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Chromobacterium Csp_P Reduce la malaria y la infección

por dengue en mosquitos vectores y tiene
Entomopatógeno y In vitro Actividades anti-patógenas
José Luis Ramírez.¤a, Sarah M. Short., Ana C. Bahia¤b, Raul G. Saraiva, Yuemei Dong, Seokyoung Kang, Abhai Tripathi, Godfree
Mlambo, George Dimopoulos *
W. Harry Feinstone Departamento de Microbiología e Inmunología Molecular, Facultad de Salud Pública Bloomberg, Universidad Johns Hopkins, Baltimore, Maryland, Estados Unidos de
América

Abstracto
Plasmodium y el virus del dengue, los agentes causantes de las dos enfermedades transmitidas por vectores más devastadoras, la malaria y el dengue,
son transmitidos por los dos mosquitos vectores más importantes, Anopheles gambiae y Aedes aegypti, respectivamente. Se ha demostrado que las
asociaciones entre insectos y bacterias influyen en la competencia del vector para los patógenos humanos a través de acciones multifacéticas que
incluyen la activación del sistema inmunológico de los insectos, el secuestro de patógenos por parte de microbios y factores antipatógenos producidos
por bacterias. Estas influencias hacen que la microbiota de los mosquitos sea muy interesante desde la perspectiva del control de enfermedades. A
continuación presentamos una bacteria del géneroCromobacteria (Csp_P), que estaba aislado del intestino medio de Aedes aegypti. Csp_Ppuede
colonizar eficazmente el intestino medio del mosquito cuando se introduce a través de una harina de néctar artificial, y también inhibe el crecimiento de
otros miembros de la microbiota del intestino medio. Csp_P La colonización del tejido del intestino medio activa la respuesta inmunitaria de los
mosquitos y Csp_P la exposición reduce drásticamente la supervivencia de las etapas larvaria y adulta. Ingestión deCsp_P por el mosquito reduce
significativamente su susceptibilidad a Plasmodium falciparum e infección por el virus del dengue, lo que compromete la competencia del mosquito
como vector. Esta bacteria también ejercein vitro anti-
Plasmodium y actividades contra el dengue, que parecen estar mediadas por Csp_P -produjo factores bioactivos estables con potencial
terapéutico y de bloqueo de la transmisión. Las propiedades anti-patógenas y entomopatógenas deCsp_P convertirlo en un candidato
potencial para el desarrollo de estrategias de control de la malaria y el dengue.

Citación: Ramirez JL, Short SM, Bahia AC, Saraiva RG, Dong Y, et al. (2014)Chromobacterium Csp_P Reduce la infección por malaria y dengue en mosquitos vectores y tiene efectos
entomopatógenos y In vitro Actividades anti-patógenas. PLoS Pathog 10 (10): e1004398. doi: 10.1371 / journal.ppat.1004398

Editor: Elena Levashina, Instituto Max Planck de Biología de Infecciones, Alemania

Recibió 20 de febrero de 2014; Aceptado 14 de agosto de 2014; Publicado 23 de octubre de 2014

Derechos de autor: 2014 Ramirez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia de atribución Creative Commons, que permite
uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Fondos: Este trabajo ha sido financiado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas 1R01AI061576-01A1, RO1 AI059492 y
RO1AI078997; el Instituto de Investigación del Paludismo Johns Hopkins y la Fundación de la Familia Bloomberg. JLR fue apoyado por una beca de formación individual F31 NRSA de NIH / NIAID
(1F31AI080161-01A1) y por la Sociedad Estadounidense de Microbiología Robert D. Watkins Graduate Research Fellowship. Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la
recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.

* Correo electrónico: gdimopou@jhsph.edu

. Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

¤a Dirección actual: Laboratorio de Investigación de Vectores y Malaria, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Rockville, Maryland,
Estados Unidos de América
¤b Dirección actual: Instituto de Bioqu´ı́mica Médica, Programa de Biologia Molecular e Biotecnologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil

Introducción en otros [9]. Activación de la vía IMD, el principal anti-P. falciparum Se ha

La influencia de la microbiota intestinal en la competencia de vectores de
enfermedades como los mosquitos ha ganado un interés creciente durante la
última década [1-3]. Trabajos anteriores han demostrado que la coinfección de
Anofeles mosquitos con Plasmodium y con
Serratia sp. o Enterobacter sp. bacterias conduce a una reducción
Plasmodium infección [3,4]. Además, la presencia de ciertas especies bacterianas en
Aedes el intestino medio del mosquito conduce a una menor intensidad de la
infección por el virus del dengue [5]. Los estudios también han demostrado que
Anofeles y Aedes los mosquitos a los que se les ha reducido experimentalmente la
microbiota intestinal mediante el tratamiento con antibióticos muestran una mayor
Plasmodium y los niveles de infección por el virus del dengue, respectivamente, que
sus homólogos no tratados [6-8]. La actividad anti-patógena de las bacterias del
intestino medio de los mosquitos se ha atribuido a la activación del sistema
inmunológico de los mosquitos en algunos casos y a la actividad anti-patógena
directa de las moléculas producidas por bacterias.
demostrado que la vía inmune está mediada por una interacción entre
el receptor de reconocimiento de patrones PGRP-LC y la microbiota del
intestino medio [10]. A su vez, los factores anti-patógenos derivados de
microbios se han caracterizado en algunos sistemas de interacción
microbio-huésped e incluyen metaloproteasas citotóxicas, hemolisinas,
antibióticos, hemaglutininas, proteasas, pigmentos prodigiosina y
quelantes de hierro (sideróforos) [9].
En la naturaleza, las bacterias comúnmente crecen adheridas a superficies en matrices
complejas de células, proteínas, polisacáridos y ADN (crecimiento de biopelículas), en lugar
de como células individuales que nadan libremente (crecimiento planctónico) [11,12]. La
formación de biopelículas permite que las bacterias sobrevivan a la exposición a factores
antimicrobianos derivados del huésped y otros factores ambientales estresantes [11, 12].
Además, las células bacterianas en una biopelícula tienen una expresión génica y perfiles
metabólicos bastante diferentes a los de las células en un estado planctónico de nado libre
[11]. Estudios de
Pseudomonas aeruginosa colonización de la Drosophila melano-

PLOS Patógenos | www.plospathogens.org 1 Octubre de 2014 | Volumen 10 | Número 10 | e1004398


