UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA N°8
TEMA: ENZIMAS - DESNATURALIZACIÓNY REDUCTASAS EN LA
LECHE
1. OBJETIVOS
1.1. Observar y comprobar la desnaturalización de proteínas verificando su efectividad
en una muestra

1.2. Determinar la calidad Microbiológica de la leche.

1.3. Comprobar la actividad de ciertas enzimas provenientes de alimentos y otros

productos orgánicos

2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1. Materiales y Equipos
2.1.1. Tubos de ensayo.
2.1.2. Pipetas
2.1.3. Vasos de precipitación
2.1.4. Baño maría
2.1.5. Mortero
2.1.6. Lámpara de alcohol
2.2. Sustancias y Reactivos
2.2.1. Una papaya.
2.2.2. Dos papas cocinadas y dos crudas
2.2.3. Jamón cocinado, Jamón Crudo
2.2.4. Saliva
2.2.5. Hígado de res crudo y cocinado
2.2.6. Lugol
2.2.7. Peróxido de Hidrógeno
2.2.8. Reactivo de Biuret
2.3. Procedimiento
2.3.1. PARTE A: Reductasas en la leche
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2.3.1.1. En 2 tubos de ensayo verter 10 ml de leche; en el primero leche UHT entera, en el

segundo 10 ml de leche cruda.
2.3.1.2. Adicionar 1 ml de azul de metileno en cada tubo de ensayo (evitar el contacto de la
punta de la pipeta con la muestra al momento de adicionar el azul de metileno)
2.3.1.3. Cerrar el tubo de ensayo y agitar suavemente para homogenizar la mezcla,
evitando tocar la tapa de tubo.
2.3.1.4. Llevar los tubos de ensayo a baño termostático a 38 ºC (el nivel del baño debe
sobrepasar el nivel de la muestra del tubo)
2.3.1.5. Cuantificar el tiempo de decoloración.
Precaución: Evite mojar el costado del tubo con la leche. Evitar en el baño termostático la
luz solar y mantener lo estable la temperatura.
2.3.2. PARTE B: Reductasas en el agua
2.3.2.1. En un tubo de ensayo verter 10 ml de agua de agua potable y realizar el
procedimiento anterior a partir del 3.3.1.2.
2.3.3. PARTE C: Enzimas
2.3.3.1. Coloca en un tubo de ensayo 2 ml de solución de almidón al 1%, agrega dos
gotas de lugol y observa.
2.3.3.2. En otro tubo de ensayo coloca 2 ml de la solución de almidón al 1%,
adiciona aproximadamente 2 ml de saliva, agita y deja reposar durante 25 minutos
aproximadamente.
2.3.3.3. Coloca en un mortero diez semillas de papaya con un poco de agua,
muélelas y decanta.
2.3.3.4. En otro mortero muele 2 gr de jamón con un poco de agua. Coloca en un
tubo de ensaye 2 ml del líquido decantado del jamón, inmediatamente agrega 4
gotas de reactivo de Biuret y agita. Si aparece una coloración liliácea indicará la
presencia de proteínas.
2.3.3.5. Coloca en otro tubo de ensaye 2 ml del líquido decantado de jamón, agrega 2
ml del líquido decantado de las semillas de papaya, agita y deja reposar durante 25
minutos, después de transcurrido ese tiempo agrega 4 gotas de reactivo de Biuret y
compáralo con el tubo uno.
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2.3.3.6. Coloca en un tubo de ensaye un poco de hígado cocido y molido y adiciona

2 ml de agua oxigenada.
2.3.3.7. En otro tubo coloca un poco de hígado crudo molido y adiciona 2 ml de agua
oxigenada. Compara las reacciones de los dos tubos.
2.3.3.8. Toma dos tubos de ensaye a uno coloca un poco de papa cocida y en el otro
un poco de papa cruda, adiciona 2 ml de agua oxigenada a ambos tubos y observa lo
que sucede.

