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Toxicón 38 (2000) 1505 ± 1515

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Estructura y actividades biológicas de eumenine

mastoparan-AF (EMP-AF), un nuevo péptido
degranulador de mastocitos en el veneno de la
avispa solitaria ( Anterhynchium ¯avomarginatum
micado)
Katsuhiro Konno a,*, Miki Hisada B, Hideo Naoki B,
Yasuhiro Itagaki C, Nobufumi Kawai D, Akiko Miwa mi,
Tadashi Yasuhara F, Yukiko Morimoto gramo, Yoshihiro Nakata gramo
a Instituto de Biociencias de Rio Claro, Universidad Estatal de Sao Paulo (UNESP), Rio Claro, SP, 13506-900,

Brasil
B Instituto Suntory de Investigación Bioorgánica, Shimamoto, Osaka 618-8503, Japón
C Departamento de Química, Universidad de Columbia, Nueva York, NY 10027, EE. UU.
D Departamento de Fisiología, Escuela de Medicina de Jichi, Minamikawachi, Tochigi 329-0498, Japón
mi Departamento de Neurobiología, Instituto Metropolitano de Neurociencias de Tokio, Fuchu, Tokio 183-8526,

Japón
F Departamento de Nutrición, Escuela Superior de Agricultura, Universidad de Agricultura de Tokio, Setagaya,

Tokio 156-8502, Japón

gramo Instituto de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Medicina de la Universidad de Hiroshima, Hiroshima, Hiroshima

734-8551, Japón

Recibido el 28 de septiembre de 1999; aceptado el 24 de noviembre de 1999

Abstracto

Un nuevo péptido desgranulante de mastocitos, eumenine mastoparan-AF (EMP-AF), fue

aislado de el veneno de la avispa solitaria Anterhynchium ¯avomarginatum micado, la avispa
más común eumenine encontrada en Japón. La estructura se analizó mediante degradación FAB-
Juntos con MS / MS Edman, que se corroboró mediante síntesis en fase sólida. El EMP-AF, Ile ±
secuencia de Asn ± Leu ± Leu ± Lys ± Ile ± Ala ± Lys ± Gly ± Ile ± Ile ± Lys ± Ser ± Leu ±

* Autor correspondiente. Tel: + 55-19-534-8523; fax: + 55-19-534-0009.

Dirección de correo electrónico: kk-gon@rc.unesp.br (K. Konno).

0041-0101 / 00 / $ - ver el documento preliminar 7 2000 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos
reservados. PII: S0041 -0101 (00) 00083-0
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NUEVA HAMPSHIRE 2, era similar al del mastoparán, un péptido desgranulador de mastocitos de un

veneno de avispón; tetradecapéptido con el extremo C amidado y rico en hidrófobos y básicos
aminoácidos. De hecho, EMP-AF exhibió una actividad similar a mastoparán en la estimulación de la
desgranulación de mastocitos peritoneales de rata y células RBL-2H3. También mostró una actividad
hemolítica significativa en eritrocitos humanos. Por lo tanto, este es el primer ejemplo de que se encuentra
un péptido desgranulador de mastocitos en el veneno de avispa solitaria. Además de la desgranulación y la
actividad hemolítica, EMP-AF también afecta la transmisión neuromuscular en la preparación de la pata de
langosta. Tres análogos EMP-AF-1 0 3 se sometieron a síntesis y se probaron biológicamente junto con EMP-
AF, lo que dio como resultado la importancia de la estructura amida C-terminal para las actividades
biológicas. 7 2000 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción

