Validacion de Métodos Ensayo - JC - Presentacion

VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
ENSAYO FISICOQUÍMICOS Y
MICROBIOLÓGICOS EN EL MARCO
DE LA NORMA ISO/IEC 17025:2017
Expositor: José Camero Jiménez

TEMARIO
1.REQUISITOS SOBRE VALIDACIÓN.

1. REQUISITOS DE LA ISO 17025:2017.
2. REQUISITOS DE DIRECTRIZ VALIDACIÓN INACAL.
2.PLANIFICACIÓN DE LA VALIDACIÓN.
3.DEFINICIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN.
4.DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOQUÍMICOS CUANTITATIVOS.
1. DETERMINACIÓN DE LA VERACIDAD.
2. DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN.
3. DETERMINACIÓN DE LA SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD.
4. DETERMINACIÓN DEL LDM Y LCM.
5. DETERMINACIÓN DE LA LINEALIDAD.
6. DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD.
7. DETERMINACIÓN DEL RANGO TRABAJO.
8. DETERMINACIÓN DE LA ROBUSTEZ.
9. DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE.
5.MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS DE RECUENTOS. MODELO DE POISSON. MODELO BINOMIAL
NEGATIVO.INDICE DE DISPERSIÓN
6.DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS DE

RECUENTOS.
1. DETERMINACIÓN DE LA VERACIDAD.
2. DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN.
3. DETERMINACIÓN DEL LDM Y LCM.
4. DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE.
TEMA 1:
REQUISITOS DE VALIDACIÓN
1. REQUISITOS DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
ISO/IEC MUNDIAL
17025:2017
DIRECTRIZ DE
PAÍS
VALIDACIÓN INACAL
PROCEDIMIENTO DE
VALIDACIÓN ORGANIZACIÓN
TEMA 1:
1.1 REQUISITOS DE LA ISO/IEC 17025:2017

TEMA 1:

TEMA 1:

TEMA 1:
1.2 DIRECTRIZ DE VALIDACIÓN DE INACAL

TEMA 1:

TEMA 1:

TEMA 1:

TEMA 1:

TEMA 2:
PLANIFICACIÓN DE LA VALIDACIÓN
Definir tipo
Definir Objetivo Definir parámetros
y frecuencia
Definir de validación
de verificación de Definir procedimiento
criterios
control de calidad operacional
de
de validación
revalidación 1
12 2
Preparar
11 3
procedimiento
rutina
PLANEAMIENTO DE 4
10
VALIDACION
Definir los
9 5 Ensayos de
validación
8 7 6
Ejecutar los
ensayos completos
Verificar
compatibilidad
Ajustar los de equipos
Caracterizar
parámetros Ejecutar ensayos
materiales
de validación preliminares
TEMA 3:
DEFINICIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN
Incertidumbre
Sensibilidad 9
7 Robustez
Rango de
Trabajo 6 8
2 4
Veracidad Linealidad
1 3 5
Precisión Selectividad / LDM y LCM

Especificidad
TEMA 3:
1. Veracidad:
Grado de concordancia existente entre el valor

medio obtenido de una gran serie de resultados y
un valor aceptado como referencia.
(ISO 5725 - 1)
2. Precisión:
Grado de coincidencia existente entre los

resultados independientes de un ensayo,
obtenidos en condiciones estipuladas.
(ISO 5725 - 1)
TEMA 3:
Exactitud:
Grado de concordancia existente entre el resultado

del ensayo y un valor aceptado de referencia.
(ISO 5725 - 1)
Veracidad
Exactitud
Precisión
TEMA 3:
VERACIDAD
- +
-
PRECISION
+
TEMA 3:
3. Selectividad/Especificidad:
Es el grado por el cual un método puede determinar un

analito particular dentro de una mezcla compleja, sin ser
interferido por otros componentes de la mezcla.
(EURACHEM – Guide The fitness for purpose of analytical
methods)
TEMA 3:
4. Límite de Detección del Método (LDM) y

Límite de Cuantificación del Método (LCM) :
4.1 LDM :
Es la menor cantidad de un analito en una muestra la cual

puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada
con un valor exacto.
methods)
4. Límite de Detección del Método (LDM) y

