Manual para la evaluación del desempeño de los medios de cultivo en el

laboratorio de microbiología de alimentos.

Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios.

Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.

Manual para la evaluación del

desempeño de los medios de cultivo en
el laboratorio de microbiología de
alimentos.
Ciudad de México.

2018

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laboratorio de microbiología de alimentos.

DIRECTORIO

SECRETARÍA DE SALUD

José Narro Robles

COMISIÓN FEDERAL PARA LA PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS

Julio Sánchez y Tepoz

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

Armida Zúñiga Estrada

DIRECCIÓN EJECUTIVA DE CONTROL ANALÍTICO

Imelda Rocío Guzmán Cervantes

DIRECCIÓN EJECUTIVA DE INNOVACIÓN

Josefina Gutiérrez Ramírez

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GRUPO DE TRABAJO QUE PARTICIPÓ EN LA REDACCIÓN DE ESTE MANUAL

Fabiola Castañeda – Coordinadora de Medios de Cultivo.

César Omar Gálvez González – Coordinador de Proyectos Analíticos.
Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.

Anastasio Palacios Marmolejo - Jefe de departamento de control microbiológico.

Laboratorio Estatal de Salud Pública de Aguascalientes

Mayra Liliana Robledo Ortiz - Responsable del área de preparación de medios de cultivo.
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Chiapas.

Magali del Carmen Carvajal Aguayo- Químico Analista

Laboratorio Estatal de Salud Pública de Campeche

María Fátima Trujillo Esquivel - Jefe del Laboratorio de Medios de Cultivo.

Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Guanajuato.

Maria de los Ángeles Miranda Uriostegui - Química analista

Laboratorio Estatal de Salud Pública de Guerrero "Dr. Galo Soberon y Parra"

Jose Manuel Acevedo Ariza- Analista de preparación de medios de cultivo.

Laboratorio Estatal de Salud Pública de Morelos.

Adriana Lorely Durham González – Responsable de preparación y control de calidad de medios de cultivo y cepario.
Laboratorio Estatal de Salud Pública de San Luis Potosí

Maria de los Angeles Sanz Salazar – Encargada del Laboratorio de Control de Medios de Cultivo y Cepario.
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sinaloa

Odilia Hernández Hernández - Jefa del departamento de Análisis Sanitarios

Nadia Karina Meza – Químico Analista.
Perla Yuridia Cárcamano Garcia – Jefa de Sección de Análisis Microbiológicos
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Veracruz.

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Esta edición fue preparada por la participación de los Laboratorios Estatales de Salud Pública, la
Coordinación de Medios de Cultivo de la Gerencia de Análisis y Desarrollo de Pruebas Microbiológicas de la
Dirección Ejecutiva de Control Analítico, por la Coordinación de Proyectos Analíticos de la Comisión de
Control Analítico y Ampliación de Cobertura. Este material podrá reproducirse íntegramente o parcialmente,
siempre que se dé crédito a la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura. Comisión Federal
para la Protección Contra Riesgos Sanitarios, Ciudad de México, México. 2018. Las denominaciones, marcas
y catálogos señalados en esta publicación son enunciados sólo como ejemplos y no implica que la Comisión
Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios, ni la Comisión de Control Analítico y Ampliación de
Cobertura, los apruebe o recomiende con preferencia a otros análogos. Salvo error u omisión, las
denominaciones de productos patentados son indicadas con el símbolo “(MR)” y su propiedad pertenece a
sus dueños. Los editores de esta publicación han adoptado todas las precauciones razonables para verificar
la información que figura en la presente publicación, no obstante lo cual, el material publicado se distribuye sin
garantía de ningún tipo, ni explícita ni implícita. El lector es responsable de la interpretación y el uso que haga
de ese material, y en ningún caso la Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios podrá ser
considerada responsable de daño alguno causado por su utilización.

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Contenido
INTRODUCCIÓN Y ALCANCE. .......................................................................................................................... 7
GLOSARIO ......................................................................................................................................................... 7
SECCIÓN I. Buenas Prácticas de Laboratorio para la preparación y control calidad de medios de cultivo. ...... 8
1. Áreas donde se elaboran y controlan medios de cultivo. ...................................................................... 8
2. Agua empleada en la elaboración de medios de cultivo. ....................................................................... 8
3. Pesado y rehidratación de medios de cultivo. ....................................................................................... 9
4. Medición de pH ...................................................................................................................................... 9
5. Envasado de los medios de cultivo preparados. ................................................................................... 9
6. Esterilización.......................................................................................................................................... 9
7. Almacenamiento y vida de anaquel de los medios de cultivo ................................................................ 9
8. Incubación de medios de cultivo .......................................................................................................... 10
SECCIÓN II. Recomendaciones generales para la preparación y uso de medios. .......................................... 11
1. Distribución de medios de cultivo. ....................................................................................................... 11
2. Fundido de agares ............................................................................................................................... 11
3. Preparación de medio sólido en placas Petri....................................................................................... 11
4. Preparación de placas para inoculación. ............................................................................................. 11
5. Trazabilidad ......................................................................................................................................... 11
6. Desecho de medios ............................................................................................................................. 11
SECCIÓN III. CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. ............................................................................... 12
1. Muestreo .............................................................................................................................................. 12
2. Evaluación Física................................................................................................................................. 12
3. Prueba de esterilidad. .......................................................................................................................... 12
4. Determinación de pH. .......................................................................................................................... 12
SECCIÓN IV. CRITERIOS PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO. ........... 13
1. Criterios de selección del método de evaluación de medios de cultivo. .............................................. 13
2. Frecuencia de la evaluación del desempeño....................................................................................... 13
3. Evaluación de vida de anaquel. ........................................................................................................... 15
4. Condiciones de incubación. ................................................................................................................. 15
SECCIÓN V. MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO. ............... 16
1. Preparación y cuantificación del inóculo. ............................................................................................. 16
2. Medios Sólidos para pruebas Cuantitativas......................................................................................... 17
Coeficiente de productividad .................................................................................................................... 17
Factor de selectividad. ............................................................................................................................. 17

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3. Medios Sólidos para Pruebas Cualitativas .......................................................................................... 19

Prueba de productividad y especificidad .................................................................................................. 19
Prueba de selectividad. ............................................................................................................................ 19
4. Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método Cuantitativo. ................................. 20
Productividad ........................................................................................................................................... 20
Selectividad .............................................................................................................................................. 20
5. Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método cualitativo para los medios líquidos
selectivos...................................................................................................................................................... 22
Productividad: .......................................................................................................................................... 22
Selectividad: ............................................................................................................................................. 22
6. Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método cualitativo por turbidez. ................ 23
Medios de pre-enriquecimiento ................................................................................................................ 23
Medio de confirmación ............................................................................................................................. 23
7. Método para la evaluación del desempeño de diluyentes. .................................................................. 24
8. Evaluación de desempeño de los medios de cultivo que se utilizan en los métodos de V. cholerae y V.
parahaemolyticus. ........................................................................................................................................ 25
Método para la evaluación de los Caldos triptona (T1Nx)........................................................................ 25
Método para la evaluación de los Agares T1Nx....................................................................................... 25
9. Guía para la elaboración del “Procedimiento de Preparación del Medio de Referencia (PMR)”. ........ 26
Formulación del medio de cultivo de referencia. ...................................................................................... 26
Preparación .............................................................................................................................................. 26
Control de Medio de Cultivo de Referencia.............................................................................................. 27
Bibliografía. ....................................................................................................................................................... 28
Anexo I. Evaluación del desempeño de los medios de cultivo que no están presentes en los anexos ISO. .... 29

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INTRODUCCIÓN Y ALCANCE.
Este Manual está destinado a los laboratorios que realizan análisis microbiológicos de alimentos, en particular
para aquellos que siguen los métodos de análisis descritos en las Normas Oficiales Mexicanas publicadas por
la Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios, en particular la NOM-210-SSA1-2014,
“Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores.
Determinación de microorganismos patógenos”.

El contenido de este Manual describe los requisitos establecidos en el punto 7 de la norma NOM-210-SSA1-
2014.

