UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

TRABAJO DE INVESTIGACION:

- High performance liquid chromatography (Cromatografía líquida de alta

resolución).

RESPONSABLES:

- Alarcón Rengifo Patrick Kluiver

- Bedoya Tello Franco Luis
- Espinoza Ramírez Karol Damaris
- Huayana Pérez Hugo
- Mananita Huamán María
- Mori García Caleb Edilberto
- Noreña Duran Amanda
- Panduro Lozano Enssi Kristina
- Rios Lescano Shirley Sofía
- Sara Carrascal Ariana Atenas
- Satalaya Pérez Sarbia Noemí
- Scharff Alvis Gina Alexandra
- Sara Carrascal Ariana Atenas
- Sarmiento Herrera Javier Alexander
- Villagomez Asipali Jhonny Alberto
- Villanueva Fernández Aoner
DOCENTE:

- Ing. M.Sc. Edgar Vicente Santa Cruz

CURSO:

- Técnicas Y Metodos Instrumentales De Análisis Para

CICLO:

- V

PUCALLPA- PERU
 Tabla de contenido
I. Introducción ................................................................................................... 3
II. Fundamentos y principios ............................................................................. 4
III. Marco teórico ............................................................................................... 4
3.1. HPLC (cromatografía líquida de alta presión) ....................................... 4
3.2. Tipos de HPLC .......................................................................................... 4
3.2.1. Cromatografía de fase normal .......................................................... 4
3.2.2. Cromatografía de fase reversa ......................................................... 5
3.2.3. Cromatografía de exclusión molecular. ........................................... 5
3.2.4. Cromatografía de intercambio iónico .............................................. 6
3.2.5. Cromatografía basada en bioafinidad .............................................. 6
3.3. Parámetros ............................................................................................... 7
3.3.1. Diámetro interno ................................................................................ 8
3.3.2. Tamaño de poro ................................................................................. 8
3.4. Instrumentación ....................................................................................... 8
3.4.1. Sistema de bombeo ......................................................................... 10
3.4.2. Sistemas de inyección de muestra ................................................ 11
3.4.3. Válvula de seis vías para un sistema de inyección en HPLC ...... 11
3.4.4. Columnas Analíticas en HPLC........................................................ 11
3.4.5. Precolumnas .................................................................................... 11
3.4.6. Columnas termos atizadas ............................................................. 12
3.4.7. Relleno de la columna ..................................................................... 12
3.4.8. Detectores en HPLC ........................................................................ 12
3.5. Características de la técnica HPLC ...................................................... 12
3.6. Aplicaciones de HPLC ........................................................................... 13
3.7. Aplicación en la industria alimentaria .................................................. 14
3.7.1. Campos de Aplicación de HPLC .................................................... 17
IV. Conclusiones ............................................................................................. 18
V. Anexos .......................................................................................................... 19
VI. Bibliografía ................................................................................................. 23
I. Introducción
En el presente trabajo hablaremos del HPLC, este es un tipo de
cromatografía, esta se inicio a partir de un experimento desarrollado en 1906,
por el botánico Ruso Mikhail Tswett, con el fin de separar los colorantes que
componen a las plantas, este mismo experimento consistió en aplicar una
muestra de y un eluyente por el extremo de una columna abierta, esta
alimentada por la gravedad, y que contenía una fase estacionaria, logrando
que las sustancias mas afines al solvente salieran de la columna más
rápidamente que las menos afines. Esta técnica se usa ampliamente en
química y bioquímica, para separar los diferentes componentes de una
mezcla compleja.
La Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada
frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina
a veces Cromatografía líquida de alta presión o Cromatografía Líquida de
Alta Resolución (High pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque este
término se considera antigua y está en inutilidad. El HPLC es una técnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en
diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y
la columna cromatográfica.
Los componentes de la muestra separados en el HPLC pasan al
espectrómetro de masas a través de una interfaz donde son ionizados. Los
equipos de LC-MS pueden tener dos tipos distintos de interfases que se
incluyen dentro de la denominada ionización a presión atmosférica (API),
denominadas electrospray (ESI) e ionización química a presión atmosférica
(APCI), ambas son compatibles con la mayoría de los solventes volátiles
utilizados como fase móvil en HPLC. Los iones generados en la interfase son
acelerados hacia un analizador y separados en función de su relación
masa/carga (m/z) mediante la aplicación de campos eléctricos, magnéticos o
simplemente determinando el tiempo de llegada a un detector. Los iones que
llegan al detector producen una señal eléctrica que es procesada, ampliada
y enviada a un ordenador.
El registro obtenido se denomina espectro de masas y representa las
abundancias iónicas obtenidas en función de la relación masa/carga de los
iones detectados.
 II. Fundamentos y principios
La cromatografía de líquidos de alta resolución es una técnica que permite
separar, aislar e identificar los analitos de una mezcla de compuestos
químicos, utilizando una fase móvil líquida que fluye a través de una columna,
la cual contiene a la fase estacionaria.
Los componentes individuales de la muestra y la fase móvil se desplazan por
la columna forzados por una alta presión suministrada por una broma. De esa
forma, la separación cromatográfica de la muestra es el resultado de las
interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases,
móvil y estacionaria.
La utilización de la presión incrementa la velocidad lineal de los compuestos
dentro de la columna y reduce así su difusión, mejorando la resolución de
cromatografía.

