EXTRACCIÓN DE SANGRE Y ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN. AISLAMIENTO DE LINFOCITOS.

1.- INTRODUCCIÓN En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio para la obtención de antisueros o complemento, para la generación de anticuerpos monoclonales o para la producción de líquido ascítico a partir de hibridomas. En esta práctica se aprenderán las técnicas básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en Inmunología. Se llevarán a cabo técnicas de inyección subcutánea e intraperitoneal, extracción de sangre del plexo axilar y mediante punción intracardiaca, extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a partir de estos tejidos sólidos. Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al animal, lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños innecesarios al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas y tenderán a morder instintivamente. 2.- OBJETIVOS Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: - Sujetar manualmente los ratones para ser correctamente inyectados, sin riesgo personal y sin dañar al animal. - Extraer sangre y preparar suero. - Anestesiar ratones por inhalación - Abrir el abdomen y extraer el bazo. - Localizar y extraer ganglios linfáticos. - Abrir el tórax y extraer el timo. - Disgregar los tejidos para obtener células viables. 3.- EQUIPAMIENTO - Ratones Swiss o similares adultos, no importa el sexo. - Material de disección: Guantes, tijeras, bisturí, pinzas, jeringuillas y agujas para insulina. - Vaso de precipitado de 1000 cc o recipiente de vidrio con tapa. - Tubo de 50 ml con tapa. - Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla. - Placas de cultivo de 24 pocillos. - Pipetas de 5-50 µl y 200-1000 µl y puntas. - Contenedor para material cortante. 4.- REACTIVOS

. 1. C.Cargar la jeringuilla con el líquido a inyectar (2. 4. puede extraerse..Lavar el abdomen con etanol y dejar secar..Tampón PBS pH 7.Situar el rabo por detrás del dedo meñique para inmovilizar al ratón con una sola mano. 6.Introducir la aguja en el cuadrante inferior izquierdo (o derecho) del abdomen a un lado de la línea media.MÉTODO A.Colocar al animal tumbado de espaldas sobre un secante y sujetar una pata. B. 3... 2..5 ml de suero fisiológico) expulsar las burbujas de aire y dejar preparada. Muy inflamable).. 2...5 ml de suero fisiológico) y expulsar el aire..Inyección intraperitoneal. 5.. 8..Inyección subcutánea. 2....Inyectar con presión moderada.. puede colocarse unos segundos en la cabeza del animal el tubo de 50 ml con el algodón humedecido en éter.Con los dedos pulgar e índice de la otra mano agarrar por la piel de la nuca..Colocar al ratón ligeramente cabeza abajo. 1. 7.Introducir la aguja bajo la piel entre los dedos. 4. 3. 3..Sujetar por la piel del área interescapular con los dedos índice y pulgar. Tapar y dejar evaporar dos minutos.Anestesiar al ratón.Eter dietílico anestésico . 1. .Cargar una jeringuilla con la suspensión a inyectar (en nuestro caso 2. 2.Colocar un trozo grande de algodón en un vaso de precipitado y empapar ligeramente con éter dietílico (Evitar su inhalación directa.Sacar al ratón de la jaula asiéndolo con una mano por la base del rabo y situarlo sobre la tapa para que se agarre a las barras. 1. Servirá para suplementar anestesia si se requiere más tarde.Suero fisiológico 5.. 5....Anestesiado por inhalación.Extracción de sangre del plexo axilar. 4... D.Cuando se observe que el animal se tiende y su respiración es lenta y regular.Situar al ratón sobre sus patas encima de un secante..Inyectar con presión moderada.Si se requiriera aplicar un suplemento anestésico durante las manipulaciones siguientes.Preparar un tubo de 50 ml con un algodón humedecido en éter y guardar tapado..Introducir al animal en el recipiente y tapar.Etanol 70% .2 . 5.

6..Colocar el bazo en un pocillo con 1 ml de PBS. Añadir 1ml de PBS. Aspirar lentamente hasta que el flujo de sangre pare...Colocarlo de espaldas sobre un papel secante..Recoger la sangre con una pipeta y dispensarla en un tubo.. Timo: 12.Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas. 13. 7. depositar en un pocillo y limpiar de tejido graso y conectivo.Dejar coagular.3. timo y ganglios) 1.. 5.Girar al animal para exponer su flanco izquierdo.. . 5. 2..Con un bisturí cortar la piel de la zona del tórax cercana a la región axilar.Esterilizar con alcohol la zona de la línea media. 7. 6. Bazo: 6.... 1.Extraer. tirar del rabo hacia atrás con la otra mano mientras se presiona hacia abajo en la nuca. con tijeras. recoger el suero con un pipeta y transferir a un tubo eppendorf.Diseccionar la región axilar y localizar algún ganglio linfático.. 5. 4. desde el xifoides hasta el cuello.Dejar coagular...Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí detrás de las orejas.Extracción de órganos linfoides (bazo....Cortar por la línea media con tijeras. centrifugar a 600xg 10 minutos. F..Depositar la sangre en un tubo. 11. 3.Retirara la piel con los dedos..Abrir el tórax mediante una incisión... 2. 8. 9.Introducir despacio la aguja al tiempo que se extrae ligeramente el émbolo..La sangre entrará en la jeringuilla cuando la aguja penetre en el corazón.Anestesiar al ratón y preparar una jeringa con aguja de insulina. 4. recoger el suero con una pipeta y transferir a un tubo eppendorf. quitando previamente la aguja para evitar hemólisis.Retirar ligeramente la piel con unas pinzas y con el bisturí cortar los vasos.Introducir la aguja debajo y ligeramente a la derecha del cartílago xifoides (izquierda del animal) con una inclinación de 15-20 grados. cruzando la nuca. Mover la aguja hacia delante o atrás para extraer la máxima cantidad posible de sangre. centrifugar a 600xg 10 minutos.. Ganglios: 10. 3. 4..Tumbar al ratón de espaldas.Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras.Extracción de sangre por punción intracardiaca. cortando el tejido conectivo. E...Colocar al animal tumbado de espaldas.

Cuando todo el líquido esté en el tubo. dejar sedimentar los trozos de tejido no disgregado y transferir el líquido claro a un tubo limpio. 7. 2..Limpiar de tejido graso y conectivo.Reemplazar con PBS limpio y repetir los pasos 4 a 6 hasta que solo quede la cápsula... 4. timo). G...14. 6..Aspirar el líquido que baña la pieza y depositarlo en un tubo. 8.. 1.Extraer el timo con las pinzas y colocado en un pocillo con 1ml de PBS.Centrifugar a 400xg 5 minutos. 15.Disgregación de tejidos linfoides (bazo..Depositar las piezas en pocillos o placas de petri pequeñas en las que previamente se ha añadido PBS estéril..Presionar suavemente con el émbolo de una jeringuilla. decantar y añadir 1ml de medio de cultivo.Abrir las costillas con las pinzas. ganglios.. . 5. 3.Pinchar repetidas veces con una aguja..

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