GLOSARIO
Especificidad. Es la demostración de la capacidad de un medio de cultivo que permite que los
microorganismos no blancos, no muestren las mismas características del
microorganismo blanco.
Materiales de Sustancia o material cuyas propiedades, o al menos una de ellas, son
Referencia (MR). suficientemente estables para ser usados en la evaluación de métodos de medición
o para caracterizar otros materiales. Para fines de este procedimiento, se considera
un material de referencia a las cepas con certificado provenientes de colecciones
reconocidas.
Medio de cultivo de Medio de cultivo no selectivo para la evaluación comparativa del desempeño
referencia. (control) independiente del medio de cultivo a probar, con el objetivo de demostrar,
que es adecuado para su uso. Este medio de cultivo debe asegurar, que tiene una
calidad alta y consistente, su evaluación debe hacerse con inóculo cuantificado y
caracterizado, se recomienda el uso de Materiales de Referencia (MR). Para su
preparación debe emplearse un procedimiento específico, en el que se detalle,
marca de medio/ingredientes. El medio de cultivo de referencia, generalmente es un
medio de cultivo sin inhibidor como el Agar soya tripticasa (AST).
Método de prueba. Procedimiento definitivo que produce un resultado de una prueba, que incluyen la
identificación, medición y evaluación de una o más cualidades, características o
propiedades.
Microorganismo Microorganismo de interés, aquel microorganismo para el cual fue diseñado el
blanco: método o el microorganismo que se pretende recuperar o identificar.
Microorganismo no Microorganismos seleccionados para demostrar la capacidad del medio para impedir
blanco: el crecimiento de microorganismos diferentes al microorganismo blanco.
Productividad. Es la capacidad de los medios de cultivo para recuperar a un microorganismo blanco
en condiciones de incubación específicas.
Selectividad. Es la capacidad de un medio de cultivo selectivo, para inhibir el desarrollo de los
microorganismos no-blancos.
Temperatura Según la NOM-210-SSA1-2014. Punto 3.22 la temperatura Ambiental: a la que
ambiente oscila entre 18 °C y 27 °C.

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SECCIÓN I. Buenas Prácticas de Laboratorio para la preparación y control calidad de medios de

cultivo.
El laboratorio de evaluación de medios de cultivo debe cumplir con las Buenas Prácticas de Laboratorio.

Los medios de cultivo deshidratados son mezclas de sustancias higroscópicas, sensibles a la humedad, el
calor y la luz. A pesar de que el envase de los medios deshidratados está protegido contra la luz y la
humedad, el almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas indicadas en los frascos para
conservar sus propiedades iniciales. Se debe evitar en la medida de lo posible, los cambios bruscos de
temperatura y una vez abiertos, es necesario mantenerlo cerrado para protegerlo de la hidratación. El polvo
de los medios de cultivo deshidratados debe ser homogéneo y deben tener el color inicial indicado para cada
medio. Se debe descartar el medio si hay algún cambio de la apariencia física o indicios de humedad en el
contenedor.

El material que se utilice en el laboratorio debe estar limpio, la evaluación debe estar documentada y
realizada siguiendo un procedimiento interno.

1. Áreas donde se elaboran y controlan Revisar los resultados de la prueba de esterilidad

medios de cultivo.
El área donde se realice el control de calidad debe
estar separada del área de preparación lo cual
puede lograrse con cubículos independientes al
interior del área.
Se deberá contar con procedimientos de limpieza
y sanitización de las áreas de trabajo en los que
se considere un programa de rotación de
sanitizantes. Se deben mantener registros de la
limpieza, desinfección y monitoreo de partículas
viables del área.
de los medios de cultivo, para detectar lotes de
medios de cultivo afectados.
2. Agua empleada en la elaboración de
medios de cultivo.
Para la preparación de medios de cultivo, usar
solo agua destilada, desmineralizada o
desionizada producida por ósmosis inversa, o
calidad equivalente, libre de sustancias inhibitorias
o que puedan influenciar el crecimiento de
microorganismos, por ejemplo, trazas de cloro,
amonio y metales pesados.

El monitoreo de partículas viables no debe
rebasar de 15 UFC/placa expuesta por 15 minutos
de exposición de una placa de agar soya tripticasa
o agar peptona-glucosa extracto de levadura.
Realizar el monitoreo al menos quincenalmente.
Para Módulos de Flujo Laminar el monitoreo
debe realizarse durante la operación o al menos
cada semana, la especificación es de <1 UFC/
placa durante no menos de 15 min de exposición.
Se recomienda que el agua se use tan pronto
como sea producida, el agua no deberá usarse
después de 24h.
La calidad microbiológica del agua con la que se
preparen los medios de cultivo deberá cumplir con
los siguientes criterios:
● Límite de Alerta 100 UFC/mL
● Límite de Acción 1000 UFC/mL

Cuando no se cumplan los criterios de monitoreo
ambiental, se deberá considerar lo siguiente:
Realizar limpieza y sanitización exhaustiva y
repetir el monitoreo.
La conductividad debe ser menor a 2.0 μ S/cm a
25 °C o mayor de 0.5 megaΩ-cm (resistividad).
La cual se debe medir antes de su uso.

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3. Pesado y rehidratación de medios de
cultivo.
Leer cuidadosamente la etiqueta o la fórmula del
medio y pesar la cantidad indicada en una balanza
con un error permisible de hasta +/- 0.1% del peso
a medir y una sensibilidad de 0.1 g.
Colocar la mitad del volumen de agua a preparar
en un contenedor de al menos el doble del
volumen solicitado.
Adicionar el polvo y mezclar. Dejar reposar de 10
a 15 minutos para su completa humectación. Se
puede utilizar un agitador magnético. Adicionar el
resto de agua y mezclar procurando que el resto
del polvo adherido a las paredes del recipiente, se
resbale e integre al resto del medio
Calentar con agitación continua, en el caso de los
medios con agar es necesario alcanzar la
ebullición para asegurar su completa disolución,
evitando que el medio se derrame o se pegue al
recipiente por calentamiento excesivo. La
disolución total se reconoce cuando al agitar el
medio no se adhieren partículas en las paredes y
el medio es transparente.
Todo medio es sensible al calentamiento, por ese
motivo no debe calentarse más de lo necesario.
4. Medición de pH
En general los medios deben tener una variación
de ± 0.2 unidades de pH después de la
esterilización.
Medir el pH del medio con un potenciómetro
previamente calibrado y verificado antes de su
uso.
Los medios y las soluciones de referencia deben
estar a temperatura ambiente, ya que de lo
contrario las lecturas serán imprecisas.
Los medios comercialmente fabricados pueden
mostrar cambios significativos de pH antes y
después de la esterilización. Sin embargo, si la
calidad del agua utilizada en su preparación es la
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adecuada, los ajustes de pH antes de la
esterilización no son necesarios.
5. Envasado de los medios de cultivo
preparados.
Envasar en tubos, frascos o matraces la cantidad
necesaria del medio de cultivo limitando el
volumen a las ¾ partes de la capacidad del
recipiente.
6. Esterilización
Esterilizar el medio el día de su preparación.
Para la esterilización seguir las instrucciones de
preparación de la etiqueta del medio de cultivo.
Se recomienda que los medios se esterilizen en
volúmenes no mayores a un litro. Se debe tener
atención a lo señalado en el punto 6.6 de la NOM-
210-SSA1-2014.
Después del calentamiento, es necesario que el
medio se enfríe de tal manera que se prevenga el
sobrecalentamiento. Esto es particularmente
importante para medios con contenido de
azúcares, ya que puede producir oscurecimiento
del medio de cultivo (Reacción de Maillard).
7. Almacenamiento y vida de anaquel de los
medios de cultivo
Una vez que se prepara un medio de cultivo se
debe considerar que su vida de anaquel es
diferente de acuerdo al tipo de medio. Se deben
verificar y documentar las condiciones de
almacenamiento, cada laboratorio debe
especificar y justificar estas condiciones.
Medios preparados comercialmente disponibles:
Seguir las instrucciones del fabricante sobre las
condiciones de almacenamiento, fecha de
caducidad y uso.
Medios preparados por el laboratorio: Si los
medios se refrigeran no se deben almacenar por
más de 2 a 4 semanas para placas y de 3 a 6
meses en botellas y tubos cerrados, a menos que
se especifique otra cosa en las normas y/o por el
fabricante. Si el laboratorio requiere aumentar el
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laboratorio de microbiología de alimentos.