Límite de Cuantificación del Método (LCM) :
4.2 LCM :
Es la concentración mínima que puede determinarse con un

nivel aceptable de exactitud.

methods)
TEMA 3:
5. Linealidad:
Es la relación entre la concentración de analito y respuesta del

método. Esta relación, denominada comúnmente curva patrón o
curva de calibración. Define la capacidad del método para
obtener los resultados de la prueba proporcionales a la
concentración del analito.

methods)
6. Sensibilidad:
Es el cambio en la respuesta de un instrumento de medida

dividido por el cambio correspondiente en el estímulo.
(Text on validation of analytical procedures. ICH Harmonized

Tripartite Guideline)
TEMA 3:
7. Rango de Trabajo:
Es el intervalo entre la más alta y más baja concentración del

analito de la muestra, para la cual se ha demostrado que el
método analítico tiene un nivel apropiado de precisión, veracidad
y linealidad.
(Text on validation of analytical procedures. ICH Harmonized

Tripartite Guideline)
TEMA 3:
8. Robustez:
Es la medida de la resistencia de un método al cambio de

respuesta cuando se introducen pequeñas variaciones en el
procedimiento.

methods)
9. Incertidumbre:
Un parámetro asociado con el resultado de una medición,

que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser
atribuidos razonablemente al mensurando.
(EURACHEM – Cuantificación de la Incertidumbre en

Mediciones Analíticas )
TEMA 4:
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE
MÉTODOS FISICOQUÍMICOS CUANTITATIVOS
1. VERACIDAD:
1 CASO : Repeticiones en Muestra de Referencia 2 CASO : Repeticiones en Muestra en un método

Certificada (MRC) estandarizado y el método a validar.
3 CASO : Repeticiones en diferentes muestras de 4 CASO : Recuperaciones de muestras conocidas.

un método estandarizado y el método a validar.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
1 CASO : Repeticiones en Muestra de Referencia Certificada (MRC)
Repetición 1
MRC
Repetición 2
Repetición 3
Re p e tición 4
Se determina por : ...
• Prueba T-Student. Repetición n
• Prueba de Wilcoxon.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Determinación del número de repeticiones
( )
S a2
Condición:   t( n +t
2
u ref +
a− 1 , / 2 ) ( n a−1 ,  )
na
 :Sesgo del método  :Probabilidad de error tipo II
S a2 :Varianza de repetibilidad t : Factor de cobertura asociado a

del método una distribución t-Student.
 : Probabilidad de error tipo I na : Número de repeticiones.
u ref :Incertidumbre del material de referencia.

TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo con una
MRC de 866ppm de fierro
Determinación de Fierro en MRC con 866 ppm
Repeticiones ppm Repeticiones ppm Repeticiones ppm

1 863 11 851 21 858
2 849 12 849 22 858
3 856 13 864 23 869
4 868 14 865 24 864
5 861 15 856 25 871
6 860 16 862 26 868
7 872 17 860 27 856
8 878 18 848 28 869
9 853 19 864 29 872
10 868 20 862 30 875
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Norm al Pro bability Plot
.9 99
.99
PRUEBA DE NORMALIDAD
.95
.80
P r o b a b ility
.50
.20
.05
.01
.0 01
8 48 8 58 8 68 8 78
Fierro
Av era ge: 862.3 Anders on-D arlin gNorm alit y Tes t A
St D ev : 7. 91398 -S quare d:0. 201
N: 30 P-V alu e: 0.870

TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Prueba t- Student de una muestra
Test of mu = 866.00 vs mu not = 866.00
Variable N Mean StDev SE Mean T P

Fierro 30 862.30 7.91 1.44 -2.56 0.016
Conclusión: Los resultados de las repeticiones no son veraces al 95%

de confianza.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo

con una MRC de 8.4% de grasa
Determinación de %Grasa en MRC con 8.4%
Repeticiones %Grasa Repeticiones %Grasa Repeticiones %Grasa