III. Marco teórico

3.1. HPLC (cromatografía líquida de alta presión)
High performance liquid chromatography (Cromatografía líquida de alta
resolución) es una técnica que es utilizada para aislar los componentes
de una mezcla. Radica en un período estacionario no polar y un período
móvil. El periodo estacionario es una sustancia que muestra afinidades
diferentes para los distintos componentes en una mezcla de la muestra.
El periodo móvil actúa como portador de muestras. La muestra en
solución se introduce al periodo móvil. Los componentes de la solución
se mueven de acuerdo con la interacción no covalente de los compuestos
con la columna. Estas interacciones químicas determinan la separación
del contenido de la muestra. El uso de diferentes detectores dependerá
de la naturaleza de los compuestos que se detecten.
3.2. Tipos de HPLC

3.2.1. Cromatografía de fase normal

La cromatografía de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-
HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo
de la química, y se caracteriza por separar los compuestos en
base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria
polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto
de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es
retenido por el periodo estacionaria. La fuerza de adsorción
aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la
interacción entre el compuesto polar y el periodo estacionaria
polar (en comparación al periodo móvil) aumenta el tiempo de
retención. La fuerza de interacción no sólo depende de los
 grupos funcionales del compuesto de interés, sino también en
factores estéricos de forma que los isómeros estructurales a
menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de
disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de
retención de los compuestos mientras que los disolventes más
hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.
3.2.2. Cromatografía de fase reversa
La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase
estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una
de las fases estacionarias más comunes de este tipo de
cromatografía es la sílice tratada con RMe2SiCl, donde la R es
una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de
retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar,
mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más
rápidamente. El tiempo de retención aumenta con la adición de
disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción
de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase
reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin
ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase
reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas
que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente
relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una
fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del
compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del
segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto
hidrofóbico está dominado por el aumento de la entropía, y la
consecuente disminución de la energía libre, asociada con la
minimización de la interfase compuesto-disolvente polar. El
efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar
a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de partición de forma
que el compuesto se mueve por la columna y eluye.
3.2.3. Cromatografía de exclusión molecular.
La cromatografía de exclusión molecular, también conocida
como cromatografía por filtración en gel, separa las partículas de
la muestra en función de su tamaño. Generalmente se trata de
una cromatografía de baja resolución de forma que se suele
utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También
es muy útil para la determinación de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteínas purificadas. La
cromatografía de filtración molecular es un método de
cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan
en solución según su peso molecular, o más precisamente,
 según su radio de Stokes. En esta cromatografía, la fase
estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que
forman una red tridimensional porosa. A los fines prácticos, las
columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales
formadas por esos polímeros entrecruzados. En consecuencia,
estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal que
algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar
a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeñas)
podrán pasar libremente. Los poros quedan conectados
formando una malla o red, lo cual determina una serie de
caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al
interior de esta.
3.2.4. Cromatografía de intercambio iónico
En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa
en la atracción electrostática entre los iones en solución y las
cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la
misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta
son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores
iónicos son:
• Resinas de poliestireno
• Intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles).
• Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado.
En general los intercambiadores iónicos favorecen la unión de
iones elevada carga y radio pequeño. Un incremento en la
concentración del contraión (respecto a los grupos funcionales
de la resina) reduce el tiempo de retención. Un incremento en el
pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de
intercambio catiónico mientras que una disminución del pH
reduce el tiempo de retención en las cromatografías de
intercambio aniónico. Este tipo de cromatografía es ampliamente
utilizado en las siguientes aplicaciones: purificación de agua,
concentración de componentes traza, etc.
3.2.5. Cromatografía basada en bioafinidad
Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las
sustancias biológicamente activas de formar complejos estables,
