EXTRACCIÓN DE SANGRE Y ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN. AISLAMIENTO DE LINFOCITOS.

1.- INTRODUCCIÓN En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio para la obtención de antisueros o complemento, para la generación de anticuerpos monoclonales o para la producción de líquido ascítico a partir de hibridomas. En esta práctica se aprenderán las técnicas básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en Inmunología. Se llevarán a cabo técnicas de inyección subcutánea e intraperitoneal, extracción de sangre del plexo axilar y mediante punción intracardiaca, extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a partir de estos tejidos sólidos. Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al animal, lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños innecesarios al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas y tenderán a morder instintivamente. 2.- OBJETIVOS Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: - Sujetar manualmente los ratones para ser correctamente inyectados, sin riesgo personal y sin dañar al animal. - Extraer sangre y preparar suero. - Anestesiar ratones por inhalación - Abrir el abdomen y extraer el bazo. - Localizar y extraer ganglios linfáticos. - Abrir el tórax y extraer el timo. - Disgregar los tejidos para obtener células viables. 3.- EQUIPAMIENTO - Ratones Swiss o similares adultos, no importa el sexo. - Material de disección: Guantes, tijeras, bisturí, pinzas, jeringuillas y agujas para insulina. - Vaso de precipitado de 1000 cc o recipiente de vidrio con tapa. - Tubo de 50 ml con tapa. - Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla. - Placas de cultivo de 24 pocillos. - Pipetas de 5-50 µl y 200-1000 µl y puntas. - Contenedor para material cortante. 4.- REACTIVOS

...Inyectar con presión moderada..Introducir la aguja en el cuadrante inferior izquierdo (o derecho) del abdomen a un lado de la línea media..Introducir la aguja bajo la piel entre los dedos.. 2..Con los dedos pulgar e índice de la otra mano agarrar por la piel de la nuca.Anestesiado por inhalación..Colocar un trozo grande de algodón en un vaso de precipitado y empapar ligeramente con éter dietílico (Evitar su inhalación directa.Eter dietílico anestésico .. D.Lavar el abdomen con etanol y dejar secar. 3. Servirá para suplementar anestesia si se requiere más tarde. 1.MÉTODO A... 2. puede colocarse unos segundos en la cabeza del animal el tubo de 50 ml con el algodón humedecido en éter..Anestesiar al ratón.. 6. C. B..5 ml de suero fisiológico) expulsar las burbujas de aire y dejar preparada...Sacar al ratón de la jaula asiéndolo con una mano por la base del rabo y situarlo sobre la tapa para que se agarre a las barras.Inyección subcutánea. 8.Inyección intraperitoneal.. 7.Inyectar con presión moderada....5 ml de suero fisiológico) y expulsar el aire.Introducir al animal en el recipiente y tapar. 1.. 2.Cuando se observe que el animal se tiende y su respiración es lenta y regular. 3. 5..Si se requiriera aplicar un suplemento anestésico durante las manipulaciones siguientes..Situar el rabo por detrás del dedo meñique para inmovilizar al ratón con una sola mano. 3.2 . . 5.Colocar al animal tumbado de espaldas sobre un secante y sujetar una pata.Extracción de sangre del plexo axilar.Suero fisiológico 5. Muy inflamable).Sujetar por la piel del área interescapular con los dedos índice y pulgar.Etanol 70% .. 4..Preparar un tubo de 50 ml con un algodón humedecido en éter y guardar tapado. 4.Cargar una jeringuilla con la suspensión a inyectar (en nuestro caso 2. 5. 1. 1.. 2.Colocar al ratón ligeramente cabeza abajo. Tapar y dejar evaporar dos minutos.Situar al ratón sobre sus patas encima de un secante. puede extraerse.Tampón PBS pH 7.Cargar la jeringuilla con el líquido a inyectar (2. 4.

recoger el suero con un pipeta y transferir a un tubo eppendorf.Tumbar al ratón de espaldas. 5...3.Dejar coagular. 5. 4... 7. Bazo: 6.Extracción de órganos linfoides (bazo.Recoger la sangre con una pipeta y dispensarla en un tubo.Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas. 3. cortando el tejido conectivo.Retirar ligeramente la piel con unas pinzas y con el bisturí cortar los vasos..... 13. desde el xifoides hasta el cuello. 11.. Ganglios: 10.Diseccionar la región axilar y localizar algún ganglio linfático. con tijeras.. Timo: 12. 9.Cortar por la línea media con tijeras. recoger el suero con una pipeta y transferir a un tubo eppendorf...Extracción de sangre por punción intracardiaca.Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras. quitando previamente la aguja para evitar hemólisis. Aspirar lentamente hasta que el flujo de sangre pare.. 8. 2.. 3.Con un bisturí cortar la piel de la zona del tórax cercana a la región axilar. 2.Introducir despacio la aguja al tiempo que se extrae ligeramente el émbolo. 4.... F. 7. Mover la aguja hacia delante o atrás para extraer la máxima cantidad posible de sangre.Extraer... cruzando la nuca.Girar al animal para exponer su flanco izquierdo...Colocar al animal tumbado de espaldas.La sangre entrará en la jeringuilla cuando la aguja penetre en el corazón. centrifugar a 600xg 10 minutos. E.. depositar en un pocillo y limpiar de tejido graso y conectivo.Introducir la aguja debajo y ligeramente a la derecha del cartílago xifoides (izquierda del animal) con una inclinación de 15-20 grados. 1.Colocarlo de espaldas sobre un papel secante.. 6. timo y ganglios) 1. 6. Añadir 1ml de PBS. 4.Depositar la sangre en un tubo.Abrir el tórax mediante una incisión.. .Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí detrás de las orejas..Anestesiar al ratón y preparar una jeringa con aguja de insulina.Retirara la piel con los dedos.. tirar del rabo hacia atrás con la otra mano mientras se presiona hacia abajo en la nuca. centrifugar a 600xg 10 minutos. 5.Esterilizar con alcohol la zona de la línea media.Dejar coagular.Colocar el bazo en un pocillo con 1 ml de PBS.

7.Pinchar repetidas veces con una aguja. ganglios.Abrir las costillas con las pinzas. G.14.. 1. 3. dejar sedimentar los trozos de tejido no disgregado y transferir el líquido claro a un tubo limpio.. 8.. timo).Reemplazar con PBS limpio y repetir los pasos 4 a 6 hasta que solo quede la cápsula..Disgregación de tejidos linfoides (bazo. decantar y añadir 1ml de medio de cultivo... 5..Extraer el timo con las pinzas y colocado en un pocillo con 1ml de PBS.Limpiar de tejido graso y conectivo.Centrifugar a 400xg 5 minutos. 6.Presionar suavemente con el émbolo de una jeringuilla..Aspirar el líquido que baña la pieza y depositarlo en un tubo.. 4. 2..Cuando todo el líquido esté en el tubo.. .Depositar las piezas en pocillos o placas de petri pequeñas en las que previamente se ha añadido PBS estéril. 15.

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