3. PROCESAMIENTO DE DATOS
Tabla 3-1
Datos experimentales - Desnaturalizacióny reductasas en la leche
Tipo de Muestra Tiempo/ min
Leche UHT 5
Leche Cruda 5
Agua Potable 5
Fuente:Universidad Central del Ecuador-Centro de Biología-Laboratorio de Biología-
Grupo 5

Tabla 3.1-2
Observaciones - Enzimas
Muestra Reactivo Observación
Saliva Lugol Se observó que al poner en contacto la saliva con el
calor esta sustancia tenía presencia de polisacáridos
ya que dio un cambio de color
Saliva Benedict Se observó que al poner en contacto la saliva con el
calor esta sustancia no tenía presencia de azucares
reductores por lo tanto no cambio de color
Glucosa Benedict Se observó que al agregar reactivo de benedict en la
solución esta cambio de color de manera que se
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puede deducir que tiene azucares reductores

Glucosa Lugol Se observó que al agregar lugol en la solución no
reacción debido a que esta no contiene polisacáridos
Hígado de res crudo H2O2 Se pudo observar que su reacción fue muy rápida al
poner en contacto con el agua oxigenada
Perejil H2O2 Se observó que tuvo una efervescencia de inmediata
al rato de poner agua oxigenada
manzana H2O2 Se observó que la manzana no reacciono con el agua
oxigenada por lo cual no hay presencia de enzimas o
simplemente no reaccionan con ese compuesto
Papa Cruda H2O2 Se observó que tuvo una reacción inmediata con el
agua oxigenada
Fuente:Universidad Central del Ecuador-Centro de Biología-Laboratorio de Biología-
Grupo 5

3.1. Datos Adicionales

Tabla 3.1-1
Calidad de la leche
Calidad de la Tiempo de conservación de
leche la leche
Muy mala ≤20 minutos
Mala 20 minutos a 2 horas
Mediana 2 horas a 5 ½ horas
Primera ≥5½

Fuente:BUENA Señal lab.

Tabla 3.1.-2
Calidad de la leche
Tram, min No. Bacterias/ ml
≤ 30 min 20 – 30 millones
30 min – 2 horas 4-20 millones
2- 6 horas 0,5 – 4 millones
≥6 horas ≤ 500,000
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Fuente:TRAM
4. RESULTADOS
Tabla 4.1.
Resultados Finales
Tipo de Muestra Calidad Tiempo de decoloración (min)
Leche Ultra Pasteurizada Primera >40
Leche Pasteurizada Primera 5
Agua Primera >5
Fuente:Universidad Central del Ecuador-Centro de Biología-Laboratorio de Biología-
Grupo 5

5. DISCUSION
El método de análisis cualitativo empleado fue correcto, debido a que permitió de forma
experimental cumplir con los objetivos de la práctica, realiza un control cualitativo de la
calidad de la leche y verificar la función de las enzimas como sustancias biocatalizadoras y
su efecto para la degradación de moléculas. Durante la experimentación existieron errores
sistemáticos los cuales afectaron a la veracidad de los datos obtenidos, dentro de los errores
sistemáticos se encuentra el hecho que la muestra de almidón empleada tiene una
concentración muy baja, razón por la cual al realizar la prueba 2.3.3.2. Enzima y almidón al
emplear el reactivo de Benedit el resultado no fue el esperado. Se recomienda repetir el
mismo procedimiento con una solución más concentrada y verificar el error y la causa del
mismo.
6. CONCLUSIONES
6.1. La desnaturalización de proteínas obtenida por el calentamiento de la enzima
necesita de una solución concentrada de almidón para obtener presencia de
polisacáridos y ausencia de azúcares reductores con su característica que es el cambio
estructural ya que da lugar a la pérdida estructural nativa de a molécula.
6.2. La calidad microbiológica de la leche obtenida por el tiempo de coloración necesita
de azul de metileno con calentamiento para obtener la cantidad de bacterias existentes
con su característica que debe ser de primera ya que da lugar a ser insípida, no contener
residuos ni sedimentos.
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6.3. La actividad de ciertas enzimas provenientes de ciertos alimentos y otros productos

orgánicos obtenidas por la decantación necesita de identificadores como H2O2, lugol y
benedict para obtener la presencia de enzimas, polisacáridos y azúcares reductores con
sus características de reacción inmediata ya que da lugar a cambios de colores y
efervescencia.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
7.1. Bibliografía
7.1.1. Azán, I. (2016). Evaluación del grado de desnaturalización de la proteína, calcio y
fósforo de la leche durante el calentamiento utilizando un número de combinaciones de
tiempo/ temperatura y su influencia en la calidad y rendimiento del queso fresco elaborado.
Tomado en línea de: http://dspace.unach.edu.ec/bitstream/51000/3032/1/unach-ing-agro-
2016-0010.pdf