específicos y reversibles. La formación de estos complejos
implica la participación de fuerzas moleculares como las
interacciones de Van der Waals, interacciones electrostáticas,
interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofóbicas y puentes
de hidrógeno entre las partículas de la muestra y la fase
estacionaria
3.3. Parámetros
El detector registra cambios en alguna propiedad de eluyente. Los
cambios son registrados en función del tiempo. El diagrama de la
respuesta del detector en función del tiempo se llama cromatograma
El término parámetro se emplea para referirse a una cantidad que toma
diferentes valores y caracteriza a un proceso, operación o resultado. nos
permiten tabular y comunicar los datos con mayor facilidad.
Los parámetros cromatográficos que describen al cromatograma se
correlacionan exitosamente con las descripciones de los procesos
moleculares que ocurren en el curso de las separaciones. Los
parámetros son datos primarios. Las descripciones son modelos para
explicar los fenómenos.
Los modelos son analogías matemáticas que se deducen de los datos y
de la química descriptiva.
• Parámetros de las bandas individuales
- VM o V 0: volumen muerto o volumen extra columna
Es el volumen entre las partículas de fase estacionaria, más el
volumen de la tubería y el detector. Es el volumen mínimo de
eluyente que transporta a una sustancia no retenida por la fase
estacionaria desde el punto de inyección hasta el detector.
Para poder medirlo se inyecta una sustancia que no
interaccione con la fase estacionaria junto con la muestra. Es
el primer pico que aparece en el cromatograma.
- V R: volumen de retención
Es el volumen que eluye de la columna desde la inyección de
la muestra hasta que se produce el máximo del pico
correspondiente a una sustancia que ha interactuado con la
fase estacionaria.
- t R: tiempo de retención
Es el tiempo que tarda un soluto que interacciona con la fase
estacionaria para emerger de la columna, medido en el
máximo del pico
- W b: ancho del pico en la base
Se obtiene trazando las tangentes en los puntos de inflexión a
ambos lados del contorno de banda.
 Los picos o bandas de los cromatogramas son independientes por lo
tanto cada conjunto de parámetros lo es. Cada una de las cantidades
anteriores describen cada pico y cada pico (si está resuelto) es una única
sustancia.
Con frecuencia los parámetros mencionados se usan de forma que se
pueda obtener ciertos puntos, además de otras cantidades para se
obtienen de los parámetros anteriores:
• Volumen de retención neto:
VNi = VRi - V M
• Tiempo de retención neto:
tNi = tRi – t M
3.3.1. Diámetro interno
El diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto
crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar
a la columna y también influye en su sensibilidad. Las columnas
de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan
normalmente en la purificación de compuestos para su utilización
posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-
5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se
caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del
consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se
suelen denominar columnas de rango analítico y normalmente
están asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen otros tipos
de columnas, como las de tipo capilar, con un diámetro inferior a
0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometría de masas.
3.3.2. Tamaño de poro
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una
mayor superficie. Los poros pequeños proporcionan una mayor
superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan
una cinética mejor, especialmente para los compuestos de
tamaño más grande; por ejemplo, una proteína que sea
ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros puede
entrar, pero difícilmente saldrá con facilidad.
3.4. Instrumentación
Los equipos de cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)
trabajan a grandes presiones, por lo que son complejos y caros. Sus
componentes fundamentales se aprecian en el siguiente esquema:
 • Sistema de suministro y almacenamiento de fase móvil
• Sistema de bombeo
• Sistema de inyección de muestra
• Columna cromatográfica
• Detector
• Sistema de suministro y almacenamiento de fase móvil
Garantiza la disponibilidad de fase móvil al sistema en condiciones
apropiadas, de modo que se evite la contaminación y la degradación de
la misma.
La fase móvil en HPLC está formada por un disolvente o por una mezcla
de ellos, cada uno de los cuales está contenido en un recipiente,
generalmente de vidrio, aunque en ocasiones se emplean otros
materiales, como el politetrafluoroetileno. Los recipientes deben disponer
de tapones que impidan la contaminación por gases o partículas en
suspensión presentes en el aire del laboratorio.
Para evitar flujos inestables, la formación de burbujas o la interferencia
de partículas extrañas los disolventes deben estar filtrados y
desgasificados. Esto puede realizarse mediante un tratamiento previo
que elimine los gases y la materia en suspensión (filtros milipore) o bien
integrando sistemas de filtrado y desgasificación en el equipo de HPLC.
La elución se puede realizar de dos maneras:
• Elución isocrática: cuando se emplea un único disolvente o una
mezcla de disolventes de composición constante.
• Elución en gradiente: cuando se emplea una mezcla de
disolventes cuya concentración se hace variar a largo del proceso,
con el fin de modificar la polaridad de la fase móvil y disminuir el
tiempo de separación (es un efecto semejante al que se produce
cuando modificamos la temperatura en cromatografía de gases).
Los instrumentos modernos están equipados con válvulas de
alimentación que permiten controlar de manera programada la velocidad
de flujo de cada disolvente en cada instante.
3.4.1. Sistema de bombeo
Todos los sistemas HPLC incorporan un sistema de bombeo, con
