UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE

AREQUIPA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

REPORTE N° 01

COLORIMETRÍA Y FOTOMETRÍA

Integrantes:
-Choquecota Machaca Josue Jonathan
-Chullo Gonzales, Diego Benjamin
-Gomez Mamani, Flavia Fernanda
Docente de teoría: Ronald Navarro Oviedo
Docente de laboratorio: Bertha Roxana Mestas Valdivia
Horario: Jueves de 7:00 am - 10:20 am
Fecha de entrega: 21/09/2022

Arequipa-Perú
2022
1.- INTRODUCCIÓN.-

La colorimetría es una de las técnicas empleadas con mayor atención en los

laboratorios, con esta técnica podemos suministrar información cualitativa y
cuantitativa. El colorímetro es un instrumento diseñado para dirigir un haz de luz
paralela monocromática a través de una muestra líquida y así poder medir la
intensidad del haz luminoso emergente.
Las técnicas colorimétricas se basan en la medida de la absorción de radiación en la
zona visible por sustancias coloreadas, sabemos que la absorción de la luz depende
de la intensidad del rayos, por ende a mayor intensidad de la luz incidente mayor
será la intensidad de la luz transmitida.
La aplicación de la ley de Lambert-Beer es el uso del colorímetro para determinar la
concentración de una gran variedad de moléculas que absorben luz (p. ej. Carotenos,
clorofila, hemoglobina, etc.).
La técnica se extiende a sustancias no coloreadas como azúcares o aminoácidos
después de alguna reacción capaz de convertir sustancias incoloras en derivados
coloreados.
Los espectros de absorción, gráficos que relacionan absorbancia con longitudes de
onda, son frecuentemente utilizados en Bioquímica para la caracterización e
identificación de biomoléculas.
En cambio la Fotometría es la parte de la óptica que se ocupa del estudio de las
características de los focos luminosos, así como de las iluminaciones que producen.
Todos los focos luminosos emiten energía, y en la mayor parte de los casos lo son a
causa de su elevada temperatura, gracias a la cual tiene lugar en ellos una emisión
térmica de energía cuya longitud de onda corresponde precisamente a la zona visible
del espectro.

2.- OBJETIVOS.-

OBJETIVO GENERAL
- Medir los espectros de absorción de las sustancias a trabajar

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Lograr evidenciar la ley de Beer-Lambert haciendo uso de concentraciones.
progresivas del rojo de fenol.
- Realizar la curva espectral y determinar la longitud de onda de maxima
absorbancia del rojo de fenol, complejo Cu 2+ - proteína y SBA.
- Comprobar la Ley de Beer-Lambert con las concentraciones progresivas de
rojo fenol

EXPERIMENTO 1:ESPECTROS DE ABSORCIÓN Y LONGITUD DE

MÁXIMA ABSORBANCIA DE ALGUNAS MOLÉCULAS.
MATERIALES Y MÉTODOS.-
- Espectrofotómetro.
- Tubos de ensayo
- Gradillas
- Pipetas
- Solución de rojo de fenol 1 x 10 -4 M
- Reactivo de biuret
- Solución de albúmina de suero bovino (BSA) 1mg/ml