1 8.57 11 8.21 21 8.35
2 8.58 12 8.53 22 8.29
3 8.54 13 8.55 23 8.45
4 8.22 14 8.28 24 8.31
5 8.27 15 8.48 25 8.21
6 8.53 16 8.22 26 8.52
7 8.46 17 8.22 27 8.56
8 8.46 18 8.4 28 8.57
9 8.27 19 8.22 29 8.36
10 8.39 20 8.38 30 8.23
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
N o r m a l P r o b a b ilit y P lo t
.9 9 9
.9 9
PRUEBA DE
.9 5
NORMALIDAD
.8 0
P ro b ab
.5 0
ility
.2 0
.0 5
.0 1
.0 0 1
8 .2 8 .3 8 .4 8 .5
% G ra s a
A v e ra g e : 8 . 3 8 7 6 7 A n d e rs o n -D a rlin g N o rm a lit y T e s t
S tD e v : 0.1 3 4 07 9 A - S q u a re d : 1 . 0 2 7
N : 30 P - V a lu e : 0 . 0 0 9
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Prueba Wilcoxon
Test of median = 8.400 versus median not = 8.400
N for Wilcoxon Estimated

N Test Statistic P Median
%Grasa 30 29 187.0 0.517 8.390
Conclusión: Los resultados de las repeticiones son veraces al 95% de

confianza.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
2 CASO : Repeticiones en Muestra en un método
estandarizado y el método a validar.
Método Estandarizado Método a Validar

Muestra
Repetición 1
Repetición 1
Repetición 2 Repetición 2
Repetición 3
Repetición 3
Repetición 4
Repetición 4 ...
... Repetición n
Repetición n
Se determina por :
• Prueba T-Student dos muestras.
• Prueba de Mann Whitney.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Determinación del número de repeticiones
Condición: (
  t( 2 n a− 2 , / 2 ) +t
( 2 n a− 2 ,  )
) 2 S a2
na
 :Sesgo del método  :Probabilidad de error tipo II
S a2 :Varianza de repetibilidad t : Factor de cobertura asociado a

del método una distribución t-Student.
 : Probabilidad de error tipo I na : Número de repeticiones.

TEMA 4:
1. VERACIDAD:

muestra no certificada analizada en 30 repeticiones por el método a validar y un
método estandarizado
Determinación de Fierro en ppm en muestra no certificada
Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan.
499 501 510 492 499 493
491 502 490 504 504 505
511 504 499 500 493 499
501 500 495 506 498 491
511 510 507 502 506 482
518 481 492 500 495 496
502 501 507 502 498 486
505 512 505 510 501 489
503 523 495 497 500 495
497 506 495 516 500 496
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
N o rm a l P ro b a b ilit y P lo t N o rm a l P ro b a b ility P lo t
.9 9 9 .999
.9 9 .9 9
.9 5 .9 5
.8 0
P r o b a b ility
.8 0
P r o b a b ility
.5 0
.5 0
.2 0
.2 0
.0 5
.0 5
.0 1
.0 1
.001
.0 0 1
4 80 4 85 490 495 500 505 510 515 520 5 25

4 90 500 510
MetS ta n
M e tV a l Av erage: 500.033 Anders on-D arlin g N orm ality Tes t
A v e ra g e : 5 0 0 . 9 A n d e rs o n -D a rlin g N o rm a lit y StD ev : 9.34947 A-Squared: 0.258
Te s t
S tD ev : 6.619 46 A -S q u a re d : 0 . 2 5 0 N : 30 P - V a lu e : 0 . 6 9 6
N:30 P -V a lu e : 0 . 7 2 3
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Two Sample T-Test and Confidence Interval
Two sample T for MetVal vs MetStan

N Mean StDev SE Mean
MetVal 30 500.90 6.62 1.2
MetStan 30 500.03 9.35 1.7
95% CI for mu MetVal - mu MetStan: ( -3.3, 5.1)

T-Test mu MetVal = mu MetStan (vs not =): T = 0.41 P = 0.68 DF = 58
Both use Pooled StDev = 8.10

confianza.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
N o rm a l P ro b a b ility P lo t N o rm a l P ro b a b ility P lo t
.999 .99 9
.9 9
.9 9
.9 5
.9 5
.8 0
.8 0
P r o b a b ility
P r o b a b ility
.5 0
.5 0
.2 0
.2 0
.0 5
.0 5
.0 1
.0 1
.00 1
.001
7.4 7.5 7 .6 7.7 7.8 7.4 7.5 7 .6 7.7 7.8
MetVal Me tS ta n
A v e ra g e : 7 . 5 8 7 3 3 A n d e rs o n -D a r lin g N o rm a lit y T e s t Av erage: 7.59667 Anders on-D arling N orm alit y Tes t A
StD ev : 0.111446 A -S q u a re d : 0 . 4 0 8 StD ev : 0.1 2126 7 -Squ are d: 0.801
N : 30 P -V a lu e : 0 . 3 2 6 N : 30 P - V a lu e : 0 . 0 3 4
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Mann-Whitney Confidence Interval and Test
MetVal N = 30 Median = 7.5700