Los venenos de las avispas sociales himenópteros y las abejas como los avispones, las
avispas de papel y las abejas se utilizan para defenderse a sí mismos y a sus larvas. La
picadura con estos venenos produce dolor severo, daño local y ocasionalmente la muerte
en grandes vertebrados, incluido el hombre. Los componentes químicos de estos
venenos están bien documentados; una variedad de aminas, péptidos y proteínas actúan
juntos para producir los efectos biológicos (Habermann, 1972; Nakajima et al., 1986). Por
el contrario, las avispas solitarias utilizan sus venenos de diferentes formas para capturar
presas. Inyectan su veneno a insectos o arañas y paralizan a las presas para alimentar a
sus larvas. Por lo tanto, los venenos de las avispas solitarias deben contener una variedad
de neurotoxinas que actúan sobre el sistema nervioso (Piek, 1986). Sin embargo, hasta
ahora, solo se han estudiado químicamente unos pocos venenos de avispas solitarias.
Triángulo de Philanthus ( Eldefrawi y col., 1988; Piek et al., 1988), y principalmente inhiben
la transmisión neuromuscular mediante el bloqueo del glutamato postsináptico y los
receptores nicotínicos (Nakanishi et al. 1990; Piek y Hue, 1989). Los venenos de las
avispas escoliides Megascolia ¯avifrons y Colpa interrupta
contienen péptidos similares a la bradicinina (Piek et al., 1990; Yasuhara et al., 1987), que
bloquean presinápticamente los receptores nicotínicos de acetilcolina (Piek, 1991). Hemos
estudiado sustancias biológicamente activas en venenos de avispas solitarias que habitan en
Japón y hemos encontrado nuevas neurotoxinas peptídicas, pompilidotoxinas (PMTX), de los
venenos de las avispas araña. Anoplius samariensis y Batozonellus maculifron
(Konno et al., 1998). Los PMTX no solo afectan el sistema nervioso de los invertebrados,
mostrando una poderosa acción facilitadora sobre la transmisión neuromuscular de la
langosta (Konno et al., 1997), sino también sobre el sistema nervioso central de los mamíferos,
interrumpiendo el anillo sincronizado en las redes de neuronas corticales de rata (Harsch et al.,
1998). Durante estos estudios, también encontramos un nuevo péptido desgranulador de
mastocitos designado como eumenine mastoparan-AF (EMP-AF) en el veneno de la avispa
solitaria. Anterhynchium ¯avomarginatum micado, la avispa eumenine más común encontrada
en Japón. La estructura y las actividades biológicas de este péptido son similares a las de los
mastoparanos, los péptidos desgranulantes de los mastocitos aislados de varios venenos de
avispas (Nakajima et al., 1986). Todos los mastocitos desgranulantes
 K. Konno y col. / Toxicón 38 (2000) 1505 ± 1515 1507

péptidos conocidos hasta ahora se han encontrado en venenos de himenópteros sociales, por
lo que EMP-AF es el primer caso en que este tipo de péptido se encuentra en el veneno de
avispa solitaria. Presentamos aquí el aislamiento, la estructura y las actividades biológicas de
este nuevo péptido desgranulador de mastocitos EMP-AF.

2. Materiales y métodos

2.1. Procedimiento de purificación

Ciento treinta y seis hembras de la avispa eumenine A. ¯avomarginatum

micado se recolectaron en Sagamiko, Ibaraki y Kyoto, Japón. Las avispas recolectadas se
congelaron inmediatamente con hielo seco y se almacenaron a ÿ 75 8 C.Los sacos de veneno se
diseccionaron del abdomen recién descongelado, se liofilizaron y se mantuvieron en ÿ 20 8 C
hasta su uso. Los sacos de veneno liofilizados se extrajeron (1,5 ml 5) con acetonitrilo 1: 1 ±
agua que contiene 0,1% de ácido tri¯uoroacético (CH 3 CN / H 2 O / TFA al 0,1%). Los
extractos se dividieron en dos porciones y cada una se cromatografió en un
columna de HPLC de fase inversa (CAPCELL PAK C 18, 10250 mm, SHISEIDO,
Tokio, Japón) con gradiente lineal de 5 a 95% CH 3 CN / H 2 O / TFA al 0,1% a una velocidad
de flujo de 2,5 ml / min durante 30 min mediante el control a UV 215 nm (Fig. 1). los

Fig. 1. Fraccionamiento del extracto de veneno de avispa eumenina A. ¯avomarginatum micado por reversa
HPLC de fase usando CAPCELL PAK C 18 ( 10250 mm) con gradiente lineal de 5 ± 95% CH 3 CN / H 2 O /
TFA al 0,1% durante 30 min a una velocidad de flujo de 2,5 ml / min. La absorción de UV se controló a 215 nm.
1508 K. Konno y col. / Toxicón 38 (2000) 1505 ± 1515

Se combinó el pico eluido a los 22,5 min, que era lo suficientemente puro como para analizar directamente la
estructura química.