RESULTADOS.-

λ Rojo de fenol Biuret - SBA

disociado Proteína

590 0.635 0.112 0.008

0.781 0.114 0.008

588

0.954 0.115 0.008

586

1.161 0.117 0.008

584

1.402 0.119 0.008

582

1.665 0.120 0.008

580

1.922 0.121 0.008

578

2.141 0.123 0.009

576

2.286 0.124 0.009

574
 2.355 0.125 0.009
572

2.376 0.126 0.009

570

2.390 0.126 0.009

568

2.393 0.127 0.009

566

2.382 0.128 0.009

564

2.380 0.128 0.009

562

2.386 0.129 0.009

560

2.391 0.129 0.009

558

2.402 0.129 0.009

556

2.410 0.129 0.009

554

2.405 0.129 0.009

552

2.406 0.129 0.009

550

2.412 0.129 0.009

548

2.416 0.129 0.009

546
 2.420 0.128 0.009
544

2.419 0.127 0.009

542

2.408 0.127 0.009

540

2.397 0.126 0.009

538

2.390 0.125 0.009

536

2.383 0.124 0.010

534

2.365 0.122 0.010

532

2.341 0.121 0.010

530

2.314 0.119 0.010

528

2.279 0.117 0.010

526

2.240 0.116 0.10

524

DISCUSIÓN:
La longitud de máxima absorbancia nos permite reconocer sustancias ya que estas
tienen un espectro característico, esto va relacionado al espectro de absorción el cual
nos muestra que longitudes de onda son absorbidas por las moléculas a
experimentar variando los niveles de energía.
Todo esto nos permite determinar la presencia de sustancias particulares en una
muestra y poder cuantificar, dependiendo de diversos factores ya sea la estructura
atómica y de las condiciones del medio.
 ● En el rojo de fenol disociado tiene como máxima absorbancia 2.420 en la
longitud de 544 nm .
● La solución de Proteína con reactivo de Biuret tiene como máxima
absorbancia 0.129 en el intervalo de 560 - 546 nm.
● La solución de SBA tiene como máxima absorbancia 0.726 en la longitud de
288 nm.

EXPERIMENTO 2:
MATERIALES Y MÉTODOS.-

- Espectrofotómetro.
- Tubos de ensayo
- Gradillas
- Pipetas
- Rojo de fenol 1x10-4 M
- Buffer borato 0.1 M, pH 9.8
- Solución estándar de SBA 2mg/ml
- Hidróxido de sodio 6%
- Agua destilada

METODOLOGÍA
1. Curva de calibración para el rojo de fenol. Prepare un sistema de tubos como se indica a
continuación y lea a 540 nm:

2. Curva Estándar para proteínas. Micro método de biuret (Brewer y col 1974). Prepare un
sistema de tubos como se indica a continuación e incube por 15 minutos a 37 °C. Transcurrido
este tiempo se lee a 330 nm frente a un blanco apropiado.

RESULTADOS

1. Curva de calibración para el rojo de fenol

 Absorbancia respecto de la concentración de Rojo de Fenol

2. Curva Estándar para proteínas.

 Grafica de la Curva Estándar para proteínas absorbancia vs longitud de onda

DISCUSIÓN:
En la curva de calibración para el rojo fenol se preparó un sistema de tubos que se leerá
los 540 nm gracias fotoespectometro, el cual se utilizó para el desarrollo del cuadro
buffer borato 0.1 M, pH 9.8, rojo de fenol 1 x 10-4 M y agua destilada para su curva de
calibración.
Para la calibración del Rojo de Fenol y Proteínas se graficó los valores de absorbancia
en las ordenadas y la concentración del colorante en las abscisas y realizando la
regresión lineal, se debía obtener una línea recta con una inclinación de
aproximadamente 45°.esta es de forma ascendente hasta llegar casi s los mismos datos
en la longitud de onda.
En la curva estándar para las proteínas se utilizó el micro método de biuret, el cual se
va prepare un Sistema de tubos que se va incubar por 125 minutos a 37 °C., nos resulta
el gráfico de forma ascendente.

EXPERIMENTO 3:

MATERIALES Y MÉTODOS.-
- Espectrofotómetro
- Tubos de ensayo
- Gradillas
- Pipetas
- Rojo de fenol 1x10-4 M
- Buffer fosfato 0.1 M
- Agua destilada

Metodología: El pK del rojo de fenol es aproximadamente 7.8. Prepare el siguiente

sistema de tubos:
RESULTADOS

Tubo Ab [A-] [T] - [A-] [A-] / log [A-] / pH

moles [T] - [T] - [A-]
[A-]

Bl

1
0.038 0.0000009 0.0000092 0.978 −3 7.2
− 9. 661𝑥10

2
0.051 0.0000012 0.000087 0.0137 -1.863 7.6

3
0.062 0.0000015 0.000086 0.0174 -1.759 7.8

4
0.095 0.000023 0.000076 0.3026 -0.519 8

5
0.154 0.0000037 0.0000062 0.596 -0.224 8.4

6
0.241 0.0000058 0.0000041 1.414 0.150 8.8
DISCUSIÓN

El rojo de fenol (también conocido como fenolsulfonaftaleína o PSP) es un indicador

de color utilizado en química para mediciones ácido-base. Su PKa es 8.0. Su forma
ácida es amarilla. La forma básica es roja. Su región de transición en la escala de pH
oscila entre 6,6 y 8,4. En medios ácidos, el color rojo del fenol no está ionizado, en
soluciones alcalinas está totalmente ionizado [A-] y en tampones de pH 7,8 (o 7,6),
las dos formas se encuentran en la misma concentración.
El gráfico se realiza utilizando el pH como coordenada y el valor logarítmico [A-] /
[T] - [A-] como eje horizontal, y la regresión lineal produce una línea recta. Función
lineal, tipo y = ax + b ( y = 1,1373x + 8,4419), b = pK, 1 = 1, y = pH, x =
log[A-]/[T]-[A-].
El punto de intersección con el eje Y es 8,4419, lo que indica un valor de pKa para el
rojo de fenol muy cercano al valor teórico, con un error del 5 %.

