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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Biología y fisiología molecular

crossm

Un contraataque químico: Chromobacterium violaceum ATCC

31532 produce Violacein en respuesta a la traducción-
Antibióticos inhibidores

Gabriel L. Lozano,a, b Changhui Guan,B Yanzhuan Cao,B Bradley R. Borlee,C Nichole A. Broderick,D Eric V. Stabb,mi
Jo Handelsmana, b

Descargado de http://mbio.asm.org/ el 20 de mayo de 2020 por invitado

aInstituto de Descubrimiento de Wisconsin y Departamento de Fitopatología, Universidad de Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, EE. UU.

B Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, Universidad de Yale, New Haven, Connecticut, EE. UU.

C Departamento de Microbiología, Inmunología y Patología, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, Colorado, EE. UU.

D Departamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de Connecticut, Storrs, Connecticut, EE. UU.

mi Departamento de Microbiología, Universidad de Georgia, Athens, Georgia, EE. UU.

ABSTRACTO Los antibióticos producidos por bacterias juegan un papel importante en las interacciones

microbianas y la competencia. La antibiosis puede inducir mecanismos de resistencia en los organismos

diana y, en dosis subletales, se ha demostrado que los antibióticos alteran globalmente los patrones de
expresión génica. Aquí, mostramos que la higromicina A deStreptomyces sp. cepa 2AW. induce
Chromobacterium violaceum ATCC 31532 para producir el antibiótico violelaceína violeta. Las dosis
subletales de otros antibióticos que se dirigen de manera similar a la etapa de elongación del polipéptido
de la traducción también indujeron la producción de violaceína, a diferencia de los antibióticos con
diferentes dianas.C. violaceum formación de biopelículas y virulencia contra
Drosophila melanogaster también fueron inducidos por antibióticos inhibidores de la traducción, e
identificamos una respuesta inducida por antibióticos (aire) sistema regulatorio de dos
componentes que se requiere para estas respuestas. Los análisis genéticos indicaron una conexión
entre el sistema Air, la señalización dependiente del quórum y el regulador negativo VioS, lo que
nos llevó a proponer un modelo para la inducción de la producción de violaceína. Este trabajo
sugiere un mecanismo novedoso de interacción entre especies en el que una bacteria produce un
antibiótico en respuesta a la inhibición de otra bacteria y apoya el papel de los antibióticos como
moléculas señal. Citación Lozano GL, Guan C, Cao Y, Borlee BR,
Broderick NA, Stabb EV, Handelsman J. 2020. Un
IMPORTANCIA Los metabolitos secundarios desempeñan funciones importantes en las comunidades
contragolpe químico: Chromobacterium
microbianas, pero sus funciones naturales a menudo se desconocen y pueden ser más complejas violaceum ATCC 31532 produce violaceína en
de lo que se cree. Si bien a menudo se supone que los compuestos con actividad antibiótica son la respuesta a antibióticos inhibidores de la
traducción. mBio 11: e00948-20.https://doi.org/
base de la competencia microbiana, pueden actuar alternativamente como moléculas señal. En
10.1128/ mBio.00948-20.
cualquier escenario, los microorganismos pueden desarrollar respuestas a concentraciones Editor Michele S. Swanson, Universidad de
subletales de estos metabolitos, ya sea para protegerse de la inhibición o para cambiar ciertos Michigan-Ann Arbor

comportamientos en respuesta a la abundancia local de otra especie. Aquí, informamos que la Derechos de autor © 2020 Lozano et al. Este es un
artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos
producción de violaceína porC. violaceum ATCC 31532 se induce en respuesta a la higromicina A de de laLicencia internacional Creative Commons
Streptomyces sp. 2AW, y mostramos que esta respuesta depende de la inhibición de la elongación Attribution 4.0.

