Laboratorio L8

CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS DE RATÓN

Lo primero que se hace es elegir el cruce de interés. En mi caso, uso la colonia de
ratones WT/KO NCLX del Dr. Antonio Martinez, y escojo cruces entre ratones de
igual genotio (WTxWT o KOxKO) para asegurar una descendencia uniforme. Una
vez que se pone el cruce, puede pasar hasta una semana de registro del tapó n. Es
mejor escoger hembras no muy mayores, ya que aunque se vayan a sacrificar,
cuando má s joven má s probabilidad de embarazo y de má s fetos. Todo esto va por
correos a Iliana (Iliana.mir@uam.es) con copia a Toñ o
(amartinezruiz@salud.madrid.org).

Una vez fechado el tapó n en la hembra, el cultivo se hará en el día 19 de gestació n

(E19).

PREPARACIÓN MEDIO DE CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS DE RATÓN:

A partir de medio neurobasal (GIBCO 21103, 500 mL), se le añ ade:

- 5 mL de L-glutamina (SIGMA G6392)
- 2.5 mL de Penicilina/Estreptomicina (GIBCO)

L-Glutamina: viene en un vial en polvo y hay que diluirlo en 10 mL de Neurobasal

(sin nada, de la botella directamente). Para reconstituirlo, se echan los 10 mL de
medio en un falcon de 50 mL y con una jeringuilla se pasan al bote. Se necesita una
aguja que atraviese el tapó n. Este proceso es bastante complejo y engorroso. Hay
que disolverlo muy bien, porque cuesta mucho, usar vortex. Luego añ adir 5 mL al
medio y guardar los otros 5 mL en el congelador. (Cultivos L8, 2º cajó n de Cris).

Antibió ticos: son los mismos que para el medio de cultivo de SH-SY5Y, está n en el
congelador de cultivos, 2º cajó n Cris.

Mientras se está preparando el medio SIEMPRE hay que tener el mechero

encendido y FLAMEAR TODO.

DÍA 0: TRATAMIENTO DE LAS PLACAS

Para que las neuronas puedan pegarse se debe poner poli-D-lisina en los pocillos
(también se pegan con poli-L-lisina). Con una pipeta Pasteur se dejan caer 2-3
gotas (dependiendo del tamañ o del pocillo de la placa que se vaya a utilizar). Se
precinta con parafilm y se dejan en la nevera hasta el día siguiente.

En el caso de hacer inmunohistoquímica, se colocan cubres en los pocillos de una

p24. Antes de ser colocados, cada cubre se flamea para aumentar su esterilidad.
Después se cubre bien todo con poli-D-lisina con atenció n ya que estos cristales
tienden a flotar.

Lucía Viejo de Navas

Laboratorio L8

Si por alguna razó n no se puede preparar todo esto el día de antes, ese mismo día
se sigue el mismo procedimiento pero, en vez de meterlo en la nevera, se deja 30
min en el incubador.

DÍA 1: SIEMBRA

Primero se saca la placa de la nevera y se limpia la poli-D-lisina que sobre. En la

campana, se unas un envoltorio de una placa y se vuelca allí la poli-D-lisina que no
se ha pegado. Después, con una pipeta se lava 3 veces con agua destilada llenando
los pocillos hasta la mitad. Se seca bien con el aspitador y se pone en el ultravioleta
al menos 30 min o hasta que se vuelva del animalario.

Antes de ir al animalario preparar un falcon de 15 mL con 2 mL de medio

neurobasal para disgregar los trozos de cerebro y los falcons necesarios para
sembrar. Dejarlos en el bañ o para que estén calientes.

En el animalario se pide la hembra preñ ada y se sube al laboratorio para realizar

todo el protocolo aquí. En el laboratorio tenemos todo lo el material para hacer la
extracció n (tijeras, pinzas…)

La hembra se mata por dislocació n cervical de forma rá pida y comienza la

extracció n de los fetos. Se hace un corte vertical en la tripa de la ratona con las
tijeras abriendo la capa de piel de forma que se accede a la capa muscular. Se
realiza el corte de esta capa por la línea alba (de color blanco) levantando en forma
de tienda de campañ a toda la musculatura al cortar para evitar dañ ar a los fetos o
partes del sistema digestivo. Después con las pinzas se sacan todas las placentas
con los fetos asegurando que no quede dentro ninguno, suele haber en torno a 5-7
crías. Se abren una por una las placentas, se saca el feto y se corta la cabeza con las
tijeras en un corte rá pido y preciso. Las cabezas se meten en el Falcon de 50.

Una vez extraídas las cabezas, la ratona se envuelve en un guante y me mete en el

congelador hasta que volvamos a bajar al animalario.

Se prepara una placa petri con hielo dentro y sobre ella se coloca las cabezas (de
una en una). Se llega esta el cerebro sujetando la cabeza con unas pinzas finas y
usando otras para retirar la piel, el crá neo y las meninges. Después se cortan dos
pequeñ as rodajas correspondientes a la corteza cerebral. Los trozos se dejan en
medio neurobasal hasta que se extraen todas las cortezas.

Dentro de campana, con una pipeta Pasteur al Falcon de 15 con 2 mL de

neurobasal con cuidado de llevar el menor medio ‘no estéril’ posible. Con otra
pipeta pasteur, en la que se pone una punta amarilla, se pasan los trozos por ella 5
veces para comenzar a disgregarlos. Si son muy grandes y no entran por la punta,
cogerlos con la pipeta y luego poner la punta. Se cuenta solamente las veces que
pasa por la pipeta TODO el tejido. Después, pasar se pone una punta blanca sobre

Lucía Viejo de Navas

Laboratorio L8

la amarilla y se disgrega 10 veces. Cuando está todo bien homogeneizado, se

cuentan las células en una cá mara Neubaguer.

En un eppendorf 10 uL de azul de tripano y 10 uL de células. Pasar 10 uL y ponerlo

en la cá mara de Neubaguer. Se recuentan los 4 cuadrantes y se hace la media. A
continuació n se multiplica por 2 para quitar la dilució n del tripano y para saber
cuá ntas células hay por mL se multiplica por 104.

Por ú ltimo, se ponen los uL correspondientes a cada placa que se quiera sembrar
en los falcons con medio que inicialmente se han preparado y se añ ade B27 (factor
que promueve le crecimiento exclusivo de neuronas). Por cada 10 mL de medio se
añ aden 200 uL de B27.

En el caso de siembra para inmunohistoquímica (IH), los cá lculos de medio con

células se hacen en 200 uL. Se añ ade en forma de gota con cuidado esa cantidad
con células sobre el cubre para que la mayoría de las células queden pegadas en la
zona de interés. Con cuidado de no romper las gotas, se deja 30 min en el
incubardor y después se completa el medio con 500 uL/poc. Todos los medios
suplementados con B27.

Placa Células/pocillo uL/pocillo neurobasal

IH-
30.000 200 + 500
p24
p48 40.000 200
p96 30.000 200

Se siembran las placas que se requieran y se meten en el incubador. NO se pueden

sacar del incubador hasta el día de uso ya que son extremadamente sensibles a los
cambios de temperatura y concentraciones de gases.

Lucía Viejo de Navas