las siguientes características:
- Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400
atm.
- Mantener un flujo libre de pulsos
- Proporcionar caudales constantes y reproducibles
- Permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido
- Ser químicamente inerte y resistente a la corrosión
Las más empleadas son las bombas recíprocas, que consisten en
una pequeña cámara en la que el disolvente es impulsado por el
movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Las
entrada y salida del disolvente se regula mediante dos válvulas
antirretorno que se abren y cierran alternativamente, permitiendo
el paso de fluido en un solo sentido.
Entre las ventajas que presentan se encuentran: pequeño
volumen interno, altas presiones de salida, caudales constantes y
compatibilidad con la elución en gradiente. Sin embargo, generan
 un flujo pulsado, que se ha de amortiguar para evitar la generación
de ruido.
3.4.2. Sistemas de inyección de muestra
La inyección de un volumen de muestra preciso, y muy pequeño
(5-500 μL), debe hacerse a la entrada de la columna en un breve
periodo de tiempo para perturbar lo menos posible el régimen de
circulación de la fase móvil y evitar el ensanchamiento de banda.
La reproducibilidad de la inyección va a condicionar la precisión de
las medidas.
El sistema de inyección está formado por válvulas rotatorias de
alta presión de varias vías manuales o automatizadas. Constan de
un doble circuito, uno de los cuales está conectado al exterior y el
otro al propio sistema, pudiendo intercambiarse de forma rápida y
simple entre las dos posiciones:
3.4.3. Válvula de seis vías para un sistema de inyección en HPLC
Con la válvula en la posición de llenado de la izquierda la fase
móvil pasa de la bomba a la columna mientras que la muestra se
inyecta en el otro circuito con forma de bucle. Cuando la válvula
gira hacia la posición de inyección de la derecha, la fase móvil
arrastra la muestra hacia la columna. El objetivo de utilizar este
tipo de válvulas es de no interrumpir el flujo de fase móvil a través
de la columna e introducir en el flujo de la misma un volumen de
muestra que estará contenida en un tramo de tubería de volumen
fijo.
3.4.4. Columnas Analíticas en HPLC
Son columnas rectas, fabricadas habitualmente de acero, aunque
también se emplean columnas construidas de vidrio y materiales
poliméricos. La mayoría de ellas tienen una longitud entre 5 y 30
cm, y su diámetro interno varía entre 3 y 10 mm. Los rellenos más
comunes son de 5 a 10 μm y se mantienen en el interior del tubo
mediante cierres porosos de metal o de vidrio. Actualmente
existen columnas de mayor eficacia y dimensiones más reducidas,
que superan los 100.000 platos/metro con un consumo mínimo de
disolvente (lo cual abarata considerablemente el proceso).
3.4.5. Precolumnas
Las columnas son delicadas y caras, por lo que se emplean
precolumnas, de composición similar a la de la columna (aunque
con un diámetro de partícula de mayor tamaño para minimizar la
caída de presión). Las precolumnas eliminan los contaminantes,
la materia en suspensión y aquellos componentes que se unen de
manera irreversible a la fase estacionaria, de manera que cuando
 está muy contaminada, se vacía y se rellena de nuevo o se
reemplaza por otra nueva.
3.4.6. Columnas termos atizadas
En algunas ocasiones se obtienen mejores resultados calentando
la columna, ya que la viscosidad del disolvente disminuye (se
consigue un mayor caudal o se reduce la presión requerida) y se
acortan los tiempos de retención. Sin embargo, un aumento de la
temperatura también puede degradar la fase estacionaria y reducir
el tiempo de vida de la columna, por lo que se deben emplear
hornos que controlen la temperatura de una manera muy precisa
(de décimas de grado).
3.4.7. Relleno de la columna
El relleno empleado en las columnas de HPLC debe ser
químicamente inerte, mecánicamente resistente y poseer un
tamaño de partícula bien definido. Habitualmente está formado por
partículas esféricas micro porosas de sílice muy puro, que son
permeables al disolvente y presentan una elevada área superficial
(no puede emplearse con fases móviles cuyo pH sea mayor que
8). También se emplean rellenos de alúmina (u otros óxidos
metálicos), grafito poroso o materiales poliméricos (como estireno-
divinilbenceno).
El relleno puede actuar como mero soporte de una fase
estacionaria líquida o, convenientemente tratado, puede intervenir
directamente en el proceso de separación.
3.4.8. Detectores en HPLC
A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de
líquidos no hay detectores universales tan fiables como lo son el
detector FID o el TCD. Sus características (sensibilidad,
estabilidad, reproducibilidad, respuesta lineal, tiempo de
respuesta corto, fácil manejo) son similares a éstos, aunque no es
necesario que sean sensibles en un intervalo de temperaturas tan
elevado y deben tener un volumen interno mínimo para reducir el
ensanchamiento de banda extra columna.
3.5. Características de la técnica HPLC
Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)
Es un tipo de cromatografía en columna en el que, por acción de una
bomba, se hace pasar una mezcla de compuestos o analitos en un
sistema comúnmente conocido como fase móvil. La fase móvil pasa a
través de una columna cromatografía, que contiene la fase estacionaria
 a un flujo especificado. La separación de los compuestos ocurre en base
a la interacción de los mismos con la fase móvil y la fase estacionaria.
Características:
• Disponible comercialmente
• Precio
• Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de
calidad de pureza cromatografía. Bajo contenido de impurezas.
• Disolver la muestra
• Visible con otros solventes para formar mezclas útiles
• No degradar o disolver la fase estacionaria
• Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
• Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica
(cuando se usan detectores UV)