tiempo de almacenamiento se deberá realizar un Alternativamente se puede usar algún sistema de

protocolo para evaluar la vida de anaquel de cada identificación documentado.
medio.
8. Incubación de medios de cultivo
Almacenamiento de medios en cajas Petri: En
Incubar en pilas de hasta 6 cajas para permitir una
general no se recomienda un almacenamiento
buena penetración del calor sin pérdida de
prolongado de los medios de cultivo, estos deben
humedad.
utilizarse inmediatamente o almacenar las placas
invertidas en refrigeración y condiciones que Adicionalmente la humedad en incubadoras de
prevengan el deterioro, deshidratación y convección, puede incrementarse colocando un
apartadas de la luz. Los medios deben contenedor de agua en el fondo de la incubadora.
almacenarse dentro de contenedores como bolsas El agua debe ser cambiada y los contenedores
de plástico, papel o celofán. desinfectarlos frecuentemente para evitar
contaminación por hongos.
La refrigeración favorece la deshidratación del
medio por lo que antes de su uso se debe Durante la incubación, el agar puede perder
observar si existe evidencia de deshidratación. humedad, bajo algunas circunstancias esto puede
afectar el crecimiento de los microorganismos. Los
Se debe evitar el agua de condensación ya que el
factores que pueden influenciar en la pérdida de
depósito de gotas puede causar la alteración del
agua, es la cantidad de medio en la placa, el tipo
medio, para minimizar las placas deben ser
de incubadora (si está equipado con ventiladores),
templadas antes de ser colocadas en bolsas.
la humedad de la atmósfera en la incubadora, la
Almacenar hasta que no se observe agua de
posición, el número de placas y la temperatura de
condensación.
incubación.
Etiquetar las placas en la base o en el canto con
la identificación incluyendo fecha de caducidad.

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SECCIÓN II. Recomendaciones generales para la preparación y uso de medios.

1. Distribución de medios de cultivo.
La distribución de los medios después de la
Permitir que el agar se enfríe y se solidifique
esterilización debe realizarse bajo flujo de aire
colocando las placas con las tapas puestas en
unidireccional para minimizar la posibilidad de
una superficie horizontal y fría.
contaminación ambiental. Esto debe considerarse
como un requisito mínimo para los medios que se 4. Preparación de placas para inoculación.
usan en ensayos de productos estériles, e incluye
el enfriamiento de los medios, ya que las tapas de Al solidificar el agar permitir el secado colocando
los envases necesitarán ser retiradas durante el las placas destapadas en un Módulo de flujo
enfriamiento para prevenir la condensación. laminar por 30 a 60 minutos o toda la noche a
temperatura ambiente con las tapas en su lugar,
2. Fundido de agares se debe tener especial cuidado que la superficie
sea horizontal. No se deben mover las placas
Fundir el medio en baño de agua hirviendo o
hasta que solidifiquen. Se debe tener la
cualquier otro proceso por el que se obtengan
precaución de evitar la formación de burbujas en
resultados idénticos, como el vapor fluyente a
la superficie del agar. Una vez que las placas
través de la autoclave. Nunca fundir el agar más
están solidificadas mantener en posición invertida.
de una vez.
Antes de la inoculación en medio de cultivo sólido
Se debe evitar sobrecalentamiento de los medios
en superficie, se debe verificar que la superficie
de cultivo. Una vez fundidos retirar de la fuente de
del agar esté seca, esto puede lograrse
calor. Colocar el matraz a temperatura ambiente
colocándolas con el agar hacia abajo y las tapas
por 2 minutos antes de colocarlo en baño de agua
abiertas a una temperatura entre 25 °C y 50 °C.
con temperatura controlada entre 44 °C y 47 °C.
El tiempo necesario para alcanzar esta
5. Trazabilidad
temperatura depende del tipo de medio, del
volumen y del número de unidades en el baño. El Documentar cada una de las etapas, desde la
medio fundido se debe usar tan pronto como sea recepción de los medios deshidratados,
posible y no usarse después de 4 horas incluyendo equipos, cepas utilizadas, resultados
de crecimiento de cepas, etc., hasta el desecho de
Nunca fundir el agar más de una vez. los mismos.

3. Preparación de medio de cultico en 6. Desecho de medios

placas Petri.
Vaciar el agar fundido en caja Petri hasta obtener
al menos 3 mm de espesor (para cajas Petri de 90
mm de diámetro, normalmente se requiere de 18 a
20 ml de agar) .
Medios contaminados o no usados, se deben
desechar de acuerdo con lo descrito en la Norma
Oficial Mexicana, NOM-087-SEMARNAT-SSA1-
2002. Protección ambiental-Salud ambiental-
residuos peligrosos –biológico infecciosos-
Clasificación y especificaciones de manejo.

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laboratorio de microbiología de alimentos.
SECCIÓN III. CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
1. Muestreo
La cantidad de muestras a seleccionar para
realizar las pruebas de control de calidad y
evaluación de desempeño, debe ser por lo menos
el 5% (FAO) o lo indicado en otra norma de
muestreo para completar todas las
determinaciones.
2. Evaluación Física.
En cada lote de medio de cultivo preparado por el
laboratorio, se deberá verificar en forma visual la
apariencia y el color característico, en los caldos
no debe haber turbiedad o material precipitado. En
el caso de medios de cultivo con dextrosa, se
debe tener en cuenta que el sobre calentamiento
de los medios produce una reacción de Maillard,
es decir oscurecimiento del medio por
sobrecalentamiento.
Los agares deben tener una consistencia firme, de
color característico y no presentar agua de
condensación.
En general el volumen de medio de cultivo
dosificado en placas Petri, debe ser de
aproximadamente de 20 - 25 mL para evitar la
rápida deshidratación del medio, favorecer su uso
y cumplir con los requisitos del método de prueba.
Los volúmenes de los medios líquidos que se
utilicen para realizar diluciones de métodos
cuantitativos deberán verificarse con una probeta.
Registrar datos en el formato correspondiente.
3. Prueba de esterilidad.
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Un adecuado control de calidad depende del
tamaño del lote del medio de cultivo. El criterio de
aceptación debe estar escrito y justificado.
Incubar el medio a las condiciones de incubación
que indique el método de prueba. Observar si los
medios presentan algún signo de contaminación o
cambio en su evaluación física. Cuando exista
duda en la interpretación de contaminación, se
deberán realizar resiembras a medios no
selectivos como AST, para descartar el desarrollo
microbiano. Descartar el lote si está contaminado.
Mantener registros.
4. Determinación de pH.
El pH de los medios de cultivo sólidos debe ser
medido utilizando un electrodo plano, el uso de
otros electrodos diseñados para la lectura de pH
en medios líquidos pueden no ser adecuados
debido a que los iones H+ no migran fácilmente
del medio sólido a través de la membrana, cuando
no se disponga de electrodos planos, otros
electrodos pueden ser utilizados siempre que se
tomen precauciones para evitar errores en la
medición o daños al electrodo
Determinar el pH en los medios de cultivo
preparados con un potenciómetro calibrado como
lo describe el procedimiento o instructivo del
equipo. Registrar los resultados. Los cuales deben
estar dentro del intervalo indicado en el marbete
del medio. Descartar el lote si no se cumple con
esta determinación. Mantener registros.
Realizar la medición del pH, cuando el medio de
cultivo ha alcanzado la temperatura ambiente.
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SECCIÓN IV. CRITERIOS PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO.
1. Criterios de selección del método de
evaluación de medios de cultivo.
La evaluación del desempeño que se realice a un
medio de cultivo deberá considerar los siguientes
puntos:
● El propósito de uso, es decir, si el medio
de cultivo va a ser utilizado en pruebas
cuantitativas, cualitativas o ambas, diluyente,
medio de transporte, etc.
● Cuando se realice un cambio de marca o
se empiece el uso de un nuevo medio de cultivo,
debe hacerse la evaluación del desempeño por
métodos cuantitativos, con el propósito de contar
con más información que soporte el cambio.
2. Frecuencia de la evaluación del
desempeño.
La frecuencia de la evaluación del desempeño no
debe ser considerada como una política
inamovible, esta frecuencia debe ser modificada
cuando hay algún cambio en el sistema del
laboratorio, por ejemplo cuando se cambia de
marca, o las alertas del equipo de agua se
activan, también debe considerar el nivel de
aseguramiento de calidad del laboratorio, por lo
que se deberá tener en cuenta todos los aspectos
de aseguramiento incluyendo:
● Calificación del personal,
● Equipo adecuado (uso de autoclaves),
● Equipos calificados,
● Instrumentos calibrados/verificados,
● Equipos de producción de agua,
● Controles ambientales,
● Calidad comprobada de la marca de
medios de cultivo empleados.
Cuando el aseguramiento de calidad en el
laboratorio no sea tan estricto como lo indicado en
el párrafo anterior se debería realizar la
evaluación de desempeño a cada lote de medio
de cultivo. Esta decisión o el cambio en la
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frecuencia debe ser documentada por el
laboratorio.
Si considerando lo anterior se cuenta con un alto
nivel de aseguramiento, la frecuencia puede ser
en cada lote de polvo o cada determinado número
de lotes de medio de cultivo preparado. Esta
decisión debe ser documentada por el laboratorio.
Cuando se tenga evidencia de modificación o
alteración de los sistemas del laboratorio, por
ejemplo: resultados atípicos en la evaluación de
desempeño de los medios de cultivo, problemas
en el sistema de producción de agua, cambio de
marca de los medios de cultivo se deberá
aumentar la frecuencia de la evaluación de
desempeño de los medios de cultivo.
Se pueden distinguir tres niveles de evaluación del
desempeño:
Para medios de referencia. Para la evaluación
de estos medios de cultivo, se deberá hacer una
evaluación usando métodos cuantitativos y las
cepas descritas en los anexos E y F de la norma
ISO 11133, adicionalmente deben evaluarse por
métodos cualitativos cada uno de los
microorganismos de prueba que serán utilizados
en la evaluación del desempeño de los medios,
siempre que estén disponibles utilizar materiales
de referencia.
Evaluación inicial. Esta deberá realizarse
utilizando preferentemente métodos cuantitativos,
cuando se esté iniciando la evaluación de un
medio de cultivo, o cuando se realicen cambios de
marca y dependiendo del nivel de aseguramiento
en el laboratorio, cada laboratorio deberá justificar
la frecuencia con la que realizará esta evaluación,
la cual puede hacerse con el cambio de lote del
fabricante, con la apertura de cada frasco, a la
recepción de una remesa de medio de cultivo,
cada determinado número de lotes de
preparación, etc.
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laboratorio de microbiología de alimentos.