2.2. Espectrometría de masas

Los espectros de masas se adquirieron en un espectrómetro de masas Voyager Elite MALDI-

time-of-®ght (MALDITOF) (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, EE. UU.) Equipado con una
fuente de extracción retardada y láser de nitrógeno pulsado de 337 nm. La secuencia de
aminoácidos del péptido se analizó mediante un espectrómetro de masas en tándem de
bombardeo de átomos rápidos (FAB-MS / MS) HX110A / 110A (JEOL, Akishima, Japón).

2.3. Secuenciación de aminoácidos

La secuencia de aminoácidos también se analizó mediante un secuenciador en fase gaseosa

PPSQ-10 (Shimadzu, Kyoto, Japón) basado en la degradación de Edman automatizada.

2.4. Síntesis en fase sólida

Los péptidos se sintetizaron mediante un sintetizador de péptidos en fase sólida

automatizado PSSM-8 (Shimadzu, Kyoto, Japón) basado en la estrategia Fmoc.

2.5. Preparación neuromuscular de langosta

Preparaciones neuromusculares de pata andante de langosta. Palinurus japonicus se

elaboraron como se describió anteriormente (Abe et al., 1983). Los axones excitadores e
inhibidores que inervan el músculo estirador se aislaron en el meropodito y se estimularon de
forma independiente. Los registros intracelulares se realizaron a partir del músculo de
estiramiento mediante microelectrodos ® llenos de acetato de 4 MK (10 ± 20 M O). Lo normal
la solución consistía en (en mM) 468 NaCl; 10 KCl; 20 CaCl 2; 8 mg de Cl 2 y tampón Tris 2,
ajustado a pH 7,4. Para analizar la actividad biológica, pruebe las soluciones
Se aplicaron a las soluciones de baño sustancias químicas que contenían concentraciones
adecuadas y se estudiaron los efectos sobre los potenciales de membrana y los
potenciales excitadores postsinápticos.

2.6. Preparación celular

Los mastocitos se obtuvieron mediante lavado peritoneal de ratas Sprague ± Dawley

grandes (> 300 g). Los mastocitos se aislaron de los tipos de células que contenían mediante
centrifugación a través de un cojín de Percoll como se describió anteriormente (Hide et al.,
1993), lavado dos veces por resuspensión y centrifugación, y finalmente suspendido en
un tampón de Hepes que comprendía NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl 1 mM 2,
CaCl 1,8 mM 2, HEPES 20 mM, 1 mg / ml de BSA y 1 mg / ml de glucosa (pH 7,4). Las células
RBL-2H3 se obtuvieron de MA Beaven (Institutos Nacionales de Salud,
Bethesda, MA) y cultivado en RPMI 1640 suplementado con 10% FCS y 100
 K. Konno y col. / Toxicón 38 (2000) 1505 ± 1515 1509

U / ml penicilina / 100 metro solución de estreptomicina g / ml. Las células se cultivaron en una placa
de 96 pocillos (5 104 células / 0,1 ml / pocillo) en medio de crecimiento en preparación para B- D-
glucosaminidasa.

2.7. Actividad de desgranulación ( B- D- ensayo de glucosaminidasa)

La desgranulación se determinó midiendo la liberación del marcador de gránulos,

B- D- glucosaminidasa, que co-localiza con histamina, como se describió previamente (Hide et al.,
1993). Las células se incubaron con varias concentraciones de péptidos durante 10 min a 37ºC. 8 C, y
luego las células se inactivaron mediante la adición de 0,5 ml de tampón HEPES enfriado con hielo.
Después de la centrifugación, se tomaron muestras de los sobrenadantes para B- D-
ensayo de glucosaminidasa. Brie¯y, 50 metro l muestras del medio y 50 metro l del
sustrato, p-nitrofenil- NORTE- acetilo- B- D- glucosaminida en citrato 0,2 M, pH 4,5, se
incubaron en placas de 96 pocillos para producir el cromóforo, pag- nitrofenol. La
absorbancia del producto coloreado se evaluó a 405 nm usando un lector de placas de
microtitulación. Valores para B- D- glucosaminidasa liberada en el medio se expresaron
como el porcentaje del total B- D- glucosaminidasa, que se determinó en las células
lisadas en Triton X-100 al 0,1%. pag- Nitrofenilo NORTE- acetilo- B- D- la glucosaminidasa
se adquirió de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO).