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar

los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no
polar (columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha
tratado con RMe2SiCl. La fase móvil actúa de portador de la muestra. La
muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de
la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los
compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan
la separación de los contenidos en la muestra. La utilización de los
diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a
determinar.
3.6. Aplicaciones de HPLC
El uso del gas especial y el equipo correctos cuando realice una
cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) mejorará
considerablemente la precisión de sus resultados.
La HPLC es particularmente útil para la separación de materiales con
grandes pesos moleculares que presentan una volatilidad muy baja y no
pueden separarse mediante cromatografía de gases. Se usa
 principalmente en la biotecnología, en ciencias y la industria
farmacéutica.
La HPLC utiliza una fase móvil líquida para separar los componentes de
la muestra. Los componentes se disuelven en un disolvente y a
continuación se hacen pasar por la columna a una gran presión. A
continuación, interactúan con la fase estacionaria y salen en momentos
distintos, igual que ocurre con la cromatografía de gases. Si una cantidad
excesiva de gas permanece disuelta en la fase móvil líquida a la presión
de la columna, el gas puede salir del detector y provocar grandes picos
no deseados. Estos pueden eliminarse mediante el burbujeo de helio de
gran pureza a través del líquido cuando el sistema HPLC no disponga de
un desgasificador integrado. El helio debe presentar unos niveles bajos
de hidrocarburos, ya que estos pueden disolverse en el disolvente y
generar ruido de línea base.
Su gran versatilidad en cuanto aplicaciones es uno de sus puntos más
destacables, entre los campos que podemos resaltar está en la industria
farmacéutica con aplicaciones desde vitaminas solubles en agua hasta
medicamentos como el omeprazol.
Ahora bien, esto no significa que solo en la industria farmacéutica se
encuentren sus aplicaciones más usadas, también la diversidad de
detectores (de los cuales hablaremos más adelante) hacen parte crucial
para la industria, un ejemplo claro es para la industria alimentaria la cual
busca constantemente desde mono y disacáridos hasta cadenas grandes
de azúcares como lo son los oligosacáridos y polisacáridos, para este
tipo de análisis la cromatografía HPLC con detector de índice de
refracción será la opción indicada. También el estudio de aminoácidos y
micotoxinas es un fuerte pilar para las empresas de alimentos.