MetStan N = 30 Median = 7.5550
Point estimate for ETA1-ETA2 is 0.0000
95.2 Percent CI for ETA1-ETA2 is (-0.0700,0.0600)
W = 910.0
Test of ETA1 = ETA2 vs ETA1 not = ETA2 is significant at 0.9470
The test is significant at 0.9469 (adjusted for ties)
Cannot reject at alpha = 0.05

confianza.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
3 CASO : Repeticiones en diferentes muestras de

un método estandarizado y el método a validar.
Método Método a
Estandarizado Validar
Muestra
1 Se determina por :
•Prueba T-Student de las
Muestra Repetición 2 Repetición 2
2 diferencias o Recta de
. Regresión.
.
•Prueba Wilcoxon de las
.
diferencias.
Muestra Repetición n Repetición n
n
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo con 30

muestras no certificada analizada en 1 repetición por el método a validar y un
método estandarizado
Determinación de un analito en ppm en 30 muestras no certificada
Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan. Met. Valid Met. Stan.
50 52 324 330 120 116
58 59 60 58 142 148
68 70 74 72 174 169
75 74 486 490 202 198
278 281 146 151 246 251
224 226 165 169 284 291
381 385 83 79 358 349
428 434 90 88 401 396
336 330 102 104 468 471
76 80 112 114 500 496
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
N o rm a l P ro b a b ilit y P lo t
.9 9 9
.9 9
.9 5
P r o b a b ility
.8 0
.5 0
.2 0
.0 5
.0 1
.0 0 1
-5 0 5
D ife re n c ia
A v e ra g e : -0 . 6 6 6 6 6 7 A n d e rs o n -D a rlin g N o rm a lit y T e s t A
S tD e v : 4.3 1 78 3 -S q u a re d : 0 . 8 0 5
N : 30 P -V a lu e : 0 . 0 3 3
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Wilcoxon Signed Rank Test
Test of median = 0.000000 versus median not = 0.000000
N for Wilcoxon Estimated

N Test Statistic P Median
Diferenc 30 30 188.5 0.371 -0.5000
Conclusión: Los resultados del método son veraces 95% de

confianza.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Asumiendo que las diferencias poseen distribución normal:
T-Test of the Mean
Test of mu = 0.000 vs mu not = 0.000
Variable N Mean StDev SE Mean T P

Diferenc 30 -0.667 4.318 0.788 -0.85 0.40
Conclusión: Los resultados del método son veraces 95% de

confianza.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
4 CASO : Recuperaciones de muestras conocidas.
Adiciones valores
conocidos (Patrón Recup. 1
primario)
MUESTRA Recup. 2
CONOCIDA
Recup. 3
R e cup.4
Se determina por :
. ..
• Prueba T-Student.
Recup. n
• Prueba de Wilcoxon.
• Tabla de recuperaciones esperadas.
TEMA 4:
1. VERACIDAD:
Tabla de recuperaciones esperadas
NordVal Protocol No. 2, Approved 26 May 2010 - Guide in Validation of

Alternative Proprietary Chemical Methods
TEMA 4:
2. PRECISIÓN:
1 CASO : Repeticiones en Muestra de Referencia 2 CASO : Repeticiones en Muestra en un método

Certificada (MRC) estandarizado y el método a validar.
TEMA 4:
2. PRECISIÓN:
1 CASO : Repeticiones en Muestra de Referencia

Certificada (MRC)
Repetición 1
MRC
Repetición 2
Repetición 3
Re p e tición 4
Se determina por : ...
• RSD de Horwitz. Repetición n
TEMA 4:
2. PRECISIÓN:
RSD experimental RSD Horwitz :