Resumen del autor
Los agentes infecciosos que causan la malaria y el dengue se
transmiten por Anofeles y Aedes mosquitos, respectivamente. Las
bacterias que se encuentran en el intestino medio del mosquito
tienen el potencial de afectar dramáticamente la susceptibilidad
del mosquito vector al parásito de la malaria y al virus del dengue.
En este trabajo, investigamos uno de esos microbios,
Chromobacterium sp. (Csp_P),una bacteria aislada de un campo
capturado Aedes aegypti mosquito. Te lo mostramosCsp_P puede
colonizar eficazmente el intestino medio de Anopheles gambiae y
Aedes aegypti mosquitos y puede, cuando es ingerido por el mosquito,
reducir significativamente la susceptibilidad del mosquito a la infección
con el parásito de la malaria y el virus del dengue. También mostramos
que la exposición y la ingestión deCsp_P
puede reducir la vida útil de larvas y mosquitos adultos,
respectivamente. Te lo mostramosCsp_P tiene antiPlasmodium y
actividad anti-dengue independiente del mosquito, lo que sugiere
que la bacteria secreta metabolitos que podrían potencialmente
explotarse para prevenir la transmisión de enfermedades o para
tratar infecciones.
gaster intestino han demostrado que la formación de biopelículas puede afectar
drásticamente la diseminación en la hemolinfa y la mortalidad de las moscas [13].
En este estudio, mostramos que un Chromobacterium sp. aislar,
Csp_P, previamente aislado del intestino medio de recolectados en el
campo Ae. aegyptimosquitos [5], ejerce in vitro anti-Plasmodium y
actividad antidengue cuando se cultiva en condiciones de biopelícula.
Csp_P puede colonizar eficazmente los intestinos de los dos mosquitos
vectores más importantes de enfermedades, Un. Gambiaey Ae. aegypti,
donde bloquea Plasmodium e infección por dengue. También ejerce
actividad entomopatógena contra las etapas larvaria y adulta y, por lo
tanto, podría usarse para el desarrollo de un agente de control biológico.
Csp_PLas actividades anti-patógenas parecen estar mediadas por metabolitos
secundarios estables, lo que sugiere que Csp_P es una fuente de candidatos
potencialmente interesantes para el desarrollo de fármacos terapéuticos y
bloqueadores de la transmisión.
Resultados / Discusión
En un estudio anterior, aislamos una bacteria gramnegativa
Chromobacterium sp. (Csp_P)desde el intestino medio de los recolectados en el campo
Ae. aegyptimosquitos en Panamá [5]. El generoChromobacterium spp.
representa bacterias asociadas al suelo y al agua de las regiones
tropicales y subtropicales [14], y se sabe que los miembros de este
género producen una variedad de compuestos bioactivos [14,15] y
forman biopelículas. El miembro más estudiado,Chromobacterium
violaceum, Se ha descubierto que produce violaceína, un compuesto de
pigmento violeta con potente actividad antimicrobiana, antiparasitaria y
tumoricida [14, 16]. Csp_P se puede cultivar en caldo Luria Bertani (LB) y
en agar LB, sobre el que forma colonias planas de color tostado que se
oscurecen con el tiempo y se vuelven opacas cuando se exponen a la
luz. Csp_P no produce violaceína, pero la caracterización molecular de la
secuencia del gen ARNr 16s y el análisis filogenético mostraron una
similitud del 98% con Cromobacteria
haemolyticum y Chromobacterium aquaticum, probablemente son dos
Parientes cercanos.
Csp_P colonización del intestino medio del mosquito
Para evaluar la capacidad de Csp_P para colonizar el intestino medio del mosquito,
expusimos a los mosquitos tratados con antibióticos a una fuente de azúcar que contenía10
6 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml para Ae. aegyptio 108 UFC / ml para Un.
Gambiaedurante 24 hy luego se diseccionaron, homogeneizaron y se sembraron los
intestinos medios en placas de agar LB a los 3 días
PLOS Patógenos | www.plospathogens.org
Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.
después de la exposición. El tratamiento con antibióticos a través de la
harina de azúcar se realizó para eliminar la flora microbiana nativa que
puede fluctuar en términos de carga y composición de especies entre
mosquitos individuales de la misma jaula y generación, lo que complica
la interpretación de nuestros datos [7]. La presencia de la microbiota
nativa también dificultaría la discriminación deCsp_P colonias de otras
especies mediante inspección visual. Csp_P mostró una capacidad
excepcional para colonizar rápidamente el intestino medio de los
mosquitos, mostrando una prevalencia del 80% en Un. Gambiaey 97%
en Ae. aegyptipoblaciones de jaulas 3 días después de la exposición (Fig.
1A). Las cargas bacterianas promedio en este momento fueron de
aproximadamente 105 y 104 UFC por intestino medio en Ae. aegypti
(Fig. 1B) y Un. gambiaeFig. 1C) hembras, respectivamente.
También probamos la capacidad de Csp_P para colonizar el intestino medio de
mosquitos no tratados con antibióticos. Porque casi todos los sépticos (es decir
no tratado con antibióticos) Un. Gambiaelos mosquitos habían muerto dos días
después Csp_P introducción a través de la alimentación con azúcar a las 108 UFC / ml
(Fig. 2C), solo pudimos analizar la prevalencia y la carga bacteriana de Csp_P en los
días uno y dos después de la alimentación. Un día despuésCsp_P
ingestión, encontramos que Csp_P estuvo presente en todos los mosquitos
muestreados con una carga bacteriana promedio de 5.126104 (Figura 1D, E). A
los dos dias despuesCsp_P exposición, sólo el 5% de Csp_P-
alimentado Un. Gambiaetodavía estaban vivos (Fig. 2C) y Csp_P se detectó en
sólo uno (12,5%) de estos mosquitos restantes (Fig. 1D, E). En sépticoAe.
aegyptimosquitos que se habían alimentado de un 1010 UFC / ml
Csp_P-que contiene solución de azúcar, identificamos Csp_P en el 79% de los
mosquitos muestreados el día 1 después de la alimentación (Fig. 1F). A los tres días
después de alimentarse delCsp_P-que contiene solución de azúcar,
aproximadamente el 30% de la Ae. aegyptitodavía estaban vivos (Fig. 2D) y Csp_P
se detectó en el 15% de estos mosquitos (Fig. 1F). Estos datos
sugieren queCsp_P colonizó la gran mayoría de Un. Gambiaey
Ae. aegyptimosquitos el día 1 después de la exposición y que Csp_P
provocó una rápida mortalidad en la mayoría de los individuos. El pequeño
porcentaje que sobrevivió hasta el día 2 o 3, después de la exposición, pudo
haber recibido una pequeña dosis de bacterias y haber logrado eliminarlas
cuando fueron disecadas. Es difícil comparar la eficiencia de colonización
entre mosquitos sépticos y tratados con antibióticos porque las curvas de
supervivencia difieren dramáticamente (Fig. 2). Si bien parece que
Csp_P fue mejor en la colonización del intestino medio de los tratados con
antibióticos Un. gambiaeFig. 1A frente a 1D) y Ae. aegyptiFig. 1A vs. 1F),
nuestra medición no tiene en cuenta que los individuos murieron mucho más
rápidamente en la población séptica. Esta rápida mortalidad probablemente
seleccionada para la mayoríaCsp_P individuos negativos el día 2 y 3 después
de la alimentación.
Csp_P ejerce actividad entomopatógena tras la ingestión de
mosquitos y exposición a larvas
Examinamos la influencia de Csp_P colonización del intestino medio en la
longevidad de los mosquitos al exponer los tratados con antibióticos Un. Gambiaey
Ae. aegyptimosquitos a una fuente de azúcar durante 24 h que contenga
Csp_P a una concentración final de 108 y 106 UFC / ml, respectivamente, y
luego monitoreando la supervivencia. Este tratamiento condujo a una
disminución de la longevidad de ambas especies en comparación con los
mosquitos de control no expuestos (Fig. 2A, B). Repetimos este experimento
con séptico (es decir no tratado con antibióticos) Un. Gambiae
y Ae. aegypti.Descubrimos que alimentarse de una fuente de azúcar que
contiene Csp_P a una concentración de 108 CFU / ml resultó en una rápida
mortalidad de Un. Gambiaehembras adultas (Fig. 2C). Mortalidad de la séptica
Ae. aegyptilas hembras no aumentaron después de alimentarse con una
fuente de azúcar que contenía Csp_P a una concentración de 106 UFC / ml,
pero aumentó drásticamente cuando la harina de azúcar contenía
Csp_P a una concentración de 1010 UFC / ml (Fig. 2D). Estos datos sugieren que
Csp_P tiene una fuerte actividad entomopatógena independientemente de si
hay otros microbios presentes en el intestino del mosquito. Nosotros
2 Octubre de 2014 | Volumen 10 | Número 10 | e1004398
 Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.

Figura 1. Csp_P colonización del intestino medio del mosquito. Todos los mosquitos estuvieron expuestos a Csp_P a través de harina de azúcar. PresentarCsp_P a través de harina de azúcar, se
permitió que los adultos se alimentaran durante 24 h con 1,5% de sacarosa que contenía Csp_P cultivo líquido a una concentración final de, 108 UFC / ml para Un. Gambiae
y, 106 (A, B) o 1010 (F) UFC / ml para Ae. aegypti.Para los mosquitos tratados con antibióticos, la prevalencia de Csp_P fue medido en Ae. aegyptiy Un. Gambiaeintestino medio 3
días después de la exposición (A). El número de unidades formadoras de colonias (UFC) deCsp_P también se midió en el intestino medio de (B) Ae. aegyptiy C) Un. Gambiae3
días después de la exposición a Csp_P. Experimentos para tratados con antibióticos Ae. aegyptiy Un. Gambiaefueron replicados al menos
tres veces. Tamaños de muestra finales: nAe. aegypti / PBS =37; norteAe. aegypti / Csp_P =37; norteUn. gambiae / PBS =30; norteUn. gambiae / Csp_P =17. Para séptico (es decir no tratados
con antibióticos), la prevalencia y la carga bacteriana de Csp_P fue medido en Un. Gambiaeintestino medio 1 y 2 días después de la exposición (D, E).
Experimentos para sépticos Un. Gambiaese replicaron dos veces. Tamaños de muestra finales: nUn. gambiae / PBS =30; norteUn. gambiae / Csp_P / Día 1 =20; norteUn. gambiae / Csp_P / Día 2 =8.
Prevalencia de Csp_P fue medido en Ae. aegyptiintestino medio 1 y 3 días después de la exposición (F). Experimentos para sépticosAe. aegyptise replicaron dos veces.
Tamaños de muestra finales: nAe. aegypti / Csp_P / Día 1 =19; norteAe. aegypti / Csp_P / Día 3 =20. Las líneas horizontales indican valores medios. La siguiente transformación se aplicó a todos
los datos de CFU sin procesar: y = log10 (x + 1), donde x = recuento de UFC original e y = valores de datos graficados.
doi: 10.1371 / journal.ppat.1004398.g001

observó una menor supervivencia en sépticos Un. Gambiaey Ae. aegytpi
después de alimentarse con una comida de sangre que contiene Csp_P a una
concentración final de 108 UFC / ml (Fig. 2E, F). El efecto entomopatógeno más
fuerte sobreCsp_P La introducción a través de la ingestión de sangre se debió
probablemente a que los mosquitos recibieron una gran dosis bacteriana
única al alimentarse con sangre en lugar de las múltiples dosis bajas que se
esperarían durante la alimentación con azúcar. También es posible queCsp_P
Proliferaron en gran número en la sangre nutritiva.
Para estudiar la influencia de Csp_P sobre la viabilidad larvaria, colocamos larvas
de mosquitos de 2 a 4 días de edad en grupos de 10 en piscinas que contenían
5 ml de agua destilada suplementada con 50 metrol de una DO de 1.0600
cultivo líquido de Csp_P, y luego monitoreó la supervivencia. Esto resultó en
mortalidad casi completa de Un. Gambiaey Ae. aegyptilarvas durante un
período de 3 y 2 días, respectivamente, en comparación con el
controlar las larvas que estuvieron expuestas a la microbiota del agua
de reproducción normal (Fig. 2G, H). Estos estudios sugieren queCsp_P -
la mortalidad mediada puede ser el resultado directo de un factor
mosquitocida o de una infección sistémica por diseminación a la
hemolinfa; alternativamente, su colonización del intestino medio (u
otros tejidos) podría causar mortalidad indirectamente al interferir con
las funciones vitales del mosquito. Estudios dePseudomonas aeruginosa
colonización de la Drosophila melanogaster intestino han demostrado que la
formación de biopelículas puede afectar drásticamente tanto la diseminación dentro
de la hemolinfa como la mortalidad de las moscas [13]. Csp_P es capaz de formar
biopelículas in vitro, aunque aún no se ha probado si la formación de biopelículas se
produce dentro del intestino medio del mosquito. C. violaceum
produce cianuro a alta densidad celular [17, 18] a través del operón hcnABC que
produce cianuro, un comportamiento que, según se informa, está regulado

PLOS Patógenos | www.plospathogens.org 3 Octubre de 2014 | Volumen 10 | Número 10 | e1004398

 Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.