3.7. Aplicación en la industria alimentaria

La cromatografía engloba a un conjunto de técnicas analíticas basadas
en la separación de los componentes de una mezcla y su posterior
detección y/o cuantificación. Las técnicas cromatográficas son muy
variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido
(gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de
una fase estacionaria, que se trata de un sólido o un líquido fijado en un
sólido.
Clasificación Las distintas técnicas cromatográficas se pueden dividir
según cómo esté dispuesta la fase estacionaria:
 - Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una
placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son
cromatografía en papel y cromatografía en capa fina
- Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro
de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se
distinguen:
- Cromatografía de líquidos
- Cromatografía de gases
- Cromatografía de fluidos supercríticos

Cromatografía de líquidos
El botánico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919)
empleó por primera vez en 1906 el término "cromatografía" (que proviene
del griego chroma y graphein que significan a su vez respectivamente
"color" y "escribir").
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en
inglés) se utiliza frecuentemente en bioquímica y química analítica para
separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos
de interacciones químicas entre las sustancias a analizar (contenidas en
la fase móvil), y la columna cromatográfica (fase estacionaria), mediante
el bombeo de la fase móvil a través de la columna.
El tiempo de retención de los componentes de la muestra depende de la
naturaleza de ésta, de la composición de la fase estacionaria y de la fase
móvil y se considera una propiedad característica de dicho compuesto
bajo determinadas condiciones.
La unidad cuenta con un equipo de HPLC, Infinity 1260 de Agilent con un
detector de luz UV-visible (190-700 nm) en línea con hasta cinco
longitudes de onda simultáneas y/o un detector por dispersión de luz
evaporativa (ELSD, por sus siglas en inglés; utilizado comúnmente para
el análisis de compuestos que no absorben la radiación UV tales como
los azúcares, antivirales, antibióticos, lípidos, fosfolípidos, terpenoides y
alcoholes) en el que se puede usar una amplia gama de columnas
cromatográficas de diversos tipos como son: filtración en gel, interacción
hidrofóbica e intercambio iónico
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno que provoca la
separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:
1. Cromatografía de adsorción: La fase fija es un sólido y se utiliza
casi exclusivamente sílice (sílica) y en mucha menor medida
alúmina.
2. Cromatografía de reparto: En la mayoría de los casos, como fase
estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a un
soporte sólido de sílica. Se la subdivide en cromatografía en fase
normal y fase reversa. En la cromatografía en fase normal, la fase
fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los
compuestos menos polares eluyen primero. En la cromatografía
en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un
hidrocarburo alifático y se emplean fases móviles polares. En este
caso, las sustancias más polares eluyen primero.