Evaluación rutinaria.

Medios sólidos para Medios Solidos para

Medios líquidos
pruebas cuantitativas pruebas cualitativas

Coeficiente de productividad

Prueba de productividad y

Método para diluyentes

Prueba de selectividad

Método cualitativo por

Factor de selectividad

Método cuantitativo

Método cualitativo
especificad

turbidez
Medios sólidos para pruebas
  1
cuantitativas
Medios sólidos para pruebas
 
cualitativas
Caldos para NMP por

ejemplo CMM, CLT
Caldos Selectivos por

ejemplo RVS, MKTTn, Fraser
Caldos no selectivos por

ejemplo CL
Diluyentes por ejemplo

buffer de fosfatos

1De acuerdo a lo indicado en la Norma de referencia, algunos medios de cultivo como RVA o ABP requieren que
adicionalmente se determine la prueba de especificidad.

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El grado de humedad en el medio de cultivo es

3. Evaluación de vida de anaquel.
La vida de anaquel para el almacenamiento de los
medios, debe ser verificada cada determinado
número de lotes preparados, se deben revisar al
menos las siguientes características:
 Color
 Humedad
 pH
 Volumen
 Presencia de precipitados o flóculos
 Evaluación de desempeño
La fecha de caducidad debe estar basada en el
tiempo en el cual, todas las características
descritas continúen siendo aceptables.
importante para un óptimo crecimiento de las
bacterias, esta depende de las condiciones sobre
y dentro del medio de cultivo. Una excesiva
pérdida de humedad, puede incrementar las
concentraciones de inhibidores en medios de
cultivo selectivos y reducir el crecimiento en la
superficie del medio. La pérdida de humedad
puede observarse a simple vista como cambio de
color del medio, perdida del brillo y la aparición de
cuarteaduras entre el medio de cultivo y la placa
de agar.
4. Condiciones de incubación.
Las condiciones de incubación para la evaluación
del desempeño de los medios de cultivo, deben
ser las indicadas en los métodos de prueba en el
cual se usa el medio a ser evaluado.

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laboratorio de microbiología de alimentos.

SECCIÓN V. MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO.

1. Preparación y cuantificación del inóculo.

Alternativamente a lo indicado en este numeral se pueden usar métodos nefelométricos o
espectrofotométricos para el ajuste del inóculo de las cepas. En caso de cepas liofilizadas, seguir las
instrucciones de uso del fabricante.

En general para cada una de las cepas control, realizar lo siguiente:

 A partir de los cultivos desarrollados en agar soya tripticasa (AST) de 24 horas a 34 °C entre 38 °C
+/- 1 °C, transferir una colonia a 10 mL de caldo BHI incubar 18 horas a 35 °C 36 °C +/- 1 °C.
 Tomar 1 mL del cultivo anterior y realizar diluciones decimales en 9 mL de solución peptona salina,
(10-1 – 10-10), hasta obtener una densidad microbiana de entre 100 y 150 UFC / mL.
 Sembrar 1 mL de las diluciones apropiadas para obtener el inóculo deseado por vaciado en placa en
AST o tomar 0.1 mL y sembrarlo por extensión en placa en AST por duplicado.
 Incubar las cajas invertidas a entre 34 °C y 38 °C durante 24 horas. Contar las colonias para
establecer en qué dilución se encuentra el inóculo deseado.
 Realizar este procedimiento varias veces hasta obtener resultados repetibles. Una vez establecida la
dilución, inocular el medio de cultivo a probar incubando bajo las condiciones establecidas en el
método.

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2. Medios Sólidos para pruebas Cuantitativas
Coeficiente de productividad
Seleccionar dos placas sin agua de condensación
del medio a probar y 2 placas del medio de
referencia. Inocular por separado 1 mL de cada
suspensión de los microorganismos de prueba
(Seleccionar los microorganismos de prueba
indicados en los anexos E y F de la ISO 11133, y
preparar una suspensión de microorganismo
como se indica en 9 en concentración adecuada
de menos de 100 UFC del microorganismo
blanco.) y sembrar por duplicado el medio de
referencia y el medio a probar, inoculando 1 mL si
es por vaciado en placa, o bien, 0.1 mL si es por
extensión. Incubar en las condiciones de prueba.
Contar las colonias y reportar el promedio en cada
medio de cultivo. Aplicar la siguiente fórmula:
Cálculo del Coeficiente de productividad
PR = (Ns / No)
Dónde:
PR = Coeficiente de productividad
Ns = Es la cuenta total obtenida del medio de
cultivo a probar
No = Es la cuenta total obtenida del medio de
referencia y debe ser entre 80 y 120 UFC / mL
Interpretación de resultados
 Para agares no selectivos: se considera
aceptable si el coeficiente de productividad es
de ≥ 0.7.
 Para agares selectivos: se considera
aceptable si el coeficiente de productividad es
de ≥ 0.5.
 Cuando se supere un PR de 1.4 se deberá
investigar la causa de este resultado.
Factor de selectividad.
Para esta evaluación, inocular por duplicado todas
las diluciones desde 10-1 hasta una dilución más
de la que se cuentan no más de 150, de
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microorganismo no blanco en el medio selectivo a
evaluar y el medio no selectivo de referencia,
incubar en las condiciones de prueba y calcular el
factor de selectividad Fs mediante la siguiente
fórmula:
Cálculo del Factor de selectividad
Fs=Do-Ds
Dónde:
Fs = es el factor de selectividad.
Do = es la dilución más alta que muestra
desarrollo en un medio no selectivo de referencia.
Ds = es la dilución más alta en el medio de prueba
que muestra desarrollo comparable con el medio
de referencia.
Fs, Do y Ds son expresados en unidades
logarítmicas base 10 (log)
Interpretación de los resultados
El factor de selección debe ser de por lo menos 2
cuando se inocula el microorganismo no blanco.
Cuando no se encuentre crecimiento del
microorganismo no blanco en ninguna de las
diluciones se deberá reportar como inhibición
total.
Criterios de Validez.
Los resultados serán aceptados como válidos si
se cumplen las siguientes condiciones:
Los duplicados de cada dilución del
microorganismo de prueba, deben tener
crecimiento en ambas placas.
Cada concentración individual de los
microorganismos de prueba, se debe encontrar
dentro del intervalo de lectura para el análisis (por
ejemplo hasta 100 colonias para método por
filtración, hasta 150 colonias para método de
siembra en superficie y vaciado en placa).
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Ejemplo:

Evaluación del desempeño de Agar rojo violeta bilis: Preparar un inóculo de entre 80 y 120 UFC de
Escherichia coli (microorganismo blanco), como lo indica el inciso "Preparación y cuantificación del
inóculo". Inocular con 1mL cuatro placas, verter por separado a dos placas ARVB y a dos placas el
medio de referencia AST. Homogeneizar e incubar a 35 °C por 24 h +/- 2 h. Contar las colonias y
hacer el cálculo de UFC de los microorganismos probados en cada medio de cultivo.