RSD =  100 % = 2 1 − 0 .5 log( Concentrac ión )
exp erimental RSD
x Horwitz
Es preciso si :
RSD exp erimental

 ( 0 .67 ) RSD Horwitz
TEMA 4:
2. PRECISIÓN:
MRC de 866ppm de fierro
Determinación de Fierro en MRC con 866 ppm
Repeticiones ppm Repeticiones ppm Repeticiones ppm

1 863 11 851 21 858
2 849 12 849 22 858
3 856 13 864 23 869
4 868 14 865 24 864
5 861 15 856 25 871
6 860 16 862 26 868
7 872 17 860 27 856
8 878 18 848 28 869
9 853 19 864 29 872
10 868 20 862 30 875
TEMA 4:
2. PRECISIÓN:
Desviación Estandar 7.91

Promedio 862.3
RSD experimental 0.918%
MRC 866
RSD Horwitz 3.9%
TEMA 4:
2. PRECISIÓN:
2 CASO : Repeticiones en Muestra en un método
estandarizado y el método a validar.
Método Estandarizado Método a Validar

Muestra
Repetición 1
Repetición 1
Repetición 3
Repetición 3
Repetición 4
Repetición 4 ...
... Repetición n
Repetición n
Se determina por :
• Prueba F.
• Prueba de Levene.
TEMA 4:
2. PRECISIÓN:
H o m o g e n e it y o f V a r ia n c e T e s t fo r R e s u lt a d o s
9 5 % C o n f id e n c e I n t e rv a ls f o r S ig m a s F a c t o r L e v e ls
F -T e
2
T e st S t a t i st i c : 1 . 9 9 5
5 6 7 8 9 10 11 12 13
P -V a lu e : 0 . 0 68
t L e v e n e 's T e
T e st S t a t i st i c : 1 . 6 2 6
2
P -V a lu e : 0 . 2 07
480 490 500 510 520
R e s u lt a d o s
TEMA 4:
2. PRECISIÓN:
Condiciones de Repetibilidad Condiciones de Reproducibilidad
Condiciones en las que un mismo operador

obtiene resultados de ensayo independientes con Condiciones en las que se obtiene resultados de
el mismo método en muestras idénticas en el ensayo con el mismo método en muestras idénticas,
mismo laboratorios y utilizando el mismo equipo con operadores diferentes y utilizando equipos
dentro de pequeños intervalos de tiempo. diferentes.
( ISO 5725-1, 3.14) ( ISO 5725-1, 3.18)
TEMA 4:
2. PRECISIÓN:
T1 =  T 2=  n IYI 
2
n IYI T3 = nI
 
2
T 4= nI T5 = ( n I − 1)S i2
T5
S r2 =
T3 − p
 T 2T 3 − T 1   T 3 ( p − 1) 
2
Sl 2
=  − S r 
2

− −
2
T
 3 ( p 1)  3 T T 4 
S = (S 2
+S2
R r L
TEMA 4:
3. ESPECIFICIDAD / SELECTIVIDAD:
3.1 ESPECIFICIDAD:
Se realiza muy frecuentemente en técnicas instrumentales como : espectrofotometría de UV o cromatografía
líquida. Por ejemplo para técnicas cromatográficas, se debe de comparar visualmente los cromatogramas en
los diferentes parámetros importantes como : resolución, retención relativa ( factor de separación), etc.
Espectro de una muestra Espectro de la solución

de Harina de Pescado de muestra de Harina de
con 500 ppm de pescado con 500 ppm de
Histamina. Histamina mas blanco
reactivo
TEMA 4:
3.2 SELECTIVIDAD:
Las interferencias pueden aumentar o reducir la señal. La prueba consiste en verificar que las interferencias
no afectan significativamente la señal.
TEMA 4:
Valores Esperados Valores Observados
+ Estándar 1
MRC Resultado 1
+ Estándar 2
MRC Resultado 2
MRC + Estándar 6 Resultado 6
MRC
+ Estándar 7 Resultado 7
TEMA 4:
Valores Esperados = Valores Observados
Se determina por :
• Prueba T para la
diferencias.
• Prueba Wilcoxon para
las diferencias.
• Prueba Chi - Cuadrado
TEMA 4:
Ejemplo .- Se leen concentraciones estándares de 50, 100, 150, 200, 250