Figura 2. Csp_P la exposición causa una alta mortalidad en adultos y larvas. Csp_P se introdujo experimentalmente en el intestino medio adulto a través de una harina de azúcar
(A – D) o de sangre (E, F), y se observó la mortalidad durante 5-8 días. PresentarCsp_P a través de harina de azúcar, se permitió que los adultos se alimentaran durante 24 h con
1,5% de sacarosa que contenía Csp_P cultivo líquido a una concentración final de, 108 UFC / ml para Un. Gambiaey, 106 o 1010 UFC / ml para Ae. aegypti. Csp_Pla ingestión
disminuyó significativamente la supervivencia en personas asépticas alimentadas con azúcar (es decir pretratado con antibióticos) Un. gambiaeA, p, 0,0001) y Ae.
aegyptiB, p, 0,0001). Cada experimento se repitió tres veces. Tamaños totales de muestra: (A)PBS =149; (A)Csp_P =146; (B)PBS =70; (B)Csp_P = 70. Ingestión de
Csp_P disminución significativa de la supervivencia en sépticos alimentados con azúcar (es decir no tratado con antibióticos) Un. gambiaeC, p, 0,0001). En sépticoAe. aegypti,supervivencia
disminuyó significativamente después de alimentarse con 1010 UFC / ml harina de azúcar (D, p, 0,0001) pero no después de alimentarse con 106 UFC / ml harina de azúcar (D, p = 0,08).
Los experimentos en C y D se repitieron dos veces. Tamaños totales de muestra: (C)PBS = 95; (C)Csp_P = 124; (D)PBS =185; (D)Csp10 6 = 223; (D)Csp10 10 = 226. Para presentar
' '

Csp_P a través de harina de sangre, Csp_P cultivo líquido (, 108 UFC / ml) se mezcló 1: 1 con sangre / suero humano y se alimentó a Un. gambiaeE) y
Ae. aegyptiF) adultos. Los experimentos se replicaron tres veces con tamaños de muestra totales: (E)PBS =59; (MI)Csp_P = 51; (F)PBS =37; (F)Csp_P = 62. Los efectos de
Csp_P sobre la mortalidad de las larvas también se probaron colocando de 2 a 4 días de edad Un. gambiaeG) y Ae. aegyptiH) larvas en agua que contiene Csp_P en un comienzo
concentración de 106 UFC / ml y seguimiento de la supervivencia a los 5 días. Los experimentos se repitieron de 2 a 3 veces con tamaños de muestra finales: (G)PBS = 80;
(GRAMO)Csp_P =60; (H)PBS =100; (H)Csp_P = 60. Los valores de P informados anteriormente se obtuvieron realizando pruebas de rango logarítmico por pares entre PBS y Csp_P
tratos. Las curvas de supervivencia se ajustaron mediante el método de Kaplan-Meier. Las marcas verticales indican muestras censuradas; en C y D varios individuos
fueron disecados cada día para medir Csp_P prevalencia y carga bacteriana para la Figura 1. doi:
10.1371 / journal.ppat.1004398.g002

PLOS Patógenos | www.plospathogens.org 4 Octubre de 2014 | Volumen 10 | Número 10 | e1004398

 Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.

Figura 3. Csp_P reduce la susceptibilidad de los mosquitos a la malaria y la infección por dengue. En (A) y (C), a los adultos tratados con antibióticos se les permitió alimentarse
durante 24 h con sacarosa al 1,5% que contenía Csp_P cultivo líquido a una concentración final de, 108 UFC / ml para Un. gambiaeA) y, 106 UFC / ml para Ae. aegyptiC). Después
de la introducción deCsp_P a través de la harina de azúcar, Un. Gambiaea los mosquitos se les dio una comida de sangre que contenía P. falciparum, y Ae. aegyptia los
mosquitos se les dio una comida de sangre que contenía el virus del dengue. En (B),Csp_P (106 UFC / ml) se introdujo al mismo tiempo que P. falciparum
a través de la ingestión de sangre a través de la alimentación de sangre de los tratados con antibióticos Un. gambiae.En todos los experimentos, se utilizó PBS comoCsp_P-control expuesto. A
los 7 días después de la infección, se disecaron los intestinos medios. Los ooquistes se contaron enP. falciparum-infectado Un. Gambiaehembras, y los títulos del virus del dengue se analizaron
en pacientes infectados por dengue Ae. aegyptihembras mediante la realización de ensayos de placa estándar. Los experimentos se iniciaron utilizando un número similar de mujeres adultas
en cada tratamiento (números iniciales A, B = 45–50 / trtmt, números iniciales C = 30–40 / tratamiento). Todos los experimentos se replicaron al menos tres
tiempos con tamaños de muestra finales: (A)PBS = 67, (A)Csp_P =14, (B)PBS = 43, (B)Csp_P =8, (C)PBS = 68, (C)Csp_P = 45. Se evaluaron las diferencias entre tratamientos
por la prueba de Mann-Whitney (*, p, 0.05; ***, p, 0.001).
doi: 10.1371 / journal.ppat.1004398.g003

por detección de quórum [18,19]. Se ha demostrado que la producción de necesario dilucidar el mecanismo por el cual Csp_P inhibe los
cianuro por las bacterias causa la mortalidad del huésped tanto en patógenos en vitro y en vivo.
nematodos [20] como en insectos [21].Chromobacterium subtsugae Se ha
demostrado previamente que ejerce toxicidad oral en varios insectos de Csp_P induce los genes del sistema inmunológico innato de los mosquitos
importancia agrícola, pero no en Culex mosquitos [22]. Anteriormente hemos demostrado que el Un. Gambiaey Ae. aegypti
La microbiota del intestino medio desencadena una actividad inmunitaria basal
Csp_P la colonización del intestino medio del mosquito compromete la elevando la expresión de varios factores inmunitarios, incluidos los péptidos
infección por patógenos antimicrobianos y los factores antipatógenos [5,7,8,23,24]. Para determinar
Para investigar si la presencia de Csp_P en el intestino medio del Csp_Ppotencia para inducir el sistema inmunológico innato del
mosquito podría influir en la infección de Un. Gambiaecon P. falciparum mosquito, expusimos las células SUA-5B del mosquito a varias
y de Ae. aegypticon el virus del dengue DENV2, analizamos la infección concentraciones de Csp_P y se ensayaron los cambios en la actividad de
de mosquitos que habían estado expuestos a un promotor de Cecropin1 que dirige la expresión de un gen indicador
Csp_P a través de la alimentación con azúcar 2 días antes de la alimentación con de luciferasa. Expusimos estas mismas células aPseudomonas putida,
sangre infectada con parásitos o virus. Aproximadamente una semana despuésUn. una bacteria Gram-negativa que pertenece a un género bacteriano
Gambiaese había alimentado de un P. falciparum cultivo de gametocitos, la infección
del parásito se ensayó contando los parásitos en etapa de oocistos en el lado basal
del intestino medio del mosquito. Infección por DENV2 del intestino medio deAe.
aegyptise ensayó mediante ensayos de placa estándar 7 días después de una harina
de sangre infecciosa. Todos los experimentos se iniciaron utilizando un número
similar de hembras adultas para cada tratamiento, pero debido a que
Csp_P exposición causa una alta mortalidad en adultos (Fig.2), muy pocas
Csp_P-los mosquitos alimentados aún estaban vivos cuando se realizaron los
ensayos de infección por parásitos y dengue. Sin embargo, encontramos que
los mosquitos supervivientes expuestos aCsp_P a través de la alimentación
con azúcar antes de la alimentación con sangre infecciosa mostró una
resistencia significativamente mayor a P. falciparum infección e infección por
DENV (Fig. 3). La inhibición deP. falciparum la infección fue aún mayor cuando
Csp_P se introdujo a través de la harina de sangre que contiene gametocitos a
las 106 UFC / ml (Fig. 3B), un efecto muy probablemente atribuible al mayor
número de bacterias ingeridas. Csp_P
puede inhibir la infección por patógenos directamente a través de la
interacción física con los patógenos o la producción de moléculas anti-
patógenas. Alternativamente,Csp_P puede inhibir indirectamente Plasmodium Figura 4. Csp_P provoca la expresión de genes inmunes en el mosquito. Inducción
o dengue (a) alterando la fisiología a largo plazo o la salud del mosquito del promotor Cec1 en la línea celular SUA-5B expuesta a P. putida y
de modo que se inhiba la infección por patógenos, (b) provocando una Chromobacterium sp. Csp_P.Las células SUA-5B que expresan un gen indicador de
luciferasa impulsado por un promotor Cec1 se expusieron a concentraciones
respuesta antipatógena del mosquito o (c) seleccionando individuos que
crecientes de Csp_P y P. putida bacterias. Las diferencias entre las muestras tratadas
sean más aptos para resistir Csp_P así como DENV y Plasmodium
con bacterias y las muestras de control con PBS se evaluaron mediante la prueba de
infección. Sin embargo,Csp_P's in vitro La actividad anti-patógena (discutida a comparación múltiple de Dunnett (**, p, 0.01; ***,
continuación) sugiere que tiene el potencial de inhibir directamente la p, 0,001).
supervivencia de patógenos en el intestino del mosquito. Otros estudios son doi: 10.1371 / journal.ppat.1004398.g004

PLOS Patógenos | www.plospathogens.org 5 Octubre de 2014 | Volumen 10 | Número 10 | e1004398

 Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.

Figura 5. Csp_P tiene antiPlasmodium y actividad anti-dengue in vitro. Csp_P se

cultivó en condiciones planctónicas y / o de biopelícula y se evaluó la actividad anti-
patógena independientemente del mosquito. Cinco preparaciones diferentes de
Csp_P se probaron: (a) cultivo líquido en estado planctónico, (b) sobrenadante de
biopelícula, (c) biopelícula fresca, (d) biopelícula desecada y (e) biopelícula inactivada
por calor. Un frescoComamonas sp También se probó la biopelícula como control. (A)
Csp_P El biofilm de 36 h tiene actividad antiparasitaria contra la etapa asexual P.
falciparum. Csp_Plos cultivos se filtraron usando un
0,2-metrom filtro y mezclado con etapa de anillo P. falciparum cultivos de parásitos.
Luego se agregó SYBR verde I a cada muestra, y la inhibición de la etapa asexualP.
falciparum por Csp_P se midió ensayando la fluorescencia en relación con el control
negativo (medio parásito, estandarizado al 0% de inhibición). Se utilizó cloroquina
como control positivo y se estandarizó al 100% de inhibición. Realizamos una prueba
de Tukey en los datos brutos para determinar si cada tratamiento bacteriano difería
significativamente del control PBS + LB (*** p, 0,001). (B)Csp_P tiene actividad
antiparasitaria contra la etapa de ookinete P. falciparum. Csp_PLas preparaciones
bacterianas se filtraron utilizando un 0,2-metrom filtrar y mezclar con sangre
extraída de ratones Swiss Webster hembra infectados con Renilla transgénico que
expresa luciferasa P. berghei. Etapa de Ookinete P. berghei Los recuentos de
parásitos se determinaron utilizando el Renilla sistema de ensayo de luciferasa y
porcentaje de inhibición por Csp_P se calculó en relación con el control negativo
(control PBS + LB, estandarizado al 0% de inhibición). Realizamos una prueba de
Tukey para determinar si cada tratamiento bacteriano difería significativamente del
control (* p, 0.05, ***, p, 0.001). (C)Csp_P La biopelícula de 42 h tiene actividad
antiparasitaria contra la etapa de gametocitos P. falciparum. Csp_PLos cultivos se
filtraron utilizando un 0,2-metrom filtro y mezclado con gametocitos en etapa P.
falciparum culturas. Se examinaron los eritrocitos en busca de gametocitos usando
frotis de sangre teñidos con Giemsa recolectados 3 días después