2.8. Actividad hemolítica

Treinta microlitros de fracciones de glóbulos rojos se lavaron tres veces con solución
salina fisiológica y se suspendieron en 50 ml de solución salina fisiológica. Doscientos
microlitros de la suspensión de eritrocitos preparada y 20 metro l de una solución salina
fisiológica, que contenía la muestra, se incubaron durante 30 min a 37ºC. 8 C en pocillos
de microplacas. La absorbancia de la muestra se detectó a 415 nm. La actividad
hemolítica se determinó con respecto a la actividad de Triton X-100 al 0,2% como 100% y
la actividad salina fisiológica como 0%.

3. Resultados

3.1. Aislamiento y estructura de EMP-AF

EMP-AF es un componente peptídico principal del extracto de veneno de UNA.

¯avomarginatum micado. El extracto de veneno se sometió a HPLC de fase inversa (Fig.
1), y cada fracción se probó en la sinapsis neuromuscular de langosta y también se
examinó su pureza mediante MALDI-TOF-MS. El pico eluyó a los 22,5 minutos bloqueó
significativamente la transmisión neuromuscular en la preparación de la pata de langosta
y mostró una alta pureza con MALDI-TOF-MS, el pico de iones moleculares (MH +,
monoisotópico) en m / z 1523. Por lo tanto, esto se combinó y se sometió directamente a
una caracterización química.
La secuencia del péptido se analizó mediante espectrometría de masas junto con la
degradación de Edman. Debido al alto contenido de aminoácidos hidrófobos, solo siete
1510 K. Konno y col. / Toxicón 38 (2000) 1505 ± 1515

La secuencia N-terminal se determinó mediante degradación de Edman automatizada como Ile

± Asn ± Leu ± Leu ± Lys ± Ile ± Ala ± Gly ± Lys. El análisis FAB-MS / MS dio al C-terminal
secuencia como Ala ± Gly ± Lys / Gln ± Ile ± Ile ± Lys / Gln ± Ser ± Leu ± NH 2, en el que la leucina
y la isoleucina se diferenciaron por los iones del producto debido a b, g- escisión (iones d)
(Johnson y col., 1987). Tomados estos resultados en conjunto, se dedujo que la secuencia de
aminoácidos de EMP-AF es Ile ± Asn ± Leu ± Leu ± Lys ± Ile ± Ala ± Gly ± Lys ± Ile ± Ile ±
Lys / Gln ± Ser ± Leu ± NH 2. Esto fue coincidente con el MH + en m / z 1523. Se corroboró
la secuencia que incluía el residuo de aminoácido en la posición 12 como Lys
por síntesis en fase sólida usando L- aminoácidos. Por lo tanto, toda la estructura de EMPAF se
determinó sin ambigüedades como Ile ± Asn ± Leu ± Leu ± Lys ± Ile ± Ala ± Gly ± Lys ±
Ile ± Ile ± Lys ± Se r ± Leu ± NH 2.
La estructura de EMP-AF, tetradecapéptido con extremo C amidado y rico
en aminoácidos hidrófobos y básicos, es similar al de los mastoparanos, péptidos
desgranulantes de mastocitos en venenos de avispas avispa. De hecho, en comparación
con mastoparán (MP), EMP-AF tiene la misma secuencia de tres aminoácidos N-terminal,
y siete de los 11 residuos de aminoácidos restantes son comunes, simplemente
distintivos en su secuencia y la ubicación de los residuos de lisina (Fig. .2). Se sabe que
esta clase de péptidos adopta a- conformación de hélice, mostrando propiedad anfifílica,
que es esencial para exhibir sus actividades biológicas. EMP-AF también puede adaptar
un anfifílico a- conformación de hélice así como MP (Fig. 3).
Tres análogos EMP-AF-1 0 3 también se sintetizaron junto con EMP-AF (Fig. 2). Estos péptidos
se aislaron ocasionalmente del extracto de veneno probablemente debido a la digestión
enzimática durante el almacenamiento de las avispas recolectadas y el procedimiento de
disección. Cuando no se trata adecuadamente, especialmente si se eleva la temperatura, la
enzima o enzimas contenidas en el propio veneno pueden escindir EMP-AF, lo que da como
resultado los péptidos N-terminal truncado y C-terminal hidrolizado EMP-AF-1 0
3. Estos péptidos serían útiles para la investigación de los requisitos estructurales de la
actividad EMP-AF.