adicionadas con blancos reactivos de un analito por absorción atómica. Estimar si
cumple la especificidad el método de ensayo.
Concentraciones G r á f ic a d e p r o b a b ilid a d d e D i
No rm a l
Esperado Observado
99
M e d ia 0.396
D e sv .E st. 1 .2 7 6
95 N 5
AD 0.259
50 49.8
90
V a lo r P 0.531
80
P o r c e n t a je
70
100 100.98 60
50
40
30
150 148.5 20
10
200 201.8
5
1
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
250 250.9 Di
TEMA 4:
T de una muestra: Di
Prueba de mu = 0 vs. no = 0
Error
estándar
de la
Variable N Media Desv.Est. media IC de 95% T P
Di 5 0.396 1.276 0.571 (-1.189, 1.981) 0.69 0.526
TEMA 4:
4. LDM y LCM:
Límite de Detección del
Blanco 1
Método
Blanco 2
LDM = x blan cos +t ( n − 1 , )  S blan cos
Blanco 3
Límite de Cuantificación del
Blanco 4 Método
Blanco 5 LCM = x blan cos + k  S blan cos
Blanco 6
Donde
Blanco 7
k = 5, 6 ó 10
TEMA 4:
5. LINEALIDAD:
X Y
Respuesta
Conc. 1
Equipo 1
Respuesta
Conc. 2
Equipo 2
Respuesta
Conc. 3
Equipo 3
Respuesta
Conc. 4
Equipo 4
Respuesta
Conc. 5
Equipo 5
TEMA 4:
5. LINEALIDAD:
Demostrar :
1. La relación entre
X e Y existe.
2. La relación sea
lineal.
3. Los residuos de
la regresión debe
estar libre de
tendencias.
TEMA 4:
5. LINEALIDAD:
1. La relación entre X e Y existe
Se determina por el coeficiente de correlación ( r ).

n
 (x i − x )( y i − y )
i =1
r =
n n
 (x i − x)  (y i − y)
2 2
i =1 i =1
El r para considerarlo adecuado debe ser mayor a 0.999

(Comité Nórdico de Alimentos – NMKL – Procedimiento de Validación)
TEMA 4:
5. LINEALIDAD:
2. La relación sea lineal.

•Demostrar en el análisis de varianza de
la regresión que los coeficientes lineales
son significativos.
a  0 Analysis of Variance
y Source DF SS MS F P
Regression 1 0.28417 0.28417 3091.96 0.000
b  0 Residual Error 4 0.00037 0.00009
Total 5 0.28453
TEMA 4:
5. LINEALIDAD:
3. Normalidad de los residuos.

D e s c r ip tiv e S ta tis tic s
V a ria b le : R e s id u o s
A n d e r s o n -D a rlin g N o rm a lit y T e s t A
-S q u a re d : 0 .15 3
P - V a lu e : 0.913
Mean 3 . 3 3 E -0 5
S tD ev 8 . 5 7 E -0 3
V a r ia n c e 7 . 3 5 E -0 5
Sk ewness 0.187499
K u rt o s is 0.454023
N 6
-0 . 0 1 0 -0 . 0 0 5 0.000 0.005 0.010 0.015
M in im u m -1 . 2 E -0 2
1 s t Q u a rt ile -6 . 3 E -0 3
M e d ia n -7 . 0 E -0 4
3 rd Q u a rt ile 7 . 1 5 E -0 3
M a x im u m 1 . 3 0 E -0 2
9 5 % C o n f id e n c e I n t e rv a l f o r M u
9 5 % C o n f id e n c e I n t e r v a l f o r M u
-9 . 0 E -0 3 9 . 0 3 E -0 3
- 0.0 1 0.00 0.01

9 5 % C o n f id e n c e I n t e r v a l f o r S ig m a
5 . 3 5 E -0 3 2 . 1 0 E -0 2
9 5 % C o n f id e n c e I n t e r v a l f o r M e d ia n
9 5 % C o n f id e n c e I n t e rv a l f o r M e d ia n
-9 . 4 E -0 3 1 . 0 2 E -0 2
TEMA 4:
5. LINEALIDAD:
Rango de Linealidad
Desde el LCM hasta la

máxima concentración
donde se ha demostrado
linealidad.
TEMA 4:
6. SENSIBILIDAD:
La sensibilidad es cuantificada mediante el coeficiente de sensibilidad que

es determinado de la siguiente manera :
 Re spuesta Y
Sensibilid ad = =
 Concentrac ión X
Siendo el coeficiente de sensibilidad la pendiente de la recta de calibración