Csp_P exposición. La X roja indica que el sobrenadante provocó hemólisis y, por

tanto, no se podía utilizar. Determinamos la densidad de gametocitos por 1000
glóbulos rojos para cada muestra y realizamos una prueba de Tukey para
determinar si cada tratamiento bacteriano difería significativamente del control PBS
+ LB (* p, 0.05, *** p, 0.001). (D)Csp_P tiene actividad anti-dengue. CadaCsp_P
preparación bacteriana (75 metrol, sin filtrar) se mezcló con 75 metrol MEM que
contiene el serotipo 2 del virus del dengue y se incuba a temperatura ambiente
durante 45 min. Luego, las muestras se filtraron a través de un
0,2-metromy se utiliza para infectar células BHK21-15. El porcentaje de inhibición se
calculó como el porcentaje de disminución en PFU / ml con respecto al control
negativo (PBS + LB, estandarizado al 0% de inhibición). Analizamos la significancia de
las comparaciones por pares entre cada tratamiento y el control usando una prueba
de Tukey (***, p, 0.001). (MI)Csp_P tiene actividad anti-dengue cuando el virus está
suspendido en la sangre humana. Se analizaron biopelículas de múltiples bacterias
para determinar la actividad anti-dengue. Todas las bacterias analizadas fueron
aisladas de capturadas en el campo.Ae. aegyptimosquitos.
Ps.sp = Pseudomonas sp., Pr.sp = Proteus sp., Pn.sp = Paenobacillus sp., Co.sp =
Comamonas sp., Pa.sp = Pantoea sp., Ae.sp = Aeromonas sp. [5]. La biopelícula de
cada especie se cultivó durante 48 horas a temperatura ambiente y el virus del
dengue mezclado 1: 1 con sangre humana se añadió directamente a la biopelícula.
Después de una incubación de 45 min, se filtró la solución de virus + sangre /
bilofilm y se usó para infectar células C6 / 36. Biofilm sup = sobrenadante de biofilm,
HI biofilm = biofilm inactivado por calor, dess. biopelícula = biopelícula desecada
resuspendida en 16PBS. doi: 10.1371 / journal.ppat.1004398.g005

se encuentra comúnmente en el intestino medio de los mosquitos [25-27]. Este

experimento mostró que la expresión de Cec1 aumentaba al aumentarCsp_P
exposición, proporcionando evidencia de que Csp_P es un potente inductor
inmunológico (Fig. 4). También comparamos la abundancia de transcripciones de
genes inmunes de mosquitos en el intestino medio de mosquitos ingenuos tratados
con antibióticos con los de mosquitos a los que se les había proporcionado una
fuente de azúcar enriquecida conCsp_P (108 UFC / ml para Un. Gambiae
y 106 UFC / ml para Ae. aegypti)2 días antes. Elegimos analizar la expresión
génica 2 días después de la exposición porque este es el momento en el que
comienza a producirse un aumento de la mortalidad debido a la infección.
Presumimos que los niveles de infección y, por lo tanto, cualquier respuesta
inmune potencial serían altos en este momento. EnAe. aegypti,Encontramos
que la cecropina E y G y la defensina C mostraron al menos un aumento de 2
veces en la abundancia de transcripciones en el intestino medio de Ae. aegypti
colonizado con Csp_P bacterias en comparación con controles ingenuos (Fig.
S1A). EnUn. gambiae,encontramos tendencias no significativas hacia

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 Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.

aumento de la abundancia de transcripción de los genes Rel2, FBN9 y cecropina y

hacia una disminución de la abundancia de transcripción del gen de defensina en el
tejido del intestino medio (Fig. S1B). Estos datos representan un solo punto de
tiempo posterior a la infección, y aunque es posible que puntos de tiempo
adicionales puedan revelar patrones dinámicos deCsp_P-cambios inducidos en la
expresión génica, nuestros resultados generalmente concuerdan con los datos del
cultivo celular, y en su conjunto muestran que Csp_P tiene una capacidad
inmunoelicitadora en el intestino del mosquito.

Csp_P inhibe Plasmodium desarrollo y elimina la

infectividad del virus del dengue in vitro, independiente
del mosquito
Para probar si Csp_P podría ejercer un anti-Plasmodium o efecto anti-
dengue in vitro que es independiente del mosquito, realizamos
experimentos en los que se ensayó el desarrollo del parásito y la
infectividad del virus después de la exposición a diversas preparaciones
de cultivos planctónicos o de biopelículas de Csp_P. Estado planctónico
Csp_P se obtuvo cultivando Csp_P en líquido LB a 30tuC durante la noche en
un agitador de plataforma. La biopelícula se produjo mediante el cultivo
Csp_P en LB sin agitación en una placa de poliestireno de 24 pocillos a
temperatura ambiente durante 48 h, a menos que se indique lo contrario. El
antidengue y anti-Plasmodium actividad de las siguientes cinco preparaciones
diferentes de Csp_P luego se probó: (a) 1 ml (108 UFC / ml) cultivo líquido en
estado planctónico, (b) 1 ml (109 UFC / ml) sobrenadante de biopelícula que
consiste en LB líquido extraído del biofilm recién cultivado, (c) 5 mg (109 UFC /
ml) biofilm fresco resuspendido en 16
PBS, (d) 5 mg de biopelícula desecada preparada a partir de biopelícula
recolectada 1 a 2 días antes del ensayo y se dejó desecar completamente a
temperatura ambiente y luego rehidratada en 16PBS, (e) 5 mg de biopelícula
inactivada por calor preparada calentando biopelícula a 90ºC.tuC durante 24
h, recogido 1 día antes del ensayo.
Nuestro in vitro Los ensayos mostraron que Csp_P ejerce un potente anti
Plasmodium actividad contra las etapas de parásitos tanto asexuales como sexuales.
Nosotros expusimosP. falciparum Parásitos en etapa asexual 3D7 de las cinco
preparaciones bacterianas in vitro. Debido a que el crecimiento bacteriano puede
interferir con la determinación del número de parásitos, eliminamos las células
bacterianas filtrando todas las preparaciones a través de un 0,2-metrom filtro.
Descubrimos que todos los filtrados de preparaciones de biopelículas de 36 h
(frescos, sobrenadantes y desecados)Plasmodium
actividad, lo que da como resultado la inhibición de los parásitos en fase asexual a
un nivel comparable al del control positivo tratado con cloroquina (p, 0,001, Fig. 5A).
También detectamos actividad moderada en estadio anti-asexual en planctonCsp_P
preparaciones (p, 0,001), mientras que inactivado por calor
Csp_P biopelícula y biopelícula de otra especie bacteriana,
Comamonas sp., no tuvo ningún efecto inhibitorio. Expusimos unPlasmodium
in vitro cultivo de ookinete a las cinco preparaciones bacterianas filtradas para
evaluar la inhibición de la etapa sexual y encontró que la Csp_P La biopelícula
de 48 h (fresca, p, 0,001; y desecada, p, 0,05) y el sobrenadante de la
biopelícula (p, 0,001) bloquearon fuertemente el desarrollo de ookinete (Fig.
5B). Exposición de la cultura ookinete al planctónico filtradoCsp_P El cultivo Figura 6. Csp_P tiene actividad antibacteriana contra muchas especies que se
líquido resultó en una inhibición moderada pero no significativa del desarrollo encuentran comúnmente en el intestino medio de Aedes y Anofeles
de ookinete y exposición a inactivados por calor. Csp_P biopelícula o mosquitos. Csp_P se rayó en agar LB junto con múltiples especies bacterianas,
Comomonas sp. El filtrado de biopelícula no tuvo efecto sobre el desarrollo de y se observó en las placas la formación de zonas de inhibición alrededor
Csp_P. Ps.sp = Presudomonas sp., Pr.sp = Proteus sp.,
ookinete (Fig. 5B). También probamos el efecto deCsp_P preparaciones
C.sp_P = Chromobacterium sp_P, Cv = C. violaceum, Pn.sp = Paenobacillus sp.,
bacterianas en P. falciparum
Co.sp = Comamonas sp., Ac.sp = Acinetobacter sp., P.pu = Pseudomonas
viabilidad de los gametocitos. La exposición a un filtrado de biopelícula fresca de 42 putida, E.sp = Enterobacter sp., Pa.sp = Pantoea sp., S .sp = Serratia sp., Ch.sp
horas dio como resultado una inhibición del 100% (p, 0,001, Fig. 5C) y la exposición a = Chryseobacterium sp. [3,5,7]. doi: 10.1371 / journal.ppat.1004398.g006
una biopelícula desecada de 42 horas dio como resultado una inhibición de
aproximadamente el 60% (p, 0,05, Fig. 5C) deP. falciparum desarrollo de
gametocitos. No se pudo estimar la gametocitemia para el sobrenadante de
biopelícula de 42 h porque esta preparación provocó hemólisis de los glóbulos rojos Para probar el efecto inhibidor de Csp_P preparaciones sobre la infectividad del
(Fig. 5C). Sin embargo, el sobrenadante de biopelícula de 36 h (que no es hemolítico) virus del dengue in vitro, mezclamos el virus del dengue (106 PFU / ml) en MEM 1: 1
causó aproximadamente un 60% de inhibición de los gametocitos en comparación con cada una de las cinco preparaciones bacterianas de Csp_P durante 45 min. Las
con el control LB + PBS (p = 0,06, Fig. S2). muestras permanecieron sin filtrar durante la exposición inicial a