del polipéptido traduccional y de un sistema regulador de dos componentes previamente no Dirija la correspondencia a Jo Handelsman,
jo.handelsman@wisc.edu.
caracterizado. La amplitud de la respuesta transcripcional más allá de la inducción de violaceína
Este artículo es una contribución directa de Jo
sugiere una interacción microbémicrobiana mediada por metabolitos sorprendentemente compleja Handelsman, miembro de la Academia
y apoya la hipótesis de que los antibióticos evolucionaron como moléculas señal. Estos nuevos Estadounidense de Microbiología, quien
organizó y obtuvo revisiones de Vaughn
conocimientos informarán a los modelos predictivos de la dinámica de la comunidad del suelo y los
Cooper, Universidad de Pittsburgh, y Gerard
efectos no deseados de la administración clínica de antibióticos. Wright, Universidad McMaster.
Recibió 20 de abril de 2020
Aceptado 21 de abril de 2020
PALABRAS CLAVE antibióticos de concentración subletal, sistema regulador de dos componentes, Publicado 19 de mayo de 2020

Streptomyces, interacciones microbio-microbio, inhibición de la traducción

® mbio.asm.org 1
Mayo / junio de 2020 Volumen 11 Edición 3 e00948-20
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Lozano y col.

I En muchas comunidades microbianas, diversas especies contribuyen a funciones complejas que no

pueden realizar de forma aislada (1). Los miembros de la comunidad también compiten entre sí (2), en
parte a través de la producción de antibióticos, metabolitos secundarios que inhiben a otros miembros de
la comunidad. Es probable que la capacidad de los microorganismos para detectar y responder a los
antibióticos sea importante para la supervivencia y la competitividad en comunidades complejas. La visión
de los antibióticos como herramientas tanto de guerra como de paz ha evolucionado durante los últimos
30 años. Aunque durante mucho tiempo se asumió que eran armas de destrucción, es poco probable que
la mayoría de los antibióticos alcancen concentraciones letales en el mundo natural, por lo que se han
propuesto otras funciones (3-5).
Las actinobacterias son productores prolíficos de metabolitos secundarios que afectan el desarrollo y el metabolismo secundario en las bacterias diana (6, 7). Diferentes clases de metabolitos

secundarios secretados, como sideróforos, biosurfactantes y antibióticos, modulan las interacciones bacterianas. Los antibióticos influyen en los comportamientos sociales intraespecies, como la

producción de biopelículas (8, 9) y contribuyen a la discriminación de parientes y no parientes (9). Las interacciones entre especies mediadas por antibióticos incluyen la alteración de la virulencia (10) y

el metaboloma secretado (7). En varias bacterias patógenas, las concentraciones subletales de antibióticos inducen una respuesta transcripcional global, que podría ser una respuesta al estrés, pero

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también podría indicar que los antibióticos actúan como moléculas de señal (3, 11). Un desafío actual es comprender cómo las bacterias transforman la exposición a antibióticos en una respuesta

transcripcional dirigida. La evidencia sugiere que los antibióticos típicamente provocan respuestas fisiológicas a través de su actividad inhibitoria más que por otros medios como el reconocimiento

estructural (12, 13). El daño celular generado por antibióticos bactericidas puede inducir la transcripción de genes de respuesta al estrés, pero está menos claro cómo los antibióticos bacteriostáticos

provocan cambios transcripcionales. El concepto de "detección de competencia" sugiere que algunos microbios pueden haber desarrollado la capacidad de detectar una señal de peligro mediante el

uso de respuestas de estrés establecidas y responder regulando al alza la producción de toxinas y antibióticos (14). La evidencia sugiere que los antibióticos típicamente provocan respuestas

fisiológicas a través de su actividad inhibitoria más que por otros medios como el reconocimiento estructural (12, 13). El daño celular generado por antibióticos bactericidas puede inducir la

transcripción de genes de respuesta al estrés, pero está menos claro cómo los antibióticos bacteriostáticos provocan cambios transcripcionales. El concepto de "detección de competencia" sugiere que

algunos microbios pueden haber desarrollado la capacidad de detectar una señal de peligro mediante el uso de respuestas de estrés establecidas y responder regulando al alza la producción de

toxinas y antibióticos (14). La evidencia sugiere que los antibióticos típicamente provocan respuestas fisiológicas a través de su actividad inhibitoria más que por otros medios como el reconocimiento

estructural (12, 13). El daño celular generado por antibióticos bactericidas puede inducir la transcripción de genes de respuesta al estrés, pero está menos claro cómo los antibióticos bacteriostáticos

provocan cambios transcripcionales. El concepto de "detección de competencia" sugiere que algunos microbios pueden haber desarrollado la capacidad de detectar una señal de peligro mediante el

uso de respuestas de estrés establecidas y responder regulando al alza la producción de toxinas y antibióticos (14).