( b ).
TEMA 4:
7. RANGO DE TRABAJO:
Desde el LCM hasta la máxima concentración donde se ha demostrado

exactitud.
TEMA 4:
8. ROBUSTEZ:
Se determina por :
• Prueba de Análisis de Varianza.
• Prueba de Youden - Steiner.
TEMA 4:
8. ROBUSTEZ:
• Prueba de Análisis de Varianza.
VARIA CIÓN G.L. SS MS F

ENTREGRUPOS k-1 SSA SSA/(k -1) MSA/M SE
DENTROGRUPOS E (n -1)k SSE SSE/k(n-1)
RROR
TOTAL kn-1 SST
F t a b u l a r = F ( k − 1 , k n − k , 1 −  )
Como el valor experimental de F es mayor que el tabular, podemos

concluir que al menos una de las variaciones influye en los resultados.
TEMA 4:
8. ROBUSTEZ:
•Prueba de Youden - Steiner.

Factores
Repeticiones A B C D E F G Resultados
1 + + + + + + + Y1
2 + + - + - - - Y2
3 + - + - + - - Y3
4 + - - - - + + Y4
5 - + + - - + - Y5
6 - + - - + - + Y6
7 - - + + - - + Y7
8 - - - + + + - Y8
TEMA 4:
8. ROBUSTEZ:
Los efectos de los factores se calculan de la siguiente manera:
Donde :
Efecto =
 Y A+ −  Y A −
= Y +Y +Y +Y
Y
A
4 A+ 1 2 3 4
= Y +Y +Y +Y
Y A− 5 6 7 8
El efecto es significativo si :
Efecto  2 .24 S
A r
TEMA 4:
8. ROBUSTEZ:
FACTORES DE VARIABILIDAD :
FACTOR A : Tiempo de Extracción

Estándar ( A ) 2 minutos
Variable ( a ) 1 minuto
FACTOR B : Tiempo para pasar el extracto a la columna

Estándar ( B ) Pasar el extracto el mismo día
Variable ( b ) Pasar el extracto 24 horas despues, refrigerándolo.
FACTOR C: Tipo de columna

Estándar ( C ) Columna en forma de tubo recto
Variable ( c ) Columna con dos diametros interiores
FACTOR D: Tiempo de Reacción de Derivatización

Estándar ( D ) 3.5 minutos
Variable ( d ) 4 minutos
FACTOR E: Tipo de lectura

Estándar ( E ) Lectura según método
Variable ( e ) Lectura despues de 1 hora expuesta a la luz.
TEMA 4:
8. ROBUSTEZ:
RESULTADOS DE LAS COMBINACIONES PARA EL ANALISIS DE ROBUSTEZ DE

YOUDEN STEINER
FACTOR 1 2 3 4 5 6 7 8
Aoa A a a A a A A a
Bob B B b b B b B b
Coc C C C c c C c c
Dod d D D D d d D d
Eoe E e E E E e e e
Resultado 988 966 972 980 982 966 978 968
Sr 9.93
TEMA 4:
9. INCERTIDUMBRE:
U = k
2
SR
Donde “k” se conoce como factor de cobertura y se

estima con el valor de 1.96, asumiendo una
distribución normal con un 95% de nivel de
confianza.
TEMA 5:
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS DE RECUENTOS. MODELO DE
POISSON. MODELO BINOMIAL NEGATIVO.INDICE DE DISPERSIÓN
TEMA 5:
TEMA 5:
TEMA 6:
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS DE RECUENTOS.
1. VERACIDAD
4 CASO : Recuperaciones de valores conocidos.