Si se obtienen los siguientes resultados:

N Medio Placa 1 Placa 2 UFC (promedio) PR = (Ns / No) Criterio de aceptación Interpretación

Ns ARVB 97 98 98
PR=0.98 ≥ 0.5 Cumple
No AST 98 102 100

Preparar una serie de diluciones de Enterococcus faecalis hasta una dilución más de la que se cuentan
menos de 150 UFC, inocular por vaciado en placa las últimas tres diluciones usando AST, e inocular por
vaciado en placa las primeras diluciones usando ARVB, incubar a 35 °C por 24 h +/- 2 h y leer.

101 105 106 107 D FS Interpretación

AST -- >250/ 103/ 9 D0=7

>250 106= 10
105 Inhibición
Cumple
total
ARVB 0 -- -- -- Ds= 1

Conclusión: El medio de cultivo es adecuado para su uso.

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3. Medios Sólidos para Pruebas Cualitativas

Prueba de productividad y especificidad
Preparar cultivos de trabajo como se describe en
el punto "Preparación y cuantificación del inóculo",
para tener concentraciones aproximadas de 100
UFC / mL
Para la prueba de productividad y especificidad,
utilizar placas del medio a probar estriando (estría
cruzada) con asa para cada microorganismo de
prueba de manera que se obtengan colonias
aisladas.
Prueba de selectividad.
Estriar usando un asa de 1 µl para cada
microorganismo de prueba con una sola línea
recta en la misma placa paralelamente sin que se
crucen las estrías. Deben ser distinguibles para
permitir la observación morfológica típica y
tamaño de la colonia. Incubar las placas bajo
condiciones definidas en los métodos de prueba
correspondientes.
Interpretación de resultados
colonial (especificidad) típica. Para las pruebas de
selectividad dependerá del grado de inhibición y
de tipo de medio. El crecimiento para
microorganismos no blanco deber ser
parcialmente inhibidos o completamente inhibidos.
Ejemplo:
Evaluación de desempeño de agar XLD
Preparar suspensiones de aproximadamente 100
UFC como se indica en "Preparación y
cuantificación del inóculo" de los siguientes
microorganismos Salmonella Typhimurium, E. coli
y Enterococcus faecalis
Estriar de la suspensión de Salmonella
Typhimurium una placa de XLD por estría
cruzada. En otra placa de XLD inocular E. coli
utilizando un asa de 1 µl haciendo una línea recta,
inocular Enterococcus faecalis con otra asa de 1
µl haciendo otra línea recta paralela a la primera.
Incubar a 36 °C +/- 1 °C por 24 h +/- 2 h y leer los
resultados.

El crecimiento de las placas se evalúa como Prueba Microorganismo Criterio Resultado Interpretación

sigue: 2
Productividad y

Colonias con
especificidad

(2) Buen
centro negro
 0 Corresponde a nulo crecimiento, Salmonella
y halo
crecimiento
Cumple
Typhimurium colonias
completamente inhibido, transparente,
típicas
y vire del
 1 Corresponde a crecimiento débil (aun medio.
cuando se reduzca el crecimiento o el
(0)
tamaño de la colonia), parcialmente E. faecalis 0 Inhibición Cumple
Selectividad

inhibido. total

 2 Corresponde a buen crecimiento (1)

E. coli 0-1 Cumple
Inhibición
La calificación del microorganismo blanco debe
ser 2 y tener apariencia, tamaño y morfología

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4. Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método Cuantitativo.
Método adecuado para caldos selectivos o no
selectivos. También es adecuado para evaluar el
desempeño de medios de cultivo empleados en la
metodología de NMP.
Para medios de cultivo de doble o triple
concentración, se debe adicionar el volumen de
agua estéril necesario para que los medios
queden en concentración simple.
Preparación de las diluciones.
Preparar el inóculo de acuerdo al punto
"Preparación y cuantificación del inóculo"2.
Sembrar 1 mL de las diluciones apropiadas para
obtener el inóculo deseado por vaciado en placa o
0.1 mL por extensión en placa en un medio de
referencia.
Incubar las cajas invertidas a 36 °C +/- 1 °C,
durante 24 horas. Contar las colonias para
conocer en qué dilución se encuentra el inóculo
deseado, mantener registros.
Para microorganismo blanco el inóculo debe ser
de entre 100 y 150 UFC. El volumen de inoculo en
los medios de cultivo líquidos no deberá ser mayor
del 10% del volumen del medio de cultivo
Para microorganismos no blanco ≥1000 UFC
Desarrollo
Una vez establecida la dilución para ambos
microorganismos, inocular un número de tubos
equivalente a las diluciones a probar, para el
microorganismo no blanco, puede ser suficiente
solo la dilución 10-1 y 10-2, y para el
microorganismo blanco, una o dos diluciones más
altas a la seleccionada.
2 Para el uso de inóculos de cepas liofilizadas, seguir
las instrucciones de uso del fabricante; si este es el
caso no se debe realizar la extinción del inóculo.
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Incubar bajo las condiciones establecidas en el
método de prueba.
Después de la incubación, estriar ambas series de
tubos en un medio no selectivo previamente
aprobado, utilizando una asa de 10 µL para tener
colonias aisladas.
Incubar en condiciones adecuadas para el
microorganismo.
Interpretación de resultados
Productividad
Se considera que el medio de cultivo tiene buena
productividad cuando al estriar 10 µl del medio de
cultivo inoculado con 100-150 UFC, crecen al
menos 10 UFC, en un medio no selectivo
previamente aprobado.
Selectividad
Calcular la Selectividad como Fs, restando la
dilución más alta en la que se observa buen
crecimiento del microorganismo blanco (Do),
menos la dilución más alta donde se encuentra
crecimiento o no del microorganismo no
blanco(Ds).
Fs=Do-Ds
Dónde:
Fs es el factor de selectividad.
Do es la dilución más alta que muestra buen
crecimiento del microorganismo blanco.
Ds dilución más alta donde se encuentra
crecimiento del microorganismo no blanco.
Fs, Do y Ds son expresados en unidades
logarítmicas base 10 (log)
Ejemplo:
Se desea realizar la evaluación inicial del
desempeño de un nuevo lote del medio de cultivo
Caldo MM. Se prepara una suspensión de E. coli,
en la dilución 10-7 se cuentan 120 UFC/mL y se
suspende una asada E. faecalis en 9 mL de
diluyente, esta se considera la dilución 10-1 y se
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hace una dilución decimal más. Se inoculan dos
tubos de Caldo MM, con 1mL de las diluciones 10-
7, 10-8 de E. coli y dos más con un 1mL de las
diluciones 10-1 y 10-2 de la suspensión de E.
faecalis. En el momento de inocular los caldos se
verifica el inóculo por vaciado en placa.
Se incuban los cuatro tubos a 36 ºC +/- 1 ºC, por
24h.
Después del tiempo de incubación, de cada tubo
de caldo MM, usando una asa de 10 µL, se
estrían placas de AST y se incuban a 36 ºC por
24h, se cuentan las colonias en las placas y se
observa que en la dilución 10-8 se cuentan más de
10 UFC, mientras que no se observa crecimiento
en ninguno de los caldos inoculados con E.
faecalis.