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dengue y se filtraron a través de un 0,2-metrom filtrar antes de proceder con los
ensayos de placa estándar para evitar la contaminación de las células huésped.
Encontramos que la exposición del virus del dengue a un planctónicoCsp_P cultivo
no afectó su infectividad en las células BHK21-15, mientras que la exposición a Csp_P
la biopelícula, la biopelícula desecada o el sobrenadante de la biopelícula abolieron
la infectividad del virus del dengue (p, 0,001, Fig. 5D). Para replicar mejor el efecto
queCsp_P biofilm podría tener sobre el virus del dengue en la sangre humana,
expusimos el virus del dengue en la sangre humana a Csp_P biopelícula fresca
durante 45 min. Luego filtramos la mezcla de sangre + virus / biopelícula y
evaluamos la infectividad del virus del dengue mediante un ensayo de placa
estándar. Encontramos eso frescoCsp_P
la biopelícula mostró una fuerte actividad anti-dengue cuando el virus se
suspendió en sangre humana (Fig. 5E). Csp_P El biofilm fresco fue único en su
actividad anti-dengue, ya que los biofilms de varios otros aislados bacterianos
de las entrañas de mosquitos capturados en el campo [5] no ejercieron
ninguna actividad antiviral contra el virus del dengue en sangre humana (Fig.
5E). La actividad anti-dengue deCsp_P aparentemente dependía de la
maduración de la biopelícula, ya que la biopelícula desarrollada durante 24 h
mostró solo una inhibición débil en comparación con la biopelícula de 48 h
(Fig. S3A). losCsp_P antiinflamatorio asociado a la biopelículaPlasmodium y la
actividad antiviral también era sensible al calor, ya que podía inactivarse
mediante una incubación de 24 horas a 90ºC.tuC (Fig. 5A-D).
Las biopelículas bacterianas están compuestas por una matriz de
sustancias poliméricas extracelulares que contienen polisacáridos, proteínas,
ADN y metabolitos secundarios [12]. Para investigar si la actividad antiviral
podría ser simplemente el resultado del secuestro de partículas de virus por la
biopelícula, mezclamos una suspensión del virus del dengue con biopelícula e
incubamos la mezcla durante un período de 45 min. A continuación, las
muestras se centrifugaron y el ARN viral en los sobrenadantes se cuantificó
mediante RT-qPCR y se comparó entre tratamientos experimentales (biofilm +
DENV) y de control (LB + DENV). Nuestros resultados indicaron que el virus del
dengue no fue secuestrado porCsp_P
biopelícula, ya que se detectaron copias de ARN viral similares en la muestra
expuesta a la biopelícula y en la muestra de control LB (Fig. S3B). Para
investigar si la pérdida de la infectividad del virus del dengue se debió a un
cambio en el pH del medio mediado por una biopelícula, medimos el pH de
un virus del dengue.Csp_P mezcla de biopelícula al final de un período de
incubación de 45 minutos. Las mediciones de pH mostraron un aumento en el
pH del medio de 7,6 a 8,3 (Fig. S4A). Se observó un cambio similar en el pH
cuando usamos las biopelículas de otras bacterias (Pantoea sp. Pasp_P y
Proteus sp. Prsp_P) que no afectan la infectividad del virus del dengue (Fig.
S4A). Para investigar más a fondo el efecto del pH sobre la infectividad del
virus del dengue, ajustamos el pH del medio MEM con NaOH y HCl a valores
de pH de 5,0, 7,7, 8,5 y 10,0 antes de una incubación de 45 min con el virus del
dengue. Solo se observó una disminución en la infectividad del virus después
de la exposición a un pH de 5.0, lo que sugiere que el aumento moderado en
el pH no medió laCsp_P Inhibición de la biopelícula de la infectividad del virus
(Fig. S4B). También mostramos queCsp_P la biopelícula no ejerce un efecto
citotóxico sobre células de insectos o mamíferos, según se evaluó mediante
tinción celular con azul tripán estándar (Invitrogen) (Fig. S5). Finalmente
probamos si elCsp_P La biopelícula podría influir en la susceptibilidad de las
células huésped a la infección por el virus del dengue al exponer las células
C6 / 36 a Csp_P biopelícula, luego se retira la biopelícula mediante lavados con
PBS antes de los ensayos de infección por el virus del dengue. Este
tratamiento no influyó en la capacidad del virus para infectar las células
huésped (Fig. S6), lo que sugiere que la actividad anti-DENV deCsp_P
La biopelícula no se debe a una menor susceptibilidad de la célula huésped al virus, sino que
probablemente sea un efecto antivírico directo.
Csp_P produce actividad (es) antibacteriana de amplio espectro
Proporcionar información de referencia sobre la producción potencial
de factores antibacterianos por Csp_P, Realizamos un ensayo básico de
inhibición del crecimiento investigando la capacidad de varios otros
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Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.
cepas bacterianas derivadas del intestino medio de mosquitos (Ae. aegypti-derivado
microbiota: Ps.sp = Pseudomonas sp., Pr.sp = Proteus sp., C.sp_P
=Chromobacterium sp_P, C.viol = C. violaceum, Pn.sp = Paenobacillus
sp .; Un. gambiae-microbiota derivada: Co.sp = Comamonas sp., Ac.sp =
Acinetobacter sp., P.pu = Pseudomonas putida, E.sp = Enterobacter sp.,
Pa.sp = Pantoea sp., Ps.sp = Pseudomonas sp., S.sp = Serratia sp., Ch.sp
= Chryseobacterium sp.) para
crecer en la proximidad de Csp_P en placas de agar LB (Fig. 6). Csp_P se
esparció sobre agar LB y se dejó crecer durante 48 horas. A continuación, los
aislados bacterianos derivados del intestino medio se rayaron verticalmente
hasta la línea Csp_P y se dejaron crecer en presencia deCsp_P. Este ensayo
mostró una zona de inhibición del crecimiento prominente alrededor del
Csp_P racha, con inhibición del crecimiento de todos los aislamientos
bacterianos que se derivaron de recolectados en el campo Ae. aegypti [5] y
Un. gambiae [3], incluido un pariente cercano conocido por su producción de
una variedad de factores bioactivos, C. violaceum (Figura 6A).
Conclusiones
Las asociaciones entre insectos y bacterias pueden influir en la competencia del
vector de múltiples formas; estos incluyen acortar la vida útil del insecto, bloquear la
infección con patógenos humanos mediante la producción de factores anti-
patógenos bioactivos y provocar el sistema inmunológico de los insectos. Hemos
identificado unChromobacterium sp. (Csp_P)
bacteria del intestino medio de campo Aedes aegypti que ejerce
una actividad anti-patógena de amplio espectro contra Plasmodium
y virus del dengue. Específicamente,Csp_P renders Un. Gambiaey
Ae. aegyptimás resistente a la infección por el parásito de la malaria
humana Plasmodium falciparum y virus del dengue, respectivamente.
Csp_P inhibe el crecimiento de una variedad de otras especies bacterianas
que se encuentran en el intestino medio del mosquito y es capaz de colonizar
rápidamente el intestino medio del mosquito. Csp_P parece ejercer actividad
entomopatógena, ya que la exposición de las larvas a Csp_P en el agua de cría
y la ingestión de Csp_P por mosquitos adultos resultan en una alta mortalidad
de mosquitos. Es posible queCsp_P podría utilizarse eficazmente como agente
bloqueador de la transmisión si se administrara a los mosquitos a través de
trampas de azúcar cebadas [28]. Csp_PLa capacidad de colonizar el intestino
del mosquito podría mejorarse aún más mediante procedimientos de
selección establecidos basados en pases consecutivos de la bacteria a través
del intestino del mosquito [29]. Csp_P podría usarse solo en trampas de
azúcar con cebo o en combinación con otros microbios que también se ha
demostrado que matan al mosquito o reducen la infección por patógenos, o
ambos, cuando están presentes en el intestino del mosquito [3,24]. La
actividad larvicida deCsp_P también lo hace interesante para su uso potencial
en la supresión de poblaciones de mosquitos. Las actividades anti-patógenas
deCsp_P parece estar mediada por metabolitos producidos por bacterias que
también inhiben la infección por parásitos y virus in vitro, haciéndolos
interesantes como posibles compuestos líderes para el bloqueo de la
transmisión y el desarrollo de fármacos terapéuticos. Los agentes
entomopatógenos, antibacterianos, antivirales y antiviralesPlasmodium
propiedades de Csp_P hacen de esta bacteria un candidato particularmente
interesante para el desarrollo de nuevas estrategias de control de las dos
enfermedades transmitidas por vectores más importantes y, por lo tanto,
merecen un estudio más profundo.
Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las
recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de
laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Los ratones solo se
utilizaron para la cría de mosquitos como fuente de sangre de acuerdo
con el protocolo aprobado. El protocolo fue aprobado por el Comité de
Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins (Número de
permiso: M006H300). Sangre humana anónima comercial,
8 Octubre de 2014 | Volumen 10 | Número 10 | e1004398

