EXTRACCIÓN DE SANGRE Y ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN. AISLAMIENTO DE LINFOCITOS.

1.- INTRODUCCIÓN En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio para la obtención de antisueros o complemento, para la generación de anticuerpos monoclonales o para la producción de líquido ascítico a partir de hibridomas. En esta práctica se aprenderán las técnicas básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en Inmunología. Se llevarán a cabo técnicas de inyección subcutánea e intraperitoneal, extracción de sangre del plexo axilar y mediante punción intracardiaca, extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a partir de estos tejidos sólidos. Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al animal, lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños innecesarios al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas y tenderán a morder instintivamente. 2.- OBJETIVOS Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: - Sujetar manualmente los ratones para ser correctamente inyectados, sin riesgo personal y sin dañar al animal. - Extraer sangre y preparar suero. - Anestesiar ratones por inhalación - Abrir el abdomen y extraer el bazo. - Localizar y extraer ganglios linfáticos. - Abrir el tórax y extraer el timo. - Disgregar los tejidos para obtener células viables. 3.- EQUIPAMIENTO - Ratones Swiss o similares adultos, no importa el sexo. - Material de disección: Guantes, tijeras, bisturí, pinzas, jeringuillas y agujas para insulina. - Vaso de precipitado de 1000 cc o recipiente de vidrio con tapa. - Tubo de 50 ml con tapa. - Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla. - Placas de cultivo de 24 pocillos. - Pipetas de 5-50 µl y 200-1000 µl y puntas. - Contenedor para material cortante. 4.- REACTIVOS

puede extraerse.Situar al ratón sobre sus patas encima de un secante.Suero fisiológico 5. 3. 2..Cargar la jeringuilla con el líquido a inyectar (2.Inyección intraperitoneal... Tapar y dejar evaporar dos minutos.. B..Situar el rabo por detrás del dedo meñique para inmovilizar al ratón con una sola mano.Colocar al ratón ligeramente cabeza abajo. 3..Colocar al animal tumbado de espaldas sobre un secante y sujetar una pata. C.Etanol 70% .5 ml de suero fisiológico) expulsar las burbujas de aire y dejar preparada.. 2. 2.5 ml de suero fisiológico) y expulsar el aire. 5.Sujetar por la piel del área interescapular con los dedos índice y pulgar. 8. 7.. 4.Colocar un trozo grande de algodón en un vaso de precipitado y empapar ligeramente con éter dietílico (Evitar su inhalación directa. Muy inflamable).Inyección subcutánea... 1..Si se requiriera aplicar un suplemento anestésico durante las manipulaciones siguientes. 1.Inyectar con presión moderada. puede colocarse unos segundos en la cabeza del animal el tubo de 50 ml con el algodón humedecido en éter.Lavar el abdomen con etanol y dejar secar. 3. 5..Introducir la aguja en el cuadrante inferior izquierdo (o derecho) del abdomen a un lado de la línea media. 4.... Servirá para suplementar anestesia si se requiere más tarde..Inyectar con presión moderada.. .. D. 1.Anestesiado por inhalación..2 . 5.. 2.Cargar una jeringuilla con la suspensión a inyectar (en nuestro caso 2.Anestesiar al ratón.MÉTODO A.Tampón PBS pH 7.Introducir al animal en el recipiente y tapar... 6. 1..Sacar al ratón de la jaula asiéndolo con una mano por la base del rabo y situarlo sobre la tapa para que se agarre a las barras.Cuando se observe que el animal se tiende y su respiración es lenta y regular.Eter dietílico anestésico ..Con los dedos pulgar e índice de la otra mano agarrar por la piel de la nuca..Extracción de sangre del plexo axilar..Introducir la aguja bajo la piel entre los dedos. 4.Preparar un tubo de 50 ml con un algodón humedecido en éter y guardar tapado.

. quitando previamente la aguja para evitar hemólisis.... centrifugar a 600xg 10 minutos..Introducir la aguja debajo y ligeramente a la derecha del cartílago xifoides (izquierda del animal) con una inclinación de 15-20 grados. recoger el suero con una pipeta y transferir a un tubo eppendorf.Introducir despacio la aguja al tiempo que se extrae ligeramente el émbolo.La sangre entrará en la jeringuilla cuando la aguja penetre en el corazón.Girar al animal para exponer su flanco izquierdo...Dejar coagular.. 6. Timo: 12.Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras.Depositar la sangre en un tubo...Dejar coagular.Abrir el tórax mediante una incisión. 4.Anestesiar al ratón y preparar una jeringa con aguja de insulina. 8. 5.Colocar el bazo en un pocillo con 1 ml de PBS.. Ganglios: 10.. 7.Retirar ligeramente la piel con unas pinzas y con el bisturí cortar los vasos. desde el xifoides hasta el cuello. 3.3.Extracción de sangre por punción intracardiaca.. . con tijeras..Retirara la piel con los dedos.Diseccionar la región axilar y localizar algún ganglio linfático. cortando el tejido conectivo.. 2..Recoger la sangre con una pipeta y dispensarla en un tubo.Tumbar al ratón de espaldas. Aspirar lentamente hasta que el flujo de sangre pare. Mover la aguja hacia delante o atrás para extraer la máxima cantidad posible de sangre.. 5. 6. 1.Cortar por la línea media con tijeras.Esterilizar con alcohol la zona de la línea media. Bazo: 6...Extracción de órganos linfoides (bazo.Colocarlo de espaldas sobre un papel secante.. cruzando la nuca.Con un bisturí cortar la piel de la zona del tórax cercana a la región axilar. 5.. 11.. tirar del rabo hacia atrás con la otra mano mientras se presiona hacia abajo en la nuca. 7. depositar en un pocillo y limpiar de tejido graso y conectivo. recoger el suero con un pipeta y transferir a un tubo eppendorf. Añadir 1ml de PBS.. F. 13. 4. 2. 3.Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí detrás de las orejas.Extraer. E.. 9. 4.Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas.. timo y ganglios) 1.. centrifugar a 600xg 10 minutos.Colocar al animal tumbado de espaldas.

2. 15. ganglios..Extraer el timo con las pinzas y colocado en un pocillo con 1ml de PBS. 7. 4.Presionar suavemente con el émbolo de una jeringuilla..Limpiar de tejido graso y conectivo. 6. dejar sedimentar los trozos de tejido no disgregado y transferir el líquido claro a un tubo limpio.. G.Depositar las piezas en pocillos o placas de petri pequeñas en las que previamente se ha añadido PBS estéril..Centrifugar a 400xg 5 minutos. 1.Pinchar repetidas veces con una aguja.Cuando todo el líquido esté en el tubo... 5. decantar y añadir 1ml de medio de cultivo.Abrir las costillas con las pinzas.Aspirar el líquido que baña la pieza y depositarlo en un tubo.14.Reemplazar con PBS limpio y repetir los pasos 4 a 6 hasta que solo quede la cápsula. timo)...Disgregación de tejidos linfoides (bazo.. 8. . 3...

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