora a la membrana de nitrocelulosa y se mueve por
capilaridad. En la línea de prueba, el complejo de anticuerpo marcado-analito es capturado por
otro anticuerpo el cuales primario para el analito. El analito se intercala entre el anticuerpo
marcado y primario formando un complejo anticuerpo marcado-analito-anticuerpo primario. El
anticuerpo secundario capturará el exceso de anticuerpo marcado en la zona de control. El
tampón o el exceso de solución va a la almohadilla de absorción. La intensidad del color en la línea
de prueba corresponde a la cantidad de analito objetivo y se mide con un lector de tiras ópticas o
se inspecciona visualmente. La aparición de color en la línea de control asegura que una tira
funcione correctamente.
La HCG es una glicoproteína con un peso
molecular de 37.9 kDa, con una porción de
carbohidratos más alta en comparación con
otras hormonas. Está compuesta de dos
subunidades:
• Alfa ()
Crom 19
• Beta () Crom 6

La HCG es producida por las células  

sincitiotrofoblásticas placentarias.
RE
El cromosoma 6 codifica la subunidad  y HCG
el cromosoma 19 codifica la subunidad .

La HCG estimula el cuerpo lúteo que

produce progesterona en la primera
semana de embarazo.

Progesterona:
• Previene la menstruación.
• Apoya el embarazo.
Progesterona
Diagrama de una prueba de embarazo POC por
immunocromatografía de Sandwich que detecta HCG.

(A) Se aplica una muestra de orina a la barra o pocillo.

Si está embarazada, debe contener HCG.

(B) A medida que la muestra se absorbe en la barra,

pasa por anticuerpos libres marcados oro coloidal que
reconocen y se adhieren a la HCG.

(C) Un conjunto de anticuerpos inmobilizados se

adhieren y capturan complejos de HCG-anticuerpos
marcados con oro coloidal, creando la primera línea. En
la muestra "no embarazada" no hay HCG adherida a los
anticuerpos marcados con oro coloidal, por lo que
pasan este punto y no aparece ninguna línea.

(D) Un segundo conjunto de anticuerpos inmobilizados

captura los anticuerpos marcados con oro coloidal,
proporcionando un control positivo para indicar que la
prueba está funcionando correctamente.