suministrado por Interstate Blood Bank Inc., se utilizó para Plasmodium y
ensayos de infección por el virus del dengue en mosquitos, por lo que el
consentimiento informado no fue aplicable. El Comité de Ética de la Escuela
de Salud Pública de Johns Hopkins ha aprobado este protocolo. Las
recolecciones de mosquitos se realizaron en residencias después del permiso
de los propietarios / residentes.
Crianza de mosquitos y tratamiento con antibióticos
Aedes aegypti los mosquitos eran de la cepa Rockefeller, y
Anopheles gambiae los mosquitos eran de la cepa Keele. Ambos se mantuvieron en
una solución de azúcar al 10% a 27ºC.tuC y 95% de humedad con un ciclo de luz /
oscuridad de 12 h. Se utilizaron algodón esterilizado, papel de filtro y mallas
esterilizadas para mantener las jaulas lo más esterilizadas posible. Para los
experimentos que utilizaron mosquitos asépticos, las hembras se mantuvieron en
una solución de sacarosa al 10% con 20 U de penicilina y 20 U de penicilina.metrog
de estreptomicina desde el primer día después de la eclosión hasta 1 o 2 días antes
de la exposición. La eficacia del tratamiento antimicrobiano se confirmó mediante
ensayos de unidades formadoras de colonias antes de la alimentación con sangre o
el desafío bacteriano.
Introducción de bacterias a través de la harina de azúcar.
En los casos en que los mosquitos fueron tratados con antibióticos, la
reintroducción de bacterias a través de una harina de azúcar se realizó primero
tratando a los mosquitos con antibióticos durante 2 a 3 días después de la
emergencia y luego proporcionándoles sacarosa al 10% (por Un. gambiae)o agua
esterilizada (para Ae. aegypti)durante 24 h después del tratamiento antibiótico.
Cuando los mosquitos no fueron tratados con antibióticos, se mantuvieron con
sacarosa al 10% durante 2-5 días después de la emergencia.Ae. aegyptise les dio
agua estéril durante las últimas 24 horas de este período. En todos los casos, los
mosquitos se mataron de hambre durante la noche y se alimentaron durante 24 h
con tiras de algodón humedecidas con una solución de sacarosa al 1,5% que
conteníaCsp_P a una concentración final de aproximadamente 108 UFC / ml para Un.
Gambiaey 106 UFC / ml para Ae. aegypti.En algunos experimentos (Figuras 1 y 2), Ae.
aegyptilos mosquitos también fueron alimentados Csp_P a una concentración final
de 1010 UFC / ml.
Ensayo de prevalencia y carga bacteriana de Csp_P
En mosquitos tratados con antibióticos, el intestino medio se disecó tres días
después de la ingestión de Csp_P, homogeneizado en 16PBS y sembrado en agar LB.
Luego se contaron las colonias para estimar las unidades formadoras de colonias
(UFC) por intestino medio, así como la prevalencia deCsp_P.
En mosquitos no tratados con antibióticos, se estimó la prevalencia
y / o la carga bacteriana de una de dos formas. ParaUn. gambiae,
los intestinos medios fueron disecados uno y dos días después Csp_P
ingestión, homogeneizado en 16 Se sembraron PBS y diluciones seriadas del
homogeneizado en agar LB suplementado con ampicilina (10,000 ug /
ml). Csp_P es muy resistente a la ampicilina y crece fácilmente incluso a esta
alta concentración. Verificamos queCsp_P fue la única bacteria que creció en
placas tratadas con antibióticos al confirmar primero que todas las colonias
que crecieron eran similares en color, tasa de crecimiento y morfología de la
colonia. Luego se secuenció el ADNr 16s de un subconjunto de colonias y se
verificó que coincidiera con la secuencia deCsp_P de caldo puro de congelador.
No fue posible utilizar este método para Ae. aegyptiporque su
intestino medio contenía comúnmente otras bacterias altamente
resistentes a la ampicilina. Estos contaminantes crecieron a cantidades
muy altas en las placas tratadas con ampicilina e interfirieron con la
detección deCsp_P. Por lo tanto, el ADN se extrajo utilizando el kit ZR Soil
Microbe DNA MicroPrep (Zymo Research) de muestras diseccionadas 1 y
3 días después de alimentarse con una harina de azúcar que contenía
PBS o Csp_P (1010 UFC / ml). El protocolo del fabricante se modificó de la
siguiente manera: en lugar de usar tampón de lisis para romper las
células, cada intestino medio se colocó en 500 metrol 16 PBS, 25 metrol
lisozima (10 mg / ml) y 7.5 metrol mutanolisina (10 KU / ml) fueron
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Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.
agregado y las muestras se incubaron a 37tuC durante 1,5 h. 15metrol
proteinasa K y 25 metroLuego se agregó SDS al 10%, las muestras se
incubaron a 55ºC.tuC durante 1 h, y luego se reanudó el protocolo estándar.
Se realizó una PCR diagnóstica para evaluar la presencia deCsp_P en cada
intestino medio individual. Los cebadores se diseñaron para amplificar un
fragmento de 415 pb delCsp_P gen de cianuro de hidrógeno sintasa B y se
verificó que los cebadores eran Csp_P-específico usando Primer BLAST de
NCBI (Primer directo: 59AGGGCGTAACCCTGGACTAT 39, Imprimación inversa: 5
9 CCGAAGGAACTGGCTTCGTA 39). La PCR se realizó con los cebadores
anteriores utilizando 10 ng de ADN como plantilla y la ADN polimerasa de alta
fidelidad Phusion de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las
siguientes excepciones: 0.5 metrol de cada imprimación (10 metrom) y 0,25
metroSe añadió 1 BSA a cada reacción. Las condiciones de ciclismo fueron las
siguientes: 95tuC durante 30 segundos, [95tuC durante 30 s, 65tuC durante
30 s, 72tuC durante 45 s]627 ciclos, 72tuC durante 10 minutos. 8metroSe
corrió 1 de cada muestra en un gel de agarosa al 1% y se visualizó a una
exposición de 400 ms. Una banda visible de 415 pb se consideró evidencia
positiva deCsp_P bacterias (ver Fig. S7 para un ejemplo representativo). Se
detectó una banda muy tenue en una de las 40 muestras de PBS, lo que
sugiere un evento de contaminación menor o la presencia de otra bacteria
con alta identidad de secuencia paraCsp_P. Este fue un incidente aislado y no
se observó en ninguna otra muestra de PBS. Se secuenciaron dos productos
de PCR independientes a partir de
Csp_P alimentado con muestras y verificado para que coincida perfectamente
con la secuencia obtenida de Csp_P secuenciado directamente del stock del
congelador. Para servir como control positivo y permitir la estimación de la
sensibilidad de la PCR diagnóstica, se corrió una curva estándar en la que un
rango de 107–101 copias del Csp_P El producto de PCR de hcn B se utilizó como
molde. De esta forma, fue posible estimar el umbral mínimo de detección de
este ensayo. Utilizando las condiciones de PCR mencionadas anteriormente,
se detectó una banda en los pocillos que contenían 103 copias iniciales del
producto hcn B pero no en pocillos que contienen 102 copias iniciales, lo que
sugiere que este ensayo es capaz de detectar un mínimo de 103 Copias de
Csp_P /intestino medio.
Introducción de bacterias a través de la harina de sangre.
Dos días antes de la alimentación con sangre, se eliminó la sacarosa y se les dio
agua esterilizada a los mosquitos. Luego se les privó de alimento durante 12 h antes
de la alimentación con sangre.Csp_P se cultivó durante la noche en LB líquido a 30tu
A continuación, se sedimentó el cultivo de una noche (1 ml),
lavado con 16PBS y resuspendido en 16PBS a OD600 =1.0, que
equivale a una concentración de aproximadamente 108 UFC / ml.
A continuación, se permitió a los mosquitos alimentarse por membranas de
sangre que contenía bacterias o 16PBS como control (mezcla de sangre: 50%
1.0 DE600 cultivo bacteriano o 16PBS, 40% de sangre, 10% de suero humano).
Las hembras adultas alimentadas con bacterias ingirieron aproximadamente
105 UFC por mosquito.
Exposición de larvas a Csp_P
De 2 a 4 días después de la eclosión, las larvas se colocaron en placas de cultivo celular
en grupos de 10 por pocillo. Cada pocillo contenía 5 ml de agua esterilizada más una
pequeña cantidad de alimento para larvas (polvo de hígado, alimento en escamas para
peces tropicales y gránulos de alimento para conejos mezclados en una proporción de 2: 1:
1). Luego agregamos 50metrol de una cultura nocturna de Csp_P diluido a
sobredosis600 =1,0 (108 UFC / ml) a cada pocillo; 16 Se añadió PBS a los pocillos de
control y se controló la mortalidad en todos los pocillos durante un período de 5 días.
período.
Mantenimiento de cultivos celulares, infecciones por mosquitos con el
virus del dengue y titulación de intestinos medios infectados
El serotipo 2 del virus del dengue (cepa C de Nueva Guinea,
DENV-2) se propagó en la línea celular de mosquito C6 / 36 según
9 Octubre de 2014 | Volumen 10 | Número 10 | e1004398