Cálculos
Dilución UFC Crecimiento UFC en
Microorganismo de Productividad
seleccionada inoculadas en el caldo AST
FS

10-7 120 Crecimiento y Incontables

E. coli 8-1=7 Cumple.
10-8 12 vire más de 10 Inhibición

10-1 sin 0 total

E. faecalis Cumple Na
10-2 >25000 crecimiento 0

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5. Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método cualitativo para los medios
líquidos selectivos.
General.
Este método utiliza el microorganismo blanco, el
microorganismo no blanco, y la mezcla de los
microorganismos en un tubo cada uno.
Procedimiento
Seleccionar un número de tubos de 10mL (Si se
usan volúmenes mayores de medio de cultivo, se
deben hacer los ajustes para alcanzar resultados
equivalentes.) o frascos con 100mL de cada lote a
ser probado, siguiendo las recomendaciones de
los anexos E y F de la ISO 11133.
Para la preparación del inóculo siga con lo
indicado en el punto "Preparación y cuantificación
del inóculo" de este documento.
Inoculación del microorganismo blanco: Inocular
un tubo del medio de cultivo a evaluar con un
inóculo menor de 100 UFC del microorganismo de
prueba, homogeneizar. (tubo A)
Inoculación del microorganismo no blanco:
Inocular un tubo del medio de cultivo a evaluar
con más de 1000 UFC del microorganismo
interferente, homogeneizar. (tubo B)
Inoculación de la mezcla de microorganismos:
Cuando sea requerido en los Anexos E y F,
Tubo Microorganismo Agar Prueba
cuando se trate de medios nuevos, o cuando se
evalúe una marca o fabricante. Inocular un tubo
del medio de cultivo a evaluar con menos de 100
UFC del microorganismo blanco y más de 1000
UFC del microorganismo no blanco,
homogeneizar. (tubo C)
Incubar los tubos a las condiciones especificadas
en el método de prueba.
De cada tubo inocular usando un asa de 10 μl
placas de agar como se indica a continuación.
Incubar a las condiciones indicadas en el método
de prueba.
Cálculos e interpretación de los resultados.
Productividad:
Se considera como resultado satisfactorio si hay
buen crecimiento del microorganismo blanco (al
menos 10 UFC o una línea confluente de
crecimiento) en el medio no selectivo.
Selectividad:
Se considera como resultado satisfactorio cuando
no hay crecimiento (menos de 10 UFC) del
microorganismo no blanco en el medio no
selectivo.
Valor esperado

A Blanco No selectivo Productividad Crecimiento

B No blanco No selectivo Selectividad Sin crecimiento

C Mezcla Diferencial Selectividad Crecimiento del microorganismo blanco.

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6. Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método cualitativo por turbidez.
General.
Este método es adecuado para la evaluación de
desempeño de medios de cultivo líquidos no
selectivos y selectivos, utilizados para pruebas de
confirmación, por ejemplo, caldo verde brillante
bilis lactosa. El método es sólo cualitativo por
tanto, sus resultados son sólo indicativos, por lo
que la turbidez en el medio debe ser confirmada
en un medio sólido para demostrar el crecimiento.
Para medios translúcidos, es utilizada la siguiente
notación:
● 0 indica sin turbidez;
● 1 indica una ligera turbidez;
● 2 indica una buena turbidez.
Procedimiento.
Medios de pre-enriquecimiento
Seleccionar una cantidad de tubos conteniendo
10mL o porciones de 10mL de cada lote de medio.
microorganismo, el tamaño de inóculo debe ser de
<100 UFC. Incubar el medio a 36 °C +/- 1 °C
como lo indican los métodos de prueba por 24h,
después de la incubación registrar la presencia de
turbidez y resembrar en medios diferenciales
adecuados, en este caso puede usarse agar XLD
para Salmonella spp. y agar MacConkey para E.
coli.
Medio de confirmación
Usando un asa de 1μL, inocular el medio de
confirmación con una suspensión de > 106
UFC/mL (también puede inocularse una asada
directa)
Incube los tubos bajo las condiciones definidas en
el método de prueba.
Si el medio antes de inocular es turbio subcultivar
a un medio sólido según se indica en las
condiciones de prueba y examinar el crecimiento.
Interpretación de los resultados

Para la evaluación de un medio de pre La evaluación cualitativa se efectuará visualmente

enriquecimiento, ej. agua de peptona buscando una buena turbidez 3 , vire o reacción
amortiguada, inocular el medio a probar con un positiva característica del medio que representa
volumen adecuado de una suspensión que un buen crecimiento. Para medios turbios se
contenga ≤ 100 UFC del microorganismo de considera buen crecimiento cuando hay
interés, el cual es definido considerando las crecimiento en el medio sólido.
pruebas para las que el medio de cultivo será
utilizado como pre enriquecimiento. Para la
preparación del inóculo ver el punto "Preparación
y cuantificación del inóculo".

Incubar el tubo en las condiciones especificadas

en el método de prueba.

Examinar el medio de crecimiento.

Por ejemplo, un lote específico de agua

peptonada amortiguada puede ser preparado para
servir como pre enriquecimiento de los métodos
descritos en el apéndice A, I y J de la NOM-210-
SSA1-2014, por lo que para su evaluación 3A veces las células pueden estar sedimentadas
deberán usarse cepas de Salmonella spp. y E. en el fondo del tubo, por lo que puede ser
coli. Preparar inóculos independientes de cada necesario agitar los tubos cuidadosamente para
poder hacer una correcta interpretación.

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7. Método para la evaluación del desempeño de diluyentes.

General.
El método determina la capacidad del diluyente
para mantener vivos a los microorganismos sin
multiplicarse o reducirse durante un periodo de
contacto hasta antes de que sean inoculados en
agar o medio líquido.
Procedimiento
Realizar las diluciones y cálculos necesarios para
obtener un inóculo adecuado que permita que
después de inocular una porción del diluyente y
sembrar 0.1mL por extensión en el agar de
referencia se obtengan cuentas de
aproximadamente 100 UFC.
Por ejemplo: Inocular un tubo con 9mL del
diluyente con 1mL de una suspensión del
microorganismo conteniendo aproximadamente
10,000 UFC, homogeneizar. Inmediatamente
tomar por duplicado 0.1mL del diluyente inoculado
y sembrar por extensión en placa por duplicado
sobre la superficie en agar de referencia (como
AST) identificar las placas como t0 (La cuenta de
UFC en la placa debe ser aproximadamente 100
UFC).
Mantener el diluyente inoculado a temperatura
ambiente por el tiempo especificado en el método
de prueba empleado, entre la preparación de la
suspensión inicial y el momento cuando el inóculo
está en contacto con el medio de cultivo
(normalmente 45 minutos).
Mezclar y tomar el mismo volumen (0.1mL) e
inocular por duplicado las placas de medio de
referencia identificar como t1.
Incubar los medios de referencia a una
temperatura y tiempo apropiadas como 36 °C +/-
1 °C por 24 h.
Lectura e interpretación de datos
Después de la incubación contar las colonias en
las placas a tiempo t0 y t1 y realizar los promedios
de los duplicados. El número de microorganismos,
t1, después de la incubación del diluyente debe
estar dentro de ±30% de la cuenta inicial t0.
FÓRMULA:
(t1 - t0 )/t0 X 100
Donde:
t1= Promedio de la cuenta al tiempo final
t0=Promedio de la cuenta al tiempo inicial

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laboratorio de microbiología de alimentos.