3.2. Actividades biológicas de EMP-AF y sus análogos sintéticos

Las actividades biológicas de EMP-AF y sus análogos se investigaron utilizando péptidos

sintéticos. En primer lugar, se probaron los efectos sobre la sinapsis neuromuscular de la
langosta. De los cuatro péptidos, solo EMP-AF bloqueó la transmisión neuromuscular de la
langosta. EMP-AF (0,1 ± 1 mM) indujo la despolarización de la membrana muscular,
provocando en ocasiones una contracción lenta del músculo. El excitador

Fig. 2. Secuencias de aminoácidos de la eumenina mastoparán-AF (EMP-AF), sus análogos EMP-AF-1 0 3) y

mastoparán (MP).
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los potenciales posinápticos no se potenciaron al inicio de la acción de EMP-AF y

desaparecieron durante la despolarización de la membrana muscular. Por tanto, EMP-AF
puede actuar principalmente sobre la membrana postsináptica.
A continuación, se examinó la actividad de desgranulación de mastocitos peritoneales
de rata, una actividad biológica característica de los mastoparanos (MP), en comparación
con la de MP. Todos los péptidos mostraron actividad, pero la potencia dependía de la
estructura. EMP-AF y EMP-AF-2, los péptidos amidados del extremo C, eran tan potentes
como MP, mientras que EMP-AF-1 y EMP-AF-3, los péptidos carboxílicos del extremo C
eran menos potentes que MP [Fig. 4 (A)]. Estos resultados sugirieron que la estructura de
amida Cterminus es esencial, pero no así los tres residuos N-terminales para exhibir una
alta actividad, en otras palabras, si el C-terminal está amidado, los tres residuos N-
terminales no son necesarios. Esta relación estructura ± actividad es diferente a la de MP,
en el que el análogo truncado tres residuos del extremo N-terminal tenía sólo una débil
actividad de liberación de histamina mientras que el análogo truncado de dos residuos
mostró una alta actividad (Nakajima et al., 1986). Por otro lado, en las células RBL-2H3,
solo EMP-AF fue tan activo como MP y los demás mostraron actividad muy débil o nula
[Fig. 4 (B)]. Esto indicó que existe una diferencia en el mecanismo de interacción de los
MP con mastocitos peritoneales de rata y células RBL-2H3 (Mizuno et al., 1998).

También se examinó la actividad hemolítica, ya que es otra actividad biológica característica

que los mastoparanos tienen en común. En eritrocitos humanos, EMP-AF indujo hemólisis,
pero la potencia fue sólo aproximadamente un tercio de la MP, mientras que EMP-AF-1 no tuvo
ningún efecto. Los análogos de secuencia más corta EMP-AF-2 y -3 revelaron solo una actividad
débil, si la hubo, y mostraron las mismas tendencias (Fig. 5). Por consiguiente, tanto la
estructura amida del extremo C como la secuencia completa son esenciales para la actividad
hemolítica.