3. Cromatografía iónica:
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico
para separar y determinar iones.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño:
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que
contienen una red uniforme de poros y llevan a cabo un
fraccionamiento relacionado con el tamaño molecular. Las
moléculas de tamaño mayor son excluidas y eluyen primero,
mientras que las más pequeñas que penetran en los poros son
retenidas más tiempo.
El detector es la parte del cromatógrafo que se encarga de
determinar cuándo ha salido el analito por el final de la columna.
Las características de un detector ideal son:
- Sensibilidad. Respuesta lineal al analito.
- Tiempo de respuesta corto
 - Intervalo de temperatura de trabajo amplio
- Estabilidad y reproducibilidad
- Respuesta selectiva y predecible

5. Cromatografía de gases
La cromatografía de gases es útil para el análisis de gases o para
analitos relativamente volátiles, lo que incluye a numerosos
compuestos orgánicos. En esta técnica la muestra se volatiliza y
se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica.
Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la
cromatografía gas-sólido (GSC) y la cromatografía gas-líquido
(GLC), siendo esta última la que se utiliza más ampliamente, y que
se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC).
La GC tiene dos importantes campos de aplicación. Por una parte,
su capacidad para separar mezclas orgánicas complejas,
compuestos organometálicos y sistemas bioquímicos. Su otra
aplicación es como método para determinar cuantitativa y
cualitativamente los componentes de la muestra.
3.7.1. Campos de Aplicación de HPLC
• Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos.
• Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos.
• Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos.
• Productos de la industria química: Aromáticos condensados,
tensoactivos, propulsores, colorantes.
• Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB.
• Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre,
narcóticos
• Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas,
extractos de orina, estrógenos.
• Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa.
• Separación y purificación de metabolitos.
• Separación y purificación de los metabolitos de las drogas
procedentes de muestras de orina.
• Purificación y separación de enantiómeros.
• Purificación de compuestos naturales.
• Purificación y caracterización de enzimas y proteínas.
IV. Conclusiones
Una de las principales ventajas de esta técnica frente a otras metodologías
analíticas clásicas es su especificidad, permitiendo la separación,
identificación y cuantificación de los componentes orgánicos más
complejos.
La HPLC analítica ha adquirido una especial importancia en el campo de
la investigación y desarrollo científico, encargándose del control de calidad
farmacéutico y el análisis medioambiental.
Concluimos que unas de las características más resaltantes del HPLC es
su alta resolución, su reproducibilidad, alta velocidad, y la capacidad de
automatización que presentan; lo cual la hace ser una de las técnicas más
empleadas en el análisis de diversas formulaciones cosméticas y
alimentarias.
V. Anexos

High Performance Liquid Chromatography, cuya traducción al español es:

Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento, (aunque es conocida como
Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia).

HPLC BREEZE QS
Ofrece análisis de rutina y un rendimiento sólido día tras día, proporcionando la
confianza que necesita para realizar el trabajo. Usados en laboratorios de todo el
mundo, los laboratoristas saben que obtendrán datos confiables en una plataforma
fácil de usar.
 HPLC Compacto De Alto Desempeño Shimadzu I-Series-Plus
El sistema LC integrado de Shimadzu ha renacido como i-Series Plus. Equipado
con tecnología ACTO, el sistema de transferencia del método Nexera-i MT permite
una fácil migración entre HPLC y UHPLC.

Cromatografía en columna 15.

Cromatografía en papel o capa delgada.

Esquema de un cromatógrafo de gases

VI. Bibliografía
- http://www.anmat.gov.ar/webanmat/mercosur/ACTA01-
14/AGREGADO_XVI/2-
14/uni_XIV/Anexo_2_Cromatograf%C3%ADa_V7.pdf
- https://slideplayer.es/slide/10757394/
- https://gdocu.upv.es/alfresco/service/api/node/content/workspace/Spa
cesStore/18923b6c-0080-4aab-b237-
547a4678e10b/TOC_6234_01_01.pdf?guest=true
- http://www.anmat.gov.ar/webanmat/mercosur/ACTA01-
14/AGREGADO_XVI/2-
14/uni_XIV/Anexo_2_Cromatograf%C3%ADa_V7.pdf
- https://scancotec.com/productos/hplc-breeze-qs/
- https://quimica.unam.mx/investigacion/servicios-para-la-
investigacion/usaii/identificacion-y-cuantificacion-de-sustancias-por-
hplc/#:~:text=La%20cromatograf%C3%ADa%20l%C3%ADquida%20d
e%20alta,fase%20m%C3%B3vil)%2C%20y%20la%20columna
- http://www.mundorespuestas.com/2013/07/que-significa-hplc.html