métodos publicados anteriormente [8]. En resumen, se permitió que la infección de la línea
celular continuara durante 5-7 días, momento en el cual las células se recolectaron con un
raspador de células y se lisaron mediante congelación y descongelación en
CO seco2 y un 37tuC en baño de agua, luego se centrifuga a 800 g durante 10
min. El serotipo 2 del virus del dengue se aisló y mezcló 1: 1 con
sangre humana comercial y se utiliza para infecciones como se describe en
[8]. Mosquitos que se habían alimentado previamente deCsp_P La solución de
bacterias-sacarosa se privó de alimento durante la noche antes de la infección por el
virus del dengue. Los mosquitos infectados se recolectaron 7 días después de la
infección y se esterilizaron en la superficie sumergiéndolos en etanol al 70% durante
1 minuto y luego enjuagándolos dos veces en 16 PBS durante 2 minutos cada uno.
La disección del intestino medio se realizó en una gota de 16 PBS en condiciones
estériles, y el intestino medio se transfirió a un tubo de microcentrífuga que
contenía 150 metrol de MEM. Los intestinos medios se homogeneizaron utilizando
un motor de mortero de pellets Kontes, se filtraron y se almacenaron a280tuC hasta
que esté listo para la titulación del virus.
La titulación del virus del dengue en el intestino medio infectado se realizó como
se informó anteriormente [8, 30]. En resumen, los homogeneizados de intestino
medio infectados se diluyeron en serie e inocularon en células C6 / 36 en 24-
platos de pozo. Después de una incubación de 5 días a 32tuC y 5% CO2,
las placas se fijaron con 50% / 50% de metanol / acetona, y
las placas se ensayaron mediante inmunotinción con peroxidasa usando
líquido ascítico hiperinmune de ratón específico para DENV-2 como
anticuerpo primario y un conjugado de HRP anti-ratón de cabra como
anticuerpo secundario. Además, cuando se indica, se realizaron ensayos de
placa de virus del dengue en células BHK-21. A los 5 días después de la
infección, las placas de 24 pocillos se fijaron y se tiñeron con violeta cristal. Se
contaron y analizaron las placas (formadas por células con efecto citopático).
P. falciparum cultivo, infecciones por mosquitos y recuento de
oocistos
P. falciparum cepa NF54 se mantuvo en continuo
cultura según el método descrito por Tragger y Jensen
[31]. En breve,P. falciparum se cultivó en glóbulos rojos (RBC) O + a 2% de
hematocrito y medio RPMI 1640 suplementado con glutamina, HEPES,
hipoxantina y suero humano O + al 10%. Para mantener un ambiente
microaerofílico, los parásitos se mantuvieron en un frasco de vela a 37ºC.tu
C.Uso de eritrocitos humanos para apoyar el crecimiento de P. falciparum fue
aprobado por la junta de revisión interna de la Escuela de Salud Pública
Bloomberg. Los eventos de gametocitemia y exflagelación se evaluaron
después de 18 días deP. falciparum cultura. El cultivo de gametocitos se
centrifugó y se diluyó en una mezcla de glóbulos rojos suplementados con
suero. Los mosquitos se volvieron asépticos mediante tratamiento con
antibióticos y luego se alimentaron con alimentadores de membrana durante
30 minutos con sangre que conteníaP. falciparum gametocitos. Csp_P se
añadió directamente a la harina de sangre infecciosa (concentración
bacteriana = 106 UFC / ml) o se introduce a través de una harina de azúcar
como se describe arriba 3 a 4 días antes de la harina de sangre infecciosa. El
mismo día de la ingestión de sangre, se seleccionaron los mosquitos y se
eliminaron los mosquitos no alimentados. De 7 a 8 días después de la
ingestión de sangre, se diseccionaron los mosquitos alimentados y se tiñeron
sus intestinos medios con
Mercurocromo al 0,1%. El número de ooquistes por intestino medio
se determinó con un microscopio de contraste de luz y se calculó la
mediana para el control y cada condición experimental. Se
utilizaron más de tres réplicas independientes por grupo.
Csp_P preparaciones de cultivo para in vitro anti-Plasmodium
y ensayos de actividad anti-dengue
Para cultivar bacterias en condiciones planctónicas, agregamos 5 ml de LB
estéril con 5 metrol de stock de congelador bacteriano y dejó que el cultivo
creciera durante la noche a 30ºC.tuC con temblores. Luego diluimos
cultivos planctónicos a OD600 =1,0 (60.1) con esterilización adicional
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Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.
Caldo LB que, por Csp_P, resulta en una concentración de aproximadamente
108 UFC / ml. Para cultivar bacterias en condiciones de biopelícula,
dispensamos 1 ml de LB estéril en cada pocillo de una placa de cultivo celular
de 24 pocillos y añadimos 1metrol de stock bacteriano para congelador.
Luego dejamos que el cultivo creciera a temperatura ambiente sin agitar
durante 48 h.Csp_P El sobrenadante de biopelícula se recogió de pocillos de
cultivo bacteriano individuales que contenían biopelícula de 48 h y se
encontró que tenía una concentración bacteriana promedio de
aproximadamente 109 UFC / ml. Para recolectar biopelícula fresca, retiramos
el sobrenadante de cinco pozos que contenían biopelícula de 48 h,
resuspendimos la biopelícula de cada pocillo en 100metrol 16 PBS y reunió los
cinco pozos. ParaCsp_P, esta solución de biopelícula combinada contenía
aproximadamente 109 UFC / ml y una media de 5 mg de biopelícula (peso
seco). Para obtener la biopelícula desecada, recolectamos la biopelícula fresca
de cinco pozos como se indica, centrifugamos la biopelícula a 5000 rpm
durante 2.5 min, retiramos el sobrenadante de PBS y permitimos que la
biopelícula se seque a temperatura ambiente. El día del experimento,
resuspendimos los cinco pocillos de biopelícula desecada en 500metrol 16
PBS para imitar el tratamiento de biopelícula fresca. Para inactivar por calor el
biofilm fresco, recolectamos biofilm fresco como se indica e incubamos las
muestras a 90ºC.tuC durante 24 h antes del experimento.
In vitro anti-Plasmodium ensayos de actividad
Nos preparamos Csp_P cultivos bacterianos como se describe anteriormente y filtrar
todas las muestras a través de un 0,2-metrom filtro.
Ensayo en etapa asexual: Inhibición de la etapa asexual P. falciparum
se evaluó mediante un ensayo de fluorescencia basado en SYBR verde I, como
se describió anteriormente [32]. Csp_P La biopelícula se cultivó durante 36 h
para este experimento porque la biopelícula de 48 h causa hemólisis de los
glóbulos rojos (Fig. S8), lo que interfiere con el ensayo. Los parásitos se
sincronizaron con sorbitol al 5% [33]; 5metroSe dispensó 1 l de cada
preparación bacteriana en pocillos por triplicado de microplacas de 96
pocillos, seguido de la adición de 95 metrol de etapa de anillo síncrona P.
falciparum cultivos al 1% de hematocrito y 1% de parasitemia. Se utilizó
cloroquina (250 nM) como control positivo y medio de crecimiento de
parásitos como control negativo. Después de 72 h de incubación en un frasco
de vela a 37tuC, un volumen igual de solución SYBR green-I en tampón de lisis
(Tris [20 mM; pH 7,5], EDTA [5 mM], saponina [0,008%; p / v] y Triton X-100
[0,08%; v / v]) a cada pocillo y se mezcló suavemente, luego se incubó 1 a 2 h
en la oscuridad a temperatura ambiente. Las placas se leyeron en un lector de
placas de fluorescencia (HTS 7000, Perkin Elmer), con longitudes de onda de
excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente. El porcentaje de
inhibición se calculó en relación con los controles negativos (0% de inhibición)
y positivos (100% de inhibición). Se ensayaron tres réplicas biológicas.
Ensayo en etapa de Ookinete: Para evaluar la inhibición de la etapa de ookinete pag.
berghei parásitos, ratones Swiss Webster hembra (6 a 8 semanas de edad)
fueron infectados con una cepa transgénica de P. berghei que expresa
Renilla luciferasa. A partir de los 3 días posteriores a la infección, se realizaron
ensayos de exflagelación hasta que se registraron al menos 20 eventos de
exflagelación en un 206 campo. En este momento, los ratones se sangraron
mediante punción cardíaca con una aguja heparinizada y la sangre se diluyó
en 10 volúmenes de medio ookinete (RPMI 1640, FBS al 10%, 50 mg / ml de
hipoxantina y 2 mg / ml de NaHCO3, pH 8,3) con lisado de RBC de ratón al 4%.
Muestras (50metrol) de cada preparación bacteriana se mezclaron con la
sangre infectada y se incubaron durante 24 ha 19tuC. Los recuentos de
ookinete se determinaron utilizando el Renilla
sistema de ensayo de luciferasa (Promega, EE. UU.) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. El experimento se realizó en dos
días independientes y cada muestra se analizó por triplicado cada
día.
Ensayo en etapa de gametocitos: Inhibición de la etapa de gametocitos pag.
falciparum por Csp_P se evaluó como se describió anteriormente [34]. Para prevenir
la hemólisis de los glóbulos rojos,Csp_P la biopelícula se cultivó durante 36
10 Octubre de 2014 | Volumen 10 | Número 10 | e1004398

