EXTRACCIÓN DE SANGRE Y ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN. AISLAMIENTO DE LINFOCITOS.

1.- INTRODUCCIÓN En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio para la obtención de antisueros o complemento, para la generación de anticuerpos monoclonales o para la producción de líquido ascítico a partir de hibridomas. En esta práctica se aprenderán las técnicas básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en Inmunología. Se llevarán a cabo técnicas de inyección subcutánea e intraperitoneal, extracción de sangre del plexo axilar y mediante punción intracardiaca, extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a partir de estos tejidos sólidos. Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al animal, lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños innecesarios al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas y tenderán a morder instintivamente. 2.- OBJETIVOS Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: - Sujetar manualmente los ratones para ser correctamente inyectados, sin riesgo personal y sin dañar al animal. - Extraer sangre y preparar suero. - Anestesiar ratones por inhalación - Abrir el abdomen y extraer el bazo. - Localizar y extraer ganglios linfáticos. - Abrir el tórax y extraer el timo. - Disgregar los tejidos para obtener células viables. 3.- EQUIPAMIENTO - Ratones Swiss o similares adultos, no importa el sexo. - Material de disección: Guantes, tijeras, bisturí, pinzas, jeringuillas y agujas para insulina. - Vaso de precipitado de 1000 cc o recipiente de vidrio con tapa. - Tubo de 50 ml con tapa. - Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla. - Placas de cultivo de 24 pocillos. - Pipetas de 5-50 µl y 200-1000 µl y puntas. - Contenedor para material cortante. 4.- REACTIVOS

7....Preparar un tubo de 50 ml con un algodón humedecido en éter y guardar tapado.Si se requiriera aplicar un suplemento anestésico durante las manipulaciones siguientes.2 .Situar el rabo por detrás del dedo meñique para inmovilizar al ratón con una sola mano. 3.Introducir la aguja en el cuadrante inferior izquierdo (o derecho) del abdomen a un lado de la línea media.Cargar la jeringuilla con el líquido a inyectar (2. C.. 1.Situar al ratón sobre sus patas encima de un secante.. 2.Con los dedos pulgar e índice de la otra mano agarrar por la piel de la nuca.. B.Inyectar con presión moderada.5 ml de suero fisiológico) expulsar las burbujas de aire y dejar preparada.Cargar una jeringuilla con la suspensión a inyectar (en nuestro caso 2.Sujetar por la piel del área interescapular con los dedos índice y pulgar..Eter dietílico anestésico .Lavar el abdomen con etanol y dejar secar. Muy inflamable).. 4.. 5. 8. 2. 1.Introducir al animal en el recipiente y tapar.Suero fisiológico 5.Colocar al animal tumbado de espaldas sobre un secante y sujetar una pata...Inyectar con presión moderada.. Tapar y dejar evaporar dos minutos. 2.. 5. . 4.Colocar al ratón ligeramente cabeza abajo.. 5.Tampón PBS pH 7.Extracción de sangre del plexo axilar.Introducir la aguja bajo la piel entre los dedos. 3. 3...... 2.. 1.Colocar un trozo grande de algodón en un vaso de precipitado y empapar ligeramente con éter dietílico (Evitar su inhalación directa.Etanol 70% .Sacar al ratón de la jaula asiéndolo con una mano por la base del rabo y situarlo sobre la tapa para que se agarre a las barras.Inyección subcutánea.5 ml de suero fisiológico) y expulsar el aire. 6. 4.. puede colocarse unos segundos en la cabeza del animal el tubo de 50 ml con el algodón humedecido en éter.. Servirá para suplementar anestesia si se requiere más tarde.. 1.Anestesiado por inhalación.Inyección intraperitoneal.MÉTODO A.Cuando se observe que el animal se tiende y su respiración es lenta y regular.Anestesiar al ratón.. puede extraerse. D...

8..Cortar por la línea media con tijeras..Colocarlo de espaldas sobre un papel secante. Aspirar lentamente hasta que el flujo de sangre pare. quitando previamente la aguja para evitar hemólisis.. 1..Dejar coagular. tirar del rabo hacia atrás con la otra mano mientras se presiona hacia abajo en la nuca..Introducir despacio la aguja al tiempo que se extrae ligeramente el émbolo. 4. F.. desde el xifoides hasta el cuello.Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras.Anestesiar al ratón y preparar una jeringa con aguja de insulina. 3. 9. 5. 13..Dejar coagular. 4.Tumbar al ratón de espaldas..Retirara la piel con los dedos. con tijeras...3.Extracción de sangre por punción intracardiaca.. 6.Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí detrás de las orejas. Mover la aguja hacia delante o atrás para extraer la máxima cantidad posible de sangre.Con un bisturí cortar la piel de la zona del tórax cercana a la región axilar.. E. cortando el tejido conectivo. centrifugar a 600xg 10 minutos. recoger el suero con un pipeta y transferir a un tubo eppendorf.. 4.Retirar ligeramente la piel con unas pinzas y con el bisturí cortar los vasos..Recoger la sangre con una pipeta y dispensarla en un tubo.Colocar al animal tumbado de espaldas. Ganglios: 10.Esterilizar con alcohol la zona de la línea media. recoger el suero con una pipeta y transferir a un tubo eppendorf. Bazo: 6.Extracción de órganos linfoides (bazo.Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas.Abrir el tórax mediante una incisión.Extraer.. 11. 3.Diseccionar la región axilar y localizar algún ganglio linfático. 5...Colocar el bazo en un pocillo con 1 ml de PBS.Introducir la aguja debajo y ligeramente a la derecha del cartílago xifoides (izquierda del animal) con una inclinación de 15-20 grados. centrifugar a 600xg 10 minutos. 6.. depositar en un pocillo y limpiar de tejido graso y conectivo.. 2.... timo y ganglios) 1. 7. 7. 5.Girar al animal para exponer su flanco izquierdo. cruzando la nuca.... 2. . Añadir 1ml de PBS.. Timo: 12.Depositar la sangre en un tubo.La sangre entrará en la jeringuilla cuando la aguja penetre en el corazón.

1. timo).Depositar las piezas en pocillos o placas de petri pequeñas en las que previamente se ha añadido PBS estéril.Reemplazar con PBS limpio y repetir los pasos 4 a 6 hasta que solo quede la cápsula...Limpiar de tejido graso y conectivo.. decantar y añadir 1ml de medio de cultivo... 6.Pinchar repetidas veces con una aguja... .. 7.Extraer el timo con las pinzas y colocado en un pocillo con 1ml de PBS... 5.Centrifugar a 400xg 5 minutos. ganglios. 4.Disgregación de tejidos linfoides (bazo. 2. 15. dejar sedimentar los trozos de tejido no disgregado y transferir el líquido claro a un tubo limpio..Cuando todo el líquido esté en el tubo.Aspirar el líquido que baña la pieza y depositarlo en un tubo. G. 3.Abrir las costillas con las pinzas.14.Presionar suavemente con el émbolo de una jeringuilla. 8.

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