EXTRACCIÓN DE SANGRE Y ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN. AISLAMIENTO DE LINFOCITOS.

1.- INTRODUCCIÓN En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio para la obtención de antisueros o complemento, para la generación de anticuerpos monoclonales o para la producción de líquido ascítico a partir de hibridomas. En esta práctica se aprenderán las técnicas básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en Inmunología. Se llevarán a cabo técnicas de inyección subcutánea e intraperitoneal, extracción de sangre del plexo axilar y mediante punción intracardiaca, extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a partir de estos tejidos sólidos. Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al animal, lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños innecesarios al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas y tenderán a morder instintivamente. 2.- OBJETIVOS Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: - Sujetar manualmente los ratones para ser correctamente inyectados, sin riesgo personal y sin dañar al animal. - Extraer sangre y preparar suero. - Anestesiar ratones por inhalación - Abrir el abdomen y extraer el bazo. - Localizar y extraer ganglios linfáticos. - Abrir el tórax y extraer el timo. - Disgregar los tejidos para obtener células viables. 3.- EQUIPAMIENTO - Ratones Swiss o similares adultos, no importa el sexo. - Material de disección: Guantes, tijeras, bisturí, pinzas, jeringuillas y agujas para insulina. - Vaso de precipitado de 1000 cc o recipiente de vidrio con tapa. - Tubo de 50 ml con tapa. - Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla. - Placas de cultivo de 24 pocillos. - Pipetas de 5-50 µl y 200-1000 µl y puntas. - Contenedor para material cortante. 4.- REACTIVOS

B. 4. Tapar y dejar evaporar dos minutos. 6. puede colocarse unos segundos en la cabeza del animal el tubo de 50 ml con el algodón humedecido en éter.... 3.. 1...Anestesiado por inhalación.Cuando se observe que el animal se tiende y su respiración es lenta y regular. D...Introducir al animal en el recipiente y tapar. . 4. 2. 1.Colocar al ratón ligeramente cabeza abajo.Con los dedos pulgar e índice de la otra mano agarrar por la piel de la nuca.Anestesiar al ratón. 5.Colocar al animal tumbado de espaldas sobre un secante y sujetar una pata.Etanol 70% . 1. C..Inyección intraperitoneal. 4...Introducir la aguja en el cuadrante inferior izquierdo (o derecho) del abdomen a un lado de la línea media.. 1.Sujetar por la piel del área interescapular con los dedos índice y pulgar.Situar al ratón sobre sus patas encima de un secante.. 5. Servirá para suplementar anestesia si se requiere más tarde.2 .Cargar la jeringuilla con el líquido a inyectar (2.Sacar al ratón de la jaula asiéndolo con una mano por la base del rabo y situarlo sobre la tapa para que se agarre a las barras. puede extraerse. 2....Inyectar con presión moderada.Eter dietílico anestésico ...Situar el rabo por detrás del dedo meñique para inmovilizar al ratón con una sola mano.Suero fisiológico 5... 7.Inyectar con presión moderada.5 ml de suero fisiológico) y expulsar el aire.Colocar un trozo grande de algodón en un vaso de precipitado y empapar ligeramente con éter dietílico (Evitar su inhalación directa. 8. Muy inflamable).Lavar el abdomen con etanol y dejar secar.. 3.MÉTODO A.Si se requiriera aplicar un suplemento anestésico durante las manipulaciones siguientes.Introducir la aguja bajo la piel entre los dedos. 2.Tampón PBS pH 7..5 ml de suero fisiológico) expulsar las burbujas de aire y dejar preparada.. 3..Inyección subcutánea.. 2.Extracción de sangre del plexo axilar. 5..Cargar una jeringuilla con la suspensión a inyectar (en nuestro caso 2.Preparar un tubo de 50 ml con un algodón humedecido en éter y guardar tapado.

6... con tijeras. 2. centrifugar a 600xg 10 minutos.Recoger la sangre con una pipeta y dispensarla en un tubo. 5. 2.Anestesiar al ratón y preparar una jeringa con aguja de insulina. .Tumbar al ratón de espaldas.Cortar por la línea media con tijeras.. 4.. timo y ganglios) 1.. 3. 4.Abrir el tórax mediante una incisión.. 6.Extracción de órganos linfoides (bazo. 5.Introducir despacio la aguja al tiempo que se extrae ligeramente el émbolo. 7.Diseccionar la región axilar y localizar algún ganglio linfático. centrifugar a 600xg 10 minutos.Depositar la sangre en un tubo..Introducir la aguja debajo y ligeramente a la derecha del cartílago xifoides (izquierda del animal) con una inclinación de 15-20 grados.Extracción de sangre por punción intracardiaca.Colocar al animal tumbado de espaldas..Retirar ligeramente la piel con unas pinzas y con el bisturí cortar los vasos. 9. 8..Colocarlo de espaldas sobre un papel secante. 4. 1.Con un bisturí cortar la piel de la zona del tórax cercana a la región axilar. F..Dejar coagular.. 11....Girar al animal para exponer su flanco izquierdo.. 5.Esterilizar con alcohol la zona de la línea media. Bazo: 6.. recoger el suero con una pipeta y transferir a un tubo eppendorf.Retirara la piel con los dedos..Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras. Añadir 1ml de PBS.. Mover la aguja hacia delante o atrás para extraer la máxima cantidad posible de sangre. E. tirar del rabo hacia atrás con la otra mano mientras se presiona hacia abajo en la nuca.. cruzando la nuca.. 7.Colocar el bazo en un pocillo con 1 ml de PBS... desde el xifoides hasta el cuello. depositar en un pocillo y limpiar de tejido graso y conectivo.La sangre entrará en la jeringuilla cuando la aguja penetre en el corazón.Extraer.Dejar coagular. cortando el tejido conectivo. quitando previamente la aguja para evitar hemólisis. Ganglios: 10. 3.3... recoger el suero con un pipeta y transferir a un tubo eppendorf.Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas. Timo: 12. 13. Aspirar lentamente hasta que el flujo de sangre pare...Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí detrás de las orejas.

. dejar sedimentar los trozos de tejido no disgregado y transferir el líquido claro a un tubo limpio. .. 1. 6..Cuando todo el líquido esté en el tubo.. G. 8. decantar y añadir 1ml de medio de cultivo... 5. 7.Reemplazar con PBS limpio y repetir los pasos 4 a 6 hasta que solo quede la cápsula. timo). 2.Abrir las costillas con las pinzas.14. 15.. 4.Pinchar repetidas veces con una aguja. ganglios..Centrifugar a 400xg 5 minutos.Limpiar de tejido graso y conectivo.Depositar las piezas en pocillos o placas de petri pequeñas en las que previamente se ha añadido PBS estéril.Presionar suavemente con el émbolo de una jeringuilla..Aspirar el líquido que baña la pieza y depositarlo en un tubo... 3.Extraer el timo con las pinzas y colocado en un pocillo con 1ml de PBS.Disgregación de tejidos linfoides (bazo.

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