Método a
Validar
Muestra
Recuperación 1
Se determina por :
•Recuperación superior a
Recuperación 2
70% (referencia :Asociación de Industriales
Farmacéuticos Españoles)
.
.
.
Recuperación 3
TEMA 6:
2. PRECISIÓN
RSD experimental : Se determina 

de la siguiente manera: RSD exp erimental
=  100 %
x
RSD Horwitz : Se determina de la siguiente manera:
1 1
RSD Poisson
= RSD Binomial _ Negativa
= + u
2
c c
No es preciso si :
RSD exp erimental

 RSD Teórica
TEMA 6:
3. LDM
Límite de Detección del

Método
Poisson
1
LDM = Ln ( )
Po
Binomial Negativa
2
−
P o −1
LDM =
2
Muchas gracias
jose.camero@grupo-nv.com
"Sólo se puede enseñar a aquellos

que están dispuestos a aprender“
Javier Rueda (filósofo Inglés)

Validacion de Métodos Ensayo - JC - Presentacion

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VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE

Expositor: José Camero Jiménez

1.REQUISITOS SOBRE VALIDACIÓN.

6.DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS DE

1. REQUISITOS DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO

1.1 REQUISITOS DE LA ISO/IEC 17025:2017

1.1 REQUISITOS DE LA ISO/IEC 17025:2017

1.1 REQUISITOS DE LA ISO/IEC 17025:2017

1.2 DIRECTRIZ DE VALIDACIÓN DE INACAL

1.2 DIRECTRIZ DE VALIDACIÓN DE INACAL

1.2 DIRECTRIZ DE VALIDACIÓN DE INACAL

1.2 DIRECTRIZ DE VALIDACIÓN DE INACAL

1.2 DIRECTRIZ DE VALIDACIÓN DE INACAL

Precisión Selectividad / LDM y LCM

Grado de concordancia existente entre el valor

Grado de coincidencia existente entre los

Grado de concordancia existente entre el resultado

Es el grado por el cual un método puede determinar un

4. Límite de Detección del Método (LDM) y

Es la menor cantidad de un analito en una muestra la cual

4. Límite de Detección del Método (LDM) y

Es la concentración mínima que puede determinarse con un

(EURACHEM – Guide The fitness for purpose of analytical

Es la relación entre la concentración de analito y respuesta del

(EURACHEM – Guide The fitness for purpose of analytical

Es el cambio en la respuesta de un instrumento de medida

(Text on validation of analytical procedures. ICH Harmonized

Es el intervalo entre la más alta y más baja concentración del

(Text on validation of analytical procedures. ICH Harmonized

Es la medida de la resistencia de un método al cambio de

(EURACHEM – Guide The fitness for purpose of analytical

Un parámetro asociado con el resultado de una medición,

(EURACHEM – Cuantificación de la Incertidumbre en

1 CASO : Repeticiones en Muestra de Referencia 2 CASO : Repeticiones en Muestra en un método

3 CASO : Repeticiones en diferentes muestras de 4 CASO : Recuperaciones de muestras conocidas.

1 CASO : Repeticiones en Muestra de Referencia Certificada (MRC)

Determinación del número de repeticiones

 :Sesgo del método  :Probabilidad de error tipo II

S a2 :Varianza de repetibilidad t : Factor de cobertura asociado a

 : Probabilidad de error tipo I na : Número de repeticiones.

u ref :Incertidumbre del material de referencia.

Determinación de Fierro en MRC con 866 ppm

Repeticiones ppm Repeticiones ppm Repeticiones ppm

Norm al Pro bability Plot

St D ev : 7. 91398 -S quare d:0. 201

N: 30 P-V alu e: 0.870

Prueba t- Student de una muestra

Test of mu = 866.00 vs mu not = 866.00

Variable N Mean StDev SE Mean T P

Conclusión: Los resultados de las repeticiones no son veraces al 95%

Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo

Determinación de %Grasa en MRC con 8.4%

Repeticiones %Grasa Repeticiones %Grasa Repeticiones %Grasa

N for Wilcoxon Estimated

Conclusión: Los resultados de las repeticiones son veraces al 95% de

Método Estandarizado Método a Validar

Determinación del número de repeticiones

 :Sesgo del método  :Probabilidad de error tipo II

S a2 :Varianza de repetibilidad t : Factor de cobertura asociado a

 : Probabilidad de error tipo I na : Número de repeticiones.

Ejemplo: Determinar veracidad en los siguientes resultados de ensayo con una

Determinación de Fierro en ppm en muestra no certificada

4 80 4 85 490 495 500 505 510 515 520 5 25