y 42 horas para este experimento. En resumen, NF54P. falciparum
los cultivos se iniciaron con parasitemia asexual al 0,5% y hematocrito al
4%. Csp_P Las preparaciones bacterianas se agregaron 15 días después
Plasmodium se iniciaron los cultivos y se determinó la gametocitemia 18
días después del inicio del cultivo. Se probaron al menos tres réplicas
biológicas para cada preparación de cultivo. Se examinaron más de 500
eritrocitos en busca de gametocitos en los frotis de sangre
Giemsastained de cada muestra.
In vitro ensayos de actividad anti-dengue
Nos preparamos Csp_P cultivos bacterianos como se describió
anteriormente (estado planctónico, biopelícula, sobrenadante de biopelícula,
biopelícula desecada y biopelícula inactivada por calor), mezcla 75 metrol de
cada preparación de cultivo bacteriano con 75 metrol de MEM que contenía
virus del dengue serotipo 2 y se incubó la mezcla a temperatura ambiente
durante 45 min. A continuación, las muestras se filtraron a través de un 0,2-
metrom, diluido en serie y utilizado para infectar células BHK21-15. Los
ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente para evaluar
la infectividad del virus del dengue. El porcentaje de inhibición se calculó
como el porcentaje de disminución en PFU / ml con respecto al control PBS +
LB, que se estandarizó al 0% de inhibición. El experimento se realizó en dos
días independientes y cada ensayo se realizó por triplicado cada día. En
experimentos en los que el dengue se mezcló con sangre humana antes de la
exposición aCsp_P, Las biopelículas bacterianas no se eliminaron de la placa
de cultivo celular. Más bien, el virus del dengue se mezcló 1: 1 con sangre
humana y 150metrol de esta mezcla se añadió directamente a cada pocillo
que contenía Csp_P biopelícula y se incubó durante 45 min a 30tuC. Después
de este período de incubación, la solución del virus del dengue en sangre se
mezcló con la biopelícula y se metroLuego se extrajo 1 l de la mezcla del
pocillo, se diluyó en MEM y se filtró a través de un
metrom filtro. La solución de filtrado resultante se diluyó luego en serie y se
usó para infectar células C6 / 36.
Ensayo de secuestro de partículas virales por Csp_P biopelícula
Evaluar si la actividad anti-dengue de Csp_P se debió al secuestro de DENV
por parte de Csp_P biopelícula, mezclamos una suspensión del virus del
dengue con Csp_P 48 h de biofilm o caldo LB y se incubó durante un período
de 45 min. A continuación, las muestras se centrifugaron a 5.000 rpm durante
5 min. Se recogieron los sobrenadantes y se extrajo el ARN de volúmenes
iguales (50metrol) de muestras experimentales (biofilm + DENV) y control (LB
+ DENV) utilizando el kit RNeasy (Qiagen). La comparación de las cargas de
ARN viral en el sobrenadante extraído se realizó mediante cuantificación
relativa de RT-qPCR, utilizando 2metrol del ARN viral en un 20-metrol volumen
de reacción.
Evaluación de los efectos del pH sobre la infectividad del virus del dengue
El pH de las biopelículas bacterianas y los sobrenadantes se evaluó con un
microelectrodo de pH (Lazar Lab) a temperatura ambiente. Los efectos de los
cambios de pH sobre la infectividad del virus del dengue se evaluaron
ajustando el pH del MEM con NaOH y HCl hasta obtener el rango deseado de
valores de pH: 5,0, 7,7, 8,5 y 10,0. A continuación, el MEM con pH ajustado se
mezcló con sangre cargada de virus del dengue y se incubó durante 45 min
antes de la dilución en serie y la infección de las células C6 / 36.
Ensayos de viabilidad celular
Los ensayos de viabilidad celular en la línea celular de mosquito C6 / 36 y la
línea celular de vertebrado BHK-21 se realizaron mediante tinción con azul
tripán (0,4%, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En
resumen, 50metrol de células suspendidas se colocaron en un tubo de
microcentrífuga y se mezclaron con 10 metrol de Csp_P biopelícula fresca
filtrada o PBS como control. Las células C6 / 36 se incubaron a 32ºC.tuC
y las células BHK-21 se incubaron a 37tuC + 5% CO2 durante 45 min.
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Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.
Luego, las células se mezclaron con 12 metrol de tinción de azul tripán al
0,4%. La mezcla se dejó reposar durante 5 min a temperatura ambiente y
luego se cargó en un hemocitómetro para la evaluación de la viabilidad
celular y el recuento bajo un microscopio.
Ensayo de los efectos de Csp_P biopelícula sobre la susceptibilidad
de la célula huésped al DENV
Para evaluar si la exposición a Csp_P biofilm cambia la susceptibilidad de la
célula huésped a DENV, realizamos ensayos que exponen las células C6 / 36 a
Csp_P-biopelícula filtrada antes de la infección por el virus del dengue. Las
células se cultivaron hasta un 80% de confluencia; Luego se retiró el medio
celular, se lavó una vez con 16PBS, y luego superpuesto con 100 metrol de
Csp_P biopelícula que se había filtrado con un 2-metrom filtro o con 16 PBS
(control) durante aproximadamente 10 min. Luego, las placas se lavaron tres
veces con 16PBS y luego infectado con 100 metrol de virus del dengue
durante unos 45 min. Se evaluó la formación de placas en las células 6 días
después de la infección.
Ensayo de hemólisis
Los eritrocitos humanos se lavaron con medio RPMI 1640 hasta que el
sobrenadante estuvo visualmente libre de pigmento de hemoglobina. Los
eritrocitos lavados se suspendieron en medio completo de malaria para
producir un hematocrito del 1%. FiltradoCsp_P El biofilm se mezcló con
eritrocitos y se incubó hasta 24 h a 37ºC.tuC. Para separar el citosol de RBC
lisado de los RBC completos, la suspensión se centrifugó a 2000 rpm durante
5 min. El sobrenadante resultante se aspiró cuidadosamente y se colocó en
placas en nuevas microplacas de 96 pocillos. Se utilizaron eritrocitos de
control sin ningún material bacteriano como control negativo (blanco) y como
control positivo se utilizó lisado de eritrocitos congelado-descongelado
(hemolizado al 100%). Para determinar el% de lisis en las muestras de prueba,
las placas se leyeron a 405 nm en un lector de placas ELISA (HTS 7000 Perkin
Elmer) y la lectura se expresó como una fracción del control positivo.
Ensayos de qPCR en tiempo real
Para realizar ensayos de PCR en tiempo real, las muestras de ARN se
trataron con Turbo DNasa (Ambion, Austin, Texas, Estados Unidos) y se
sometieron a transcripción inversa utilizando M-MLV Reverse Transcriptase
(Promega, EE. UU.). Los ensayos de PCR en tiempo real se realizaron
utilizando el kit SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City,
California, EE. UU.) En un 20-metrol volumen de reacción; Todas las muestras
se analizaron por duplicado. El gen de la proteína ribosómica S7 se utilizó
para la normalización de moldes de ADNc. Las secuencias de cebadores
utilizadas en estos ensayos se dan en la Tabla S1.
análisis estadístico
La prueba U de Mann-Whitney, el ANOVA de una vía con la prueba
posterior de Dunnett y las pruebas Log-Rank por pares para el análisis de
supervivencia se realizaron utilizando el paquete de software estadístico
GraphPad Prism (Prism 5.05; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Los
datos de la Figura 5 se analizaron utilizando un ANOVA, seguido de una
prueba de Tukey en R (R Foundation for Statistical Computing).
información de soporte
Datos S1 Datos brutos de las figuras 1 a 5.
(XLSX)
Figura S1 Csp_P provoca la expresión de genes inmunes en el
intestino medio del mosquito. Cambios en la abundancia de transcripciones
de genes efectores inmunes en el intestino medio de (A) Ae. aegyptiy B)
Un. GambiaeLos mosquitos se midieron después de la introducción de
Csp_P a través de una harina de azúcar. Para cada gen, los controles de PBS
se estandarizaron a un valor de 1.0, yCsp_P-cambios inducidos en el gen
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La expresión se muestra como un cambio de -veces por encima o por debajo
de los controles alimentados con PBS. CecG = cecropina G, DefC = defensina
C, LysC = lisozima C, CecE = cecropina E, Cec1 = cecropina 1, Def1 = defensina
1, PGRP-LC = receptor de reconocimiento de peptidoglicano LC, Rel2 = NF
similar al condimentokFactor de transcripción B 2, Tep1 = proteína tioéster 1,
LRRD7 = proteína de dominio de repetición rica en leucina 7 (también
conocida como APL2 y LRIM17), FBN9 = fibronectina 9. Pruebas de Mann
Whitney que comparan los valores de deltaCT entre mosquitos alimentados
con bacterias y con PBS para cada gen se realizaron para determinar la
significancia (*, p, 0.05).
(TIF)
Figura S2 Efecto de la biopelícula de 36 h en la etapa de gametocitos pag.
falciparum. Csp_P Los cultivos se filtraron utilizando un 0,2-metrom filtro y
mezclado con gametocitos en etapa P. falciparum culturas. Se examinaron los
eritrocitos en busca de gametocitos utilizando frotis de sangre Giemsastained
recogidos 3 días despuésCsp_P exposición. Determinamos la densidad de
gametocitos por 1000 glóbulos rojos para cada muestra y realizamos una
prueba de Tukey para determinar si cada tratamiento bacteriano difería
significativamente del control PBS + LB. Ningún tratamiento fue significativo,
pero el sobrenadante de 36 h de biopelícula tendió a ser significativo (p = 0.06)
(TIF)
Figura S3 (A) Actividad anti-dengue de fresco Csp_P
el biofilm solo está débilmente presente después de 24 h de crecimiento
a temperatura ambiente y se vuelve muy potente después de 48 h
de crecimiento. El virus del dengue se mezcló 1: 1 con sangre humana y se
expuso directamente a Csp_P biopelícula cultivada durante 24 o 48 h. Las
muestras se incubaron durante 45 min y luego se recogieron, filtraron y
usaron para infectar células C6 / 36. (B) Las partículas del virus del dengue no
son secuestradas porCsp_P biopelícula. Mezclamos el virus del dengue con
Csp_P biopelícula y se incubó la mezcla durante 45 min. Luego centrifugamos
las muestras y usamos qRT-PCR para cuantificar el ARN viral en el
sobrenadante del experimental (biofilm + DENV) y control (LB + DENV)
tratos.
(TIF)
Figura S4 (A) Evaluar los cambios en el pH causados por Csp_P
biopelícula. Expusimos el virus del dengue a Csp_P biopelícula, se incubó
durante 45 min y se midió el pH del medio. (B) Evaluación del efecto del pH
sobre la infectividad del virus del dengue. Ajustamos experimentalmente el
pH del medio MEM usando NaOH y HCl a valores de 5.0, 7.7, 8.5 y 10.0.
Mezclamos el medio con pH ajustado con sangre humana cargada con el virus
del dengue y lo incubamos durante 45 minutos, luego recolectamos y
filtramos el virus y lo usamos para infectar C6 / 36.
células.
(TIF)
Figura S5 El extracto crudo de biopelícula no tiene células
efectos sobre citotóxicas de insectos o mamíferos. Usamos azul tripán
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Actividad anti-patógena y entomopatógena de Chromobacterium Csp_P.
tinción (0,4%, Invitrogen) para analizar la viabilidad celular de las células BHK21-15
(A) y C6 / 36 células (B) después de una exposición de 45 min a filtrada Csp_P
biopelícula fresca. Diferencia en la viabilidad celular debido aCsp_P la exposición no
fue significativa para ambas líneas celulares (prueba de Mann Whitney).
(TIF)
Figura S6 Exposición a Csp_P biofilm no altera el
susceptibilidad de las células de insectos al virus del dengue. Nosotros filtramos
Csp_P biopelícula utilizando un 0,2-metromy se expusieron células C6 / 36
(cultivadas hasta un 80% de confluencia) al filtrado bacteriano durante 45 min.
Csp_P El filtrado de biopelícula se lavó luego de las células usando 16
PBS y las células se infectaron con el virus del dengue. Se evaluó la formación de
placas en las células 6 días después de la infección.
(TIF)
Figura S7 Geles representativos del diagnóstico por PCR para ensayar la
presencia de Csp_P en Aedes intestino medio de mosquito. Nosotros
usó 10 ng de ADN de cada Aedes hembra alimentada con una
harina de azúcar que contiene PBS o Csp_P a una concentración
final de 1010 UFC / ml. Usando 10 ng de ADN de cada muestra como
plantilla, realizamos una PCR usando cebadores específicos para el
Csp_P gen de la cianuro de hidrógeno sintasa B.
(TIF)
Figura S8 Csp_P biofilm es hemolítico cuando se expone a
glóbulos rojos humanos. Mezclamos filtrado Csp_P biopelícula fresca
con eritrocitos humanos, incubada 24 ha 37tuC y se centrifugó a 2000
rpm durante 5 min. Luego retiramos el sobrenadante y analizamos la
absorbancia a 405 nm en un lector de placas ELISA (HTS 7000 Perkin
Elmer). 16Se utilizó PBS como control negativo y
saponina como un control positivo.
(PELEA)
Cuadro S1 Lista de cebadores genéticos utilizados en la expresión génica
análisis de los tejidos de los mosquitos después de la exposición bacteriana.
(DOCX)
Expresiones de gratitud
Agradecemos a Janece M. Lovchik, Bhavin Thumar y Anna P. Durbin por
proporcionar apoyo técnico y materiales (cepas DENV-2 y la línea celular C6 /
36). También agradecemos a la Subdivisión de Enfermedades por Arbovirus
de los CDC por proporcionar los anticuerpos anti-dengue (líquido ascítico
hiperinmune de ratón). Agradecemos al personal de insectarios del Johns
Hopkins Malaria Research Institute por su ayuda con la cría de mosquitos.
Contribuciones de autor
Concibió y diseñó los experimentos: JLR SMS GD. Realizó los experimentos: JLR
SMS ACB RGS YD SK AT GM. Analizó los datos: JLR SMS ACB RGS YD SK AT GM.
Reactivos / materiales / herramientas de análisis aportados: GD. Escribió el
artículo: JLR SMS GD.
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13 Octubre de 2014 | Volumen 10 | Número 10 | e1004398
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