CONCLUSIONES:

- El pKa del rojo de fenol se puede calcular por disociación en diferentes medios
de pH, concluyendo que a mayor pH del medio, más se disocia el compuesto.
 Por otro lado, cuando el pH desciende, el ácido se disocia nuevamente y se
combina con los protones H+ en menor grado de disociación. Es decir, habrá
menos productos que reactivos. Dado que la absorbancia es diferente para
cada solución (para pH diferentes a los del tampón que contiene rojo de
fenol), podemos determinar el pka relacionándolo con la concentración inicial
de [A-] frente a [T-A-] y el logaritmo del aumento de pH.

- Las curvas de calibración de rojo de proteína y fenol muestran un gráfico

lineal entre la absorbancia y la concentración de cada compuesto. Es
dependiente de la concentración y depende del coeficiente de determinación.
Esta curva representa un buen modelo lineal. Ainsi, asegúrese de que la
semilla de Bia-Lambert sea válida.
- La longitud de onda de la radiación que una molécula puede absorber y la
eficiencia de absorción dependen de su estructura atómica y de las
condiciones ambientales.

REFERENCIAS

- Navarro O.R.; Mestas V., B. (2022). Práctica 2: Calorimetría y fotometría.

Manual de Prácticas de Bioquímica p. 6-18.

- Martinez, M. (s. f.). Colorimetria. Recuperado 21 de septiembre de 2022, de

https://es.slideshare.net/Marlenpmtz/colorimetria-61067922

CUESTIONARIO
1. Un compuesto presenta un máximo de absorción a 660 nm. Para una
concentración 0.75µM se obtuvo una absorbancia de 0.4. Sabiendo que el límite de
sensibilidad del método utilizado es de 0.1 µM a 3 µM, calcule la concentración de
este mismo compuesto correspondiente a una absorbancia de 0.85.
2. Una disolución de ATP 10 -5 M tiene una transmitancia de 0.702 (70.2%) a 260
nm en una cubeta de 1 cm de espesor. Calcular a) la transmitancia de la disolución en
una cubeta de 3 cm, b) la absorbancia y la transmitancia de una disolución de ATP de
5 x 10 -5 M en una cubeta de 1 cm.
3. Un filtro óptico permite solamente el paso de la luz roja lejana, con una longitud
de onda media de 6500 Å. Calcular a) la longitud de onda en nm y en cm, b) el
número de ondas en cm-1 , y c) la frecuencia.
4. El coeficiente de absorción específico de un complejo de glucógeno-iodo a 150 nm
es0, 20. Calcular la concentración de glucógeno en una disolución del complejo
yodado que tiene una absorción de 0.38 en una cubeta de 3 cm de espesor.
5. Un enzima puro que contiene molibdeno tiene un coeficiente de absorción
específico de 1.5 en una cubeta de 1 cm de espesor. Una disolución concentrada de la
proteína se vio que contenía 10,56 mg de Mo/ml. La misma disolución diluida 1:50
tenía un valor de absorbancia a 280 nm igual a 0.375. Calcular el peso molecular
mínimo de la enzima.

El peso atómico del Mo es 95.94.

6. Una disolución que contiene NAD+ y NADH tiene una densidad óptica, en una
cubeta de 1cm de espesor de 0.311 a 340 nm y de 1.2 a 260 nm. Calcular las
concentraciones delasformas oxidada y reducida de la coenzima en la disolución.
Ambos (NAD+ y NADH) absorben a 260 nm, pero a 340 nm solo absorbe el NADH.
Los coeficientes de extinción se dan en la siguiente tabla: COMPUESTO 260 nm 340
nm NAD 18000 ~0 NADH 15000 6220
Anexos:

Fig 1. Blanco de muestra

Fig 2. Reactivos del experimento 1

Fig 3. Reactivos del experimento 2: Rojo de fenol 1x10-4 M, Buffer borato 0.1 M, pH
9.8 , Solución estándar de SBA 2mg/ml
fig 4. Espectro de absorcion del rojo fenol

fig 5. Experimento 2 demostración de la ley de beer

fig 6. pHmetro que se usa en el experimento 3