8. Evaluación de desempeño de los medios de cultivo que se utilizan en los métodos de V.

cholerae y V. parahaemolyticus.
Los procedimientos que se describen a V. cholerae
continuación están basados en los métodos antes T1NO positivo / turbidez
descritos. Se describen en este apartado para dar T1N3 positivo / turbidez
mayor claridad a los usuarios sobre la evaluación T1N6 negativo / sin cambio
particular de los medios de cultivo para la T1N8 negativo / sin cambio
identificación o aislamiento de cepas de Vibrio. Y
se contemplan algunos de los medios que se V. parahaemolyticus
mencionan en los siguientes documentos: T1NO negativo / sin cambio
T1N3 positivo / turbidez
 NOM-242-SSA1-2009 B.19 TÉCNICAS Y T1N6 positivo / turbidez
PROCEDIMIENTOS PARA LA T1N8 positivo / turbidez
INVESTIGACIÓN DE Vibrio cholerae y
su Modificación del 2012. Método para la evaluación de los Agares
 BAM Chapter 9, V. parahaemolyticus. B. T1Nx
Biochemical identification of isolates. A Partir de cultivos de 24 h (V.1 Preparación y
cuantificación de medios de cultivo), inocular en
Preparación de los cultivos. una placa del medio con cada microorganismo de
prueba mediante estría de una sola línea recta,
Por los propios requerimientos de los Vibrios es todos los cultivos pueden hacerse en la misma
necesario considerar lo siguiente, las cepas placa paralelamente sin que se crucen las estrías.
pueden ser conservadas en BAB a temperatura Las estrías deben ser distinguibles para permitir la
ambiente. Cuando sea necesario a partir de estos observación morfológica típica y tamaño de la
cultivos de conservación inocular placas de agar colonia. Incubar de 35 °C a 37 °C por 18 h a 24 h.
T1N3 e incubar entre 35 °C y 37 °C entre 18 h y Examinar el crecimiento. El medio de cultivo pasa
24 h, utilizar estos cultivos como cepas de trabajo. la prueba si se cumplen los siguientes criterios.
Método para la evaluación de los Caldos V. cholerae
triptona (T1Nx) T1N1 positivo / crecimiento
Seleccionar una cantidad de tubos, inocular los T1N3 positivo / crecimiento
caldos a evaluar con una asada de un cultivo de
24h (V.1 Preparación y cuantificación de medios V. parahaemolyticus
de cultivo). Incubar los tubos de 35 °C a 37 °C por T1N1 negativo / sin crecimiento
18 h a 24 h. Examinar el crecimiento en el medio. T1N3 positivo / crecimiento.
El medio de cultivo pasa la prueba si se cumplen
los siguientes criterios.

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laboratorio de microbiología de alimentos.
9. Guía para la elaboración del “Procedimiento de Preparación del Medio de Referencia
(PMR)”.
Introducción
La preparación de medios de cultivo es un paso
fundamental para asegurar la confiabilidad de los
resultados del análisis microbiológico, la
evaluación del desempeño de los medios de
cultivo en general se realiza por comparación
contra un medio de cultivo de referencia. La
preparación del medio de cultivo de referencia,
debe ser descrita en un procedimiento particular y
es específica para cada laboratorio, por lo que en
esta sección sólo se proveerán algunas guías o
recomendaciones que permitirán a los laboratorios
elaborar su propio procedimiento.
Formulación del medio de cultivo de
referencia.
El medio de cultivo de referencia generalmente es
un medio no selectivo como Agar Soya Tripticasa
(BBL(MR) Cat. 211043, / Bioxon(MR) 210800,
Merck(MR) 105458), en el PMR se deberá indicar
la marca(s) de medio de cultivo que utilice cada
laboratorio. El laboratorio debe considerar que
este medio de cultivo debe ser adecuado para
recuperar todos los microorganismos que se
utilicen para evaluar los medios de cultivo. Es
recomendable que en medida de lo posible,
siempre se utilice el mismo medio a lo largo del
tiempo.
Formulación típica del medio de referencia AST.
Formulación (g/L)
Digerido pancreático de caseína (tripticasa) 15 g
Digerido papaico de soya (Phytone) 5g
Cloruro de sodio 5g
Agar 15 g
pH final 7.3 ± 0.2 a 25 °C
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Preparación
La preparación del medio de cultivo se debe
realizar siguiendo las instrucciones de preparación
del fabricante. Sin embargo en el PMR se debe
describir específicamente las actividades a
realizar, indicando en la medida de lo posible,
materiales y equipos a utilizar, con el propósito de
reducir las variaciones entre lote y lote de
preparación, debidas a la propia preparación del
medio. Cuando se utilicen medios preparados en
polvo, se debe considerar las instrucciones del
fabricante para redactar el PMR. El siguiente texto
es un ejemplo para la redacción para esta sección
en el PMR.
El procedimiento debe considerar que aquellos
elementos que causan variación o alteración en el
medio de cultivo, deben ser controlados
específicamente; ya sea indicando sus
características o señalando marcas, catálogos o
números de identificación. Se deben considerar
como puntos críticos los siguientes:
● Agua desionizada.
● Marca y catálogo de medio de cultivo.
● Tiempo y temperatura de calentamiento
para disolver el agar.
● Recipiente en el que prepara el medio de
cultivo.
● El autoclave.
● La marca y catálogo de las placas petri.
● El volumen de llenado.
● El material de empaque.
● Las condiciones de almacenamiento.
● El tiempo que se deja enfriar las placas.
● El agua de condensación (el cual se debe
reducir).
● El pH final del medio de cultivo.
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laboratorio de microbiología de alimentos.

Ejemplo.

El siguiente ejemplo muestra una posible redacción, lo que se pretende destacar es que el PMR, debe ser
muy específico y repetible, este ejemplo podría no ser idéntico para cada laboratorio.

“Pesar ___ g del polvo en una charola de pesado, usando un vaso de precipitados suspender en ___ mL (la
mitad del volumen requerido para hidratar) de agua desionizada (tomada del equipo el mismo día de
preparación), recuperar el polvo que quede adherido en la charola por enjuague, usando el resto del volumen
de agua. Dejar reposar de 5 a 10 minutos para permitir la humectación del polvo. Usando una parrilla de
agitación digital con calentamiento, mantener el calentamiento y la agitación constante para disolver el agar
(colocar el selector de temperatura en el número 400). Hervir por no más de 1 minuto. La completa
disolución del agar se alcanza cuando el medio se torna cristalino. Esterilizar a 121 ºC por 15 min., usando la
autoclave ID X o en la ID XX. El tiempo máximo de exposición debe ser menor a 45 min, contados desde el
momento en que se cierra la puerta del autoclave y terminando con el momento en el que se sacan los
medios del autoclave. Dejar enfriar en un baño de agua a 45°C +/- 1°C. En el interior de una campana de
flujo laminar, vaciar a placas de petri desechables (90 x 100) entre 20 y 25 mL de medio de cultivo, para
asegurar agares con 3 mm de espesor. Dejar gelificar, tapar hasta que el agar esté completamente sólido.
Empacar en bolsas de papel haciendo pilas de 10 placas, mantener a temperatura ambiente 24 h, y
refrigerar entre 2-8 °C.”

Control de Medio de Cultivo de Referencia.

Realizar la evaluación microbiológica del medio de cultivo de referencia con cada microorganismo control que
se utilice dependiendo de los medios de cultivo a evaluar. Ver sección IV de este Manual.

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 Manual para la evaluación del desempeño de los medios de cultivo en el
laboratorio de microbiología de alimentos.

Bibliografía.
1. NORMA Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba
microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos
patógenos.

2. INTERNATIONAL STANDARD ISO 11133 Microbiology of food, animal feed and water —
Preparation, production, storage and performance testing of culture media. 2014

3. CATÁLOGO DE MEDIOS DE CULTIVO. CCAYAC-CT-03, Catálogo de Medios de Cultivo.

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laboratorio de microbiología de alimentos.

Anexo I. Evaluación del desempeño de los medios de cultivo que no están presentes en los anexos ISO.

Medio de Método Prueba Condiciones de Microorganismos a probar Método de control

cultivo incubación

Caldo lactosado Salmonella spp. NOM-210- Productividad 18 h +/-2 h Salmonella Typhimurium ATCC (MR) 14028 Método cualitativo por
SSA1-2014 36 °C +/- 1 °C Salmonella Enteritidis 13076 turbidez
Apéndice A
A.6.2.14

Leche Salmonella spp. NOM-210- Productividad 18 h +/-2 h Salmonella Typhimurium ATCC (MR) 14028 Método cualitativo por
descremada SSA1-2014 36 °C +/- 1 °C Salmonella Enteritidis ATCC (MR) 13076 turbidez
reconstituida Apéndice A
A.6.2.14

Caldo Rojo de S. aureus Reacción Anaerobia hasta Positivo Inoculación directa

fenol NOM-210-SSA1-2014 característica 5 días a 36 °C S. aureus ATCC (MR) 25923
- manitol Apéndice B +/- 1 °C
B.6.9.2.2 Negativo
S. epidermidis ATCC (MR) 12228 o 35547

Caldo Rojo de S. aureus Reacción Anaerobia hasta Positivo Inoculación directa

fenol NOM-210-SSA1-2014 característica 5 días a 36 °C S. aureus ATCC (MR) 25923
- Glucosa Apéndice B +/- 1 °C
B.6.9.2.2 Positivo
S. epidermidis ATCC (MR) 12228 o 35547

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laboratorio de microbiología de alimentos.

