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MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA R.

NAVARRO
B. MESTAS
G. SUCASACA

PRACTICA N° 10

GLICOLISIS
PRODUCCION DE ACIDO PURIVICO DURANTE LA FERMENTACION DE
LA GLUCOSA POR LA LEVADURA Y SU IDENTIFICACION

INTRODUCCION
La glicólisis es el proceso por el cual la glucosa se degrada a Etanol y CO2, y/ó a ácido
láctico dependiendo del organismo que lo efectúe.

Ambas rutas de fermentación son similares hasta la formación de piruvato,


manteniendo idénticas las etapas de conservación de energía que conducen a la formación
de ATP.

La glucólisis no solo es la ruta principal para el metabolismo de la glucosa que conduce


a la producción de Acetil−Co−A y a su oxidación en el ciclo del ácido cítrico, sino que también
proporciona una vía importante para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los
alimentos. La característica de la glucólisis de proporcionar ATP en ausencia de oxígeno es
de significado crítico biomédico, porque permite al músculo esquelético hacer un trabajo
sumamente eficiente aún cuando la oxidación aeróbica se vuelva insuficiente, a la vez que
los tejidos con capacidad glucolítica pueden sobrevivir a episodios de anoxia. Inversamente,
el músculo cardíaco, que está adaptado al trabajo aeróbico, tiene una capacidad glucolítica
relativamente deficiente y supervivencia escasa bajo condiciones de isquemia. Hay un
número pequeño de enfermedades en las que las enzimas del sistema glucolítico como por
ejemplo la piruvatocinasa muestran actividad deficiente; estas anomalías se manifiestan
principalmente como anemias hemolíticas. En las células cancerosas que proliferan con
rapidez, la glucólisis procede a una velocidad mucho mayor que la requerida por el ciclo del
ácido cítrico; por tanto, se produce más piruvato que el que puede ser metabolizado. El
resultado es una producción excesiva del lactato, que favorece un entorno local relativamente
ácido en el tumor, situación que puede tener implicaciones con ciertos tipos de terapéutica
contra el cáncer. También se produce acidosis láctica por deficiencia de piruvato
deshidrogenasa.

OBJETIVOS
- Demostrar la formación de ácido pirúvico durante la fermentación de la glucosa por
levadura.
- Producir e identificar ácido pirúvico a partir de glucosa.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Tubos de centrifuga
Trípode, rejilla con asbesto, mechero
Baño maría
Pipetas
Centrifuga
Vasos de precipitados de 250 y 600 ml.
Pinzas para tubos de ensayo.
Solución de glucosa a diversas concentraciones 0.5, 1.0 y 2.0%
Suspensión de levadura al 5 % en Na2HPO4 y KH2PO4 (18 hrs de fermentación antes de
su utilización).
Acido tricloroacético al 10%
Nitroprusiato de sodio.
2,4 dinitrofenilhidracina.
Hidróxido de amonio concentrado.
Hidróxido de sodio 0.1N

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Sulfato de amonio sólido.


PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N° 1. FORMACIÓN DE PIRUVATO


 Marcar dos series de tubos de 3 cada una y adicionar 3 ml de las soluciones de glucosa a
las diferentes concentraciones (0.5, 1.0, 2.0%) a ambas series.
 A una de las series de tubos adicionarles 3 ml de suspensión de levadura con fosfatos de
sodio (0.213 g/100 ml) y marcarlos como A; y a la otra serie adicionarle 3 ml de la
suspensión de levadura con fosfatos de potasio (0.09 g/100 ml) y marcarlos como B.
 Colocar todos los tubos en baño maría a 37ºC por 30 minutos y añadir posteriormente a
cada tubo 1 ml de TCA al 10%. Mezclar vigorosamente y centrifugar a 2500 r.p.m. por 10
minutos. Separar el sobrenadante y desechar el precipitado.

EXPERIMENTO N° 2. IDENTIFICACIÓN DE PIRUVATO


Reacción con nitroprusiato de sodio. En un tubo de ensayo colocar 1 ml del sobrenadante
obtenido y hervirlo. Adicionarle 0.5 g de sulfato de amonio sólido y agitar. Agregar dos gotas
del reactivo y mezclar vigorosamente y dejar deslizar por las paredes del tubo unas gotas de
hidróxido de amonio concentrado, hasta la formación de dos capas. La formación de un anillo
verde o azul en la interfase indica que la reacción es positiva. Repetir lo anterior para cada
uno de los tubos de ambas series. Esquematice e interprete sus resultados.

EXPERIMENTO N° 3. IDENTIFICACIÓN DE ACETALDEHÍDO


Reacción con 2,4 dinitrofenilhidracina. En un tubo de ensayo colocar 1 ml del
sobrenadante obtenido y adicionar 1 ml del reactivo, agitar con fuerza y pasar a otro tubo la
mitad de la mezcla formada, y adicionar 1 ml de NaOH 0.1N. La aparición de un color rojo
indica reacción positiva. Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series.
Observar la coloración e intensidad de la misma en cada caso. Esquematice e interprete sus
resultados.

RESULTADOS

Tabla 1. Formación de Piruvato y Acetaldehído en Na2HPO4 y KH2PO4. Cortesía de Kevin Cervantes


Tuero.

Na2HPO4 KH2PO4
% Glucosa 0.5 1 2 0.5 1 2
Prueba de Piruvato - + ++ - - -
Prueba de Aceltadehído + ++ +++ - - -

Figura 1. Determinación de Acetaldehído. En la serie A se utilizó Na2HPO4 y en la serie B KH2PO4. Foto


cortesía de Kevin Cervantes Tuero.

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DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA


CUESTIONARIO
1. Qué finalidad tiene adicionar a la suspensión de levadura Na2HPO4 y KH2PO4?

2. Por qué se adiciona TCA al 10%?

3. Identifique y esquematice las reacciones estudiadas

4. Cuántos enlaces fosfato de alta energía surgen en el catabolismo de la glucosa en


condiciones anaeróbicas?

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