Fig. 3. Proyecciones del anfifílico a- estructuras helicoidales de EMP-AF y MP. En esta vista, los residuos hidrófilos de
Lys (*) se encuentran en un lado y los residuos hidrófobos Ala, Ile y Leu en el otro lado de la hélice.
1512 K. Konno y col. / Toxicón 38 (2000) 1505 ± 1515

4. Discusión

Hemos aislado un nuevo péptido degranulador de mastocitos, eumenine mastoparanAF

(EMP-AF), a partir del extracto de veneno de la avispa eumenine solitaria A. ¯avomarginatum
micado. Este péptido tiene características comunes con los mastoparanos (MP) tanto en
estructura como en actividades biológicas. Es un tetradecapéptido con

Fig. 4. (A) Actividad de desgranulación en mastocitos peritoneales de rata, (B) Actividad de desgranulación en células
RBL 2H3: ( w) EMP-AF; (*) EMP-AF-1; ( q) EMP-AF-2; ( Q) EMP-AF-3; ( r) mastoparán. La actividad se determinó midiendo
la liberación del marcador de gránulos, B- D- glucosaminidasa que co-localiza con histamina, y los valores de B- D-
glucosaminidasa liberada en el medio se expresaron como el porcentaje del total B- D- glucosaminidasa, que se
determinó en las células lisadas en Triton X-100 al 0,1%.
 K. Konno y col. / Toxicón 38 (2000) 1505 ± 1515 1513

C-terminal amidado y rico en aminoácidos hidrófobos y básicos, y muestra

desgranulación y actividad hemolítica. Los péptidos desgranulantes de mastocitos que
incluyen MP están ampliamente distribuidos en venenos de himenópteros: melitina y
péptido MCD en abejas (Habermann, 1972); bombolitinas en abejorros (Argiolas y Pisano,
1985); MP en avispones y avispas de papel (Argiolas y Pisano, 1983, 1984; Dohtsu et al.,
1993; Ho y Hwang, 1991; Nakajima et al., 1986; Toki et al., 1988). Sin embargo, todos
estos se encuentran en el veneno social de avispa y abeja, por lo que EMPAF es el primer
ejemplo que se encuentra en el veneno de avispa solitaria. La presencia de péptidos
desgranulantes de mastocitos puede ser común para los venenos de avispa eumenina, ya
que también hemos aislado otro péptido desgranulador de mastocitos de otro veneno de
avispa eumenina (Konno et al., 1999).
EMP-AF puede adaptar un anfifílico a- conformación de hélice, que muestra propiedad
anfifílica, que es esencial para que esta clase de péptidos exhiba sus actividades
biológicas (Fig. 3). Sin embargo, la ubicación de los residuos de Lys en EMP-AF es única
entre los MP, en las posiciones 5, 8 y 12 en lugar de en las posiciones 4, 11 y 12. Las
cargas positivas debidas a los residuos de Lys en la estructura anfifílica son cruciales para
las propiedades biológicas de los MP. Por ejemplo, el reemplazo de tres residuos Lys de
MP con residuos Asp o Ser abolió completamente el efecto estimulante de la actividad
guanilato ciclasa (Song et al., 1993). Además, el residuo de Lys adicional en la posición 2
es crítico para los efectos cardiovasculares del mastoparán B (MP-B) (Ho et al., 1994). Por
lo tanto,

Fig. 5. Actividad hemolítica en eritrocitos humanos: ( w) EMP-AF; (*) EMP-AF-1; ( q) EMP-AF-2; ( Q)

EMP-AF-3; ( r) mastoparán. La actividad (%) se determinó considerando que la actividad de Triton X-100 al 0,2% era
del 100% y la actividad de la solución salina fisiológica era del 0%.
1514 K. Konno y col. / Toxicón 38 (2000) 1505 ± 1515

preparación de la pierna. Se necesitan más estudios para dilucidar completamente las propiedades
biológicas de EMP-AF.

Agradecimientos

Agradecemos a los Dres. Soichi Yamane (Universidad de Ibaraki) y Akira Endo

(Universidad de Ritsumeikan) por la recolección e identificación de especímenes de
avispas. También agradecemos al Dr. Terumi Nakajima (Instituto Suntory de
Investigación Bioorgánica) por su aliento a lo largo de este trabajo y su invaluable
discusión. Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Suntory para la Beca de
Investigación Bioorgánica (Beca SUNBOR) a KK.

Referencias

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