Medio de Método Prueba Condiciones de Microorganismos a probar Método de control

cultivo incubación

Caldo Listeria monocytogenes Reacción Anaerobia hasta Listeria monocytogenes ATCC (MR) 19115 Inoculación directa
carbohidrato NOM-210-SSA1-2014 característica 5 días a 36 °C Xilosa Negativo
(xilosa y Apéndice C +/- 1 °C Ramnosa positivo
ramnosa) C.7.8.2 L. ivanovvi ATCC (MR) 19119
Xilosa Positivo
Ramnosa negativo

Agar urea Salmonella spp. Reacción 36 °C +/- 1 °C Salmonella Typhimurium ATCC (MR) 14028 Reacción característica
Caldo urea NOM-210-SSA1-2014 característica por 24 h resultado negativo. por siembra directa.
Apéndice A Proteus mirabilis ATCC (MR) 29906
A.7.3.5 resultado positivo.

Caldo MR-VP Salmonella spp. Reacción 36 °C +/- 1 °C Salmonella Typhimurium ATCC (MR) 14028 Inoculación directa
NOM-210-SSA1-2014 característica por 24 h resultado VP negativo.
Apéndice A
A.7.3.5 E. coli ATCC (MR) 25922
E. coli resultado VP negativo.
NOM-210-SSA1-2014
Apéndice H H.7.1.6.1.3.2 E. aerogenes ATCC (MR) 13048 resultado
VP positivo

Agar soya cultivo de microorganismos Productividad 18 h +/-2 h E. coli ATCC (MR) 25922 o ATCC (MR) Medios Solidos para
tripticaseina 36 °C +/- 1 °C 8739 pruebas cualitativas:
S. aureus. ATCC (MR) 25923 Prueba de
Bacillus subtillis ATCC (MR) 6633 productividad

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Medio de Método Prueba Condiciones de Microorganismos a probar Método de control

cultivo incubación

Caldo soya Salmonella spp. NOM-210- Productividad 18 h +/-2 h Salmonella Typhimurium ATCC (MR) 14028 Método cualitativo por
tripticaseina SSA1-2014 36 °C +/- 1 °C Salmonella Enteritidis ATCC (MR) 13076 turbidez
Apéndice A Preparación de
diferentes muestras y
Prueba de esterilidad de
materiales

TCBS V. cholerae Productividad y 35 °C +/-1 °C V. cholerae Medios sólidos para

especificidad 24h Buen crecimiento (2) colonias amarillas pruebas cualitativas:
V. parahaemolyticus Prueba de
Crecimiento (1-2) colonias de color verde- productividad y
azul especificidad

Selectividad 35 °C +/-1°C 24 E. coli ATCC 25922 Medios sólidos para

h Inhibición total (0) pruebas cualitativas:
Prueba de selectividad.

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Medio de Método Prueba Condiciones de Microorganismos a probar Método de control

cultivo incubación

TSI Salmonella spp. Apéndice Reacción 36 °C +/-1 °C 24 Salmonella Typhimurium ATCC (MR) 14028 Inoculación directa
LIA A. NOM-210-SSA1-2014 característica h +/-3 h TSI
A.7.3.5 K/A Gas y H2S positivo
LIA K/K y H2S positivo

y algunos de los siguientes:

S. diarizonae (ATCC (MR) 12325) lactosa

positivos, H2S positivo
ó
S. abortus equi (ATCC (MR) 9842), lactosa-
negativo, H2S-negativo;
ó
S. diarizonae (ATCC (MR) 29934) lactosa-
positivo, H2S-negativo.

DNA-Azul de S. aureus. Reacción 35 °C +/- 1 °C S. aureus ATCC (MR) 25923 Reacción característica
toluidina Apéndice B. característica por siembra directa. Ver
S. epidermidis ATCC (MR) 12228 o 35547 B.6.3.8.3 de la NOM-
210

KIA V. cholerae Reacción 36 °C +/- 1 °C V. cholerae K/A sin gas ni H2S Inoculación directa
característica por 24 h y
E. coli
A/A puede presentar gas sin H2S
ó
Pseudomonas aeruginosa
K/K

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Medio de Método Prueba Condiciones de Microorganismos a probar Método de control

cultivo incubación

Mc Conkey E. coli Productividad 35 °C +/-1 °C E. coli (ATCC) 25922 Buen crecimiento y Medios sólidos para
NOM-210-SSA1-2014 Selectividad por 18-24 h colonias rosas pruebas cualitativas
apéndice H. Especificidad
H.7.1.5.1 E. faecalis ATCC (MR) 29212 total inhibición

Proteus mirabillis ATCC (MR) 12453 o

29906 sin coloración

EMB-L E. coli Productividad 35 °C +/-1 °C E. coli ATCC (MR) 25922 Buen crecimiento Medios sólidos para
NOM-210-SSA1-2014 Selectividad por 18-24 h y colonias azul oscuro con brillo metálico pruebas cualitativas
apéndice H. Especificidad verde
H.7.1.6.1.1
E. faecalis ATCC (MR) 29212 total inhibición

Proteus mirabillis ATCC (MR) 12453 o

29906 sin coloración.

Agar Oxford Listeria monocytogenes Productividad 30 °C +/- 1 °C y Listeria monocytoges ATCC (MR) 19115 Medios sólidos para
NOM-210-SSA1-2014 Selectividad 36 °C +/- 1 °C Buen crecimiento Colonias negras. pruebas cualitativas
apéndice C. C.7.3 Especificidad
E. coli ATCC (MR) 25922 inhibición total.

Agar Palcam Listeria monocytogenes Productividad 30 °C +/- 1 °C y Listeria monocytoges ATCC (MR) 19115 Medios sólidos para
NOM-210-SSA1-2014 Selectividad 36 °C +/- 1 °C Buen crecimiento. Hidrólisis de la esculina pruebas cualitativas
apéndice C. C.7.3 Especificidad muy pequeñas, grisáceas o un verde olivo
de aproximadamente 1.5mm a 2mm con un
halo oscuro.

E. coli ATCC (MR) 25922 total inhibición.

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Medio de Método Prueba Condiciones de Microorganismos a probar Método de control

cultivo incubación

Agar sangre de Listeria monocytogenes Reacción 36 °C Ver C.7.8.3 de la NOM-210-SSA1-2013

cordero NOM-210-SSA1-2014 característica
apéndice C. C.7.8.3

Agar Movilidad Listeria monocytogenes Reacción 36 °C +/-1 °C 18- Ver C.7.7.6 de la NOM-210-SSA1-2013
NOM-210-SSA1-2014 característica 24 h
apéndice C. C.7.7.6

MIO V. cholerae Reacción 35 °C +/- 1 °C 24 V. cholerae Inoculación directa

característica h M+ /I+ / O+

Shigella flexneri ATCC (MR) 12022

M- /I- /O-
ó
Klebsiella pneumoniae ATCC (MR) 13883 ó
31488 ó 10031 M- /I- /O-

SIM V. parahaemolyticus Reacción 35 °C +/- 1 °C 24 V. parahaemolyticus) Inoculación directa

característica h S- I+ M+

E. coli
S+ I+ M+

Citrato de E. coli Reacción 35 °C +/- 1 °C 24 Salmonella Typhimurium ATCC (MR) 14028 Inoculación directa-
Simmons NOM-210 SSA1-2014 característica h Positivo o Enterobacter aerogenes ATCC
Apéndice H H.7.1.6.1.4 (MR) 13048

E coli ATCC (MR) 25922 negativo

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Medio de Método Prueba Condiciones de Microorganismos a probar Método de control

cultivo incubación

ASB Salmonella spp. Apéndice ver lo que se indica para XLD en tabla E.1 de la ISO 11133
EH A. NOM-210-SSA1-2014
SS

Agar Papa Mohos y Levaduras. NOM- ver lo que se indica para ADS en la tabla E.1 de la ISO 11133
Dextrosa 111-SSA1-1994

Agar Base Varios y conservación de ver lo que se indica para AST en la tabla E.1 de la ISO 11133
Sangre cepas

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