7.1.2. Herrera, L. (2008). Enzimas. Regulación de la actividad enzimática. Tomado en línea

de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm

7.1.3. Servicio Ecuatoriano de Normalización INEN – Ecuador. (2019). Tomado en línea

de: http://www.normalizacion.gob.ec

8. CUESTIONARIO
8.1. Tabla TRAM en términos de UFC o unidades formadoras de colonias.

Figura 3.1-1 Comparación del tiempo de reducción de Metileno con el conteo estándar
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F
uente: Azán, I. (2016). Evaluación del grado de desnaturalización de la proteína, calcio y
fósforo de la leche durante el calentamiento utilizando un número de combinaciones de
tiempo/ temperatura y su influencia en la calidad y rendimiento del queso fresco elaborado.
Tomado en línea de: http://dspace.unach.edu.ec/bitstream/51000/3032/1/unach-ing-agro-
2016-0010.pdf

8.2. Normas NTE INEN para Leche cruda y Leche pasteurizada tablas y
comentario general de cada norma.

Norma NTE INEN 9:2012 LECHE CRUDA: establece los requisitos que debe cumplir la
leche cruda de vaca que no ha superado los 40°C con la que sale de la ubre, destinada para
su procesamiento (INEN, 2019).

Tabla 10.2-1: Normas NTE INEN para Leche cruda

Requisito Límite máximo Método de ensayo
Recuento de microrganismos 1,5 x 106 NTEINEN 1529:-5
aeróbios mesófilos REP, UFC/cm3.
Recuento de células somáticas/ cm3 7,0 x 105 AOAC-978.26
Fuente: INEN

Norma NTE INEN 10:2012 LECHE PASTEURIZADA: establece los requisitos que debe
cumplir la leche pasteurizada de vaca destinada al consumo directo o procesamiento
adicional (INEN, 2019).

Tabla 10.2-2: Normas NTE INEN para Leche pasteurizada

Requisito n m M c Método de ensayo
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Recuento de microorganismos 5 30000 50000 1 NTE INEN 1 529-5

mesofólicos, UFC/cm3
Recuento de coliformes, UFC/cm3 5 <1 10 1 AOAC 991.14
Detección de 5 0 - 0 ISO 11290-1
Lesteriamonocytogenes/25g
Detección de Salmonella/25 g 5 0 - - NTE INEN 1529-15
Recuento de 5 <10 - 0 AOAC 991.14
Escherichiacoli,UFC/g
Fuente: INEN

8.3. Enzima reductasa y 3 reacciones en las que participa.

La reductasa es una enzima reductora empleada en elementos o compuesto químicos
que catalizan  reacciones  de oxidación como el R-mevalonato a mevaldato utilizando
NADP+; un claro ejemplo también es la 5α- reductasa que es una enzima que
transforma la testosterona en dehidrotestosterona cuna función es participar en la
biosíntesis del ácido biliar (Azán, 2016).

8.4. Complete el cuadro con el tipo de enzima para cada muestra.

Tabla 10.4-1: Cuadro con el tipo de enzima

Muestra Reactivo Enzima
Solución de almidón Lugol Amilasa
Saliva Lugol Amilasa
Jamón Crudo H2O2 Proteasa
Jamón Cocido Biuret Ninguna
(desnaturalización)
Hígado de res crudo H2O2 Catalasa
Hígado cocido de res H2O2 Ninguna
(desnaturalización)
Semillas de papaya Biuret Papaína
Papa cocida H2O2 Ninguna
(desnaturalización)
Papa Cruda H2O2 Catalasa
Fuente: Laboratorio de bioquímica
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8.5. Cuál es el efecto del color y del pH sobre la actividad enzimática.

Las enzimas poseen un pH óptimo para ejercer su actividad enzimática el cual está
entre 6 y 8, sin embargo hay casos excepcionales como la de estómago cuyo pH es
de 2 para que se den sus respectivas actividades, además son muy sensibles a estos
cambios generalmente producidos por el aumento de la temperatura para que aceleren
dicha actividad enzimática (Herrera, 2008).

8.6. ¿En qué consiste el complejo enzima sustrato ES?

Es cuando la enzima se une con su sustrato formando el complejo enzima -sustrato
gracias al centro quiral que presentan a manea de anclaje para después liberar el
producto (Herrera, 2008).

8.7. ¿Qué factores cree usted que afectaron la actividad de las enzimas en los
diferentes experimentos?
Las concentraciones de las sustancias utilizadas y la temperatura que se aplica a las
distintas formulaciones de acuerdo a los reactivos utilizados para las pruebas de
identificación
9. Anexos
9.1. Reporte fotográfico