Cromobacteria Las especies son betaproteobacterias gramnegativas bien conocidas por la

producción de violaceína, un pigmento púrpura con actividades antimicrobianas y antiparasitarias
(15, 16). La violelaceína tiene una amplia actividad antimicrobiana contra diversas bacterias
grampositivas (15), que actúa alterando la integridad de la membrana celular (17). Descubrimos una
interacción entre especies que desencadena la producción de violaceína en la queStreptomyces sp.
cepa 2AW (18) induce la producción de violaceína enChromobacterium violaceum ATCC
31532. En el presente estudio, ampliamos la comprensión de los antibióticos como señales entre
especies al describir una nueva cascada reguladora en C. violaceum ATCC 31532 que le permite
responder a inhibidores del paso de elongación de la traducción mediante un sistema regulador de
dos componentes previamente desconocido.

RESULTADOS

La higromicina A estimula la producción de violaceína. Encontramos eso Streptomyces

sp. 2AW induce la producción de violaceína porC. violaceum ATCC 31532 (aquí referido como
C. violaceum) cuando las bacterias crecen en estrecha proximidad (Fig. 1A). El contacto no es
necesario, lo que sugiere que una molécula difusible producida porStreptomyces sp. 2AW es
responsable de desencadenar la respuesta. Higromicina A parcialmente purificada de
Streptomyces sp. 2AW a niveles subletales induce la producción de violaceína, al igual que
otra bacteria productora de higromicina A,Streptomyces higroscopicus NRRL 2388 (Fig. 1B y
C). Mutaciones que atenúan o bloquean la producción de higromicina A (Δhig17 o Δhig8,
respectivamente [19]) eliminó la inducción de violaceína por S. higroscopicus (Figura 1C). Tomados en
conjunto, estos resultados indican que la higromicina A es probablemente responsable de la capacidad de
Streptomyces sp. 2AW para inducir la producción de violaceína enC. violaceum.
La producción de violelaceína es inducida por inhibidores del alargamiento de polipéptidos.
Consideramos las posibilidades alternativas de que la inducción de violaceína podría ser una respuesta a
(i) la molécula de higromicina A específicamente, (ii) la inhibición de la traducción de la higromicina
A, o (iii) la antibiosis subletal de manera más general. Para distinguir entre estas tres alternativas,
evaluamos diversas clases de antibióticos, incluidos los que bloquean varios pasos en la traducción
y otros que tienen diferentes dianas celulares (ver Fig. S1 en el material complementario). De los 20
antibióticos probados, 7 indujeron la producción de violaceína en

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C. violaceum Produce Violacein en respuesta a los antibióticos.

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FIGURA 1 Producción de violelaceína por C. violaceum (Cvio) es inducida por antibióticos producidos por Streptomyces
spp. (A)C. violaceum crecimiento con Streptomyces sp. 2AW (2AW). (B) Fracciones de cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC) de extracto de metanol deStreptomyces sp. Cultivo 2AW manchado en medio
sólido extendido conC. violaceum. (C) C. violaceum crecimiento con S. higroscopicus NRRL 2388 (NRRL2388)
de tipo salvaje (WT) y dos mutantes con (Δhig17) o abolido (Δhig8) producción de higromicina A.

C. violaceum, incluyendo blasticidina S, espectinomicina, higromicina B, apramicina,

tetraciclina, eritromicina y cloranfenicol (Fig. 2A; Fig. S1). Estos antibióticos comparten dos
características con la higromicina A, a saber, inhiben el crecimiento deC. violaceum, y
bloquean el alargamiento de polipéptidos durante la traducción, aunque pertenecen a
diferentes familias químicas e inhiben la traducción al unirse a diferentes sitios en la región
ribosómica responsables del alargamiento de polipéptidos. Otros antibióticos, incluidos
varios que bloquean diferentes pasos de la traducción (p. Ej., Kasugamicina, puromicina y
kanamicina), no indujeron violaceína (Fig. S1).

FIGURA 2 Genes implicados en la inducción de la producción de violaceína. (A) Producción de violelaceína en respuesta a varios inductores enC.
violaceum tipo salvaje (WT). (B)C. violaceum mutantes afectados en la producción de violaceína en respuesta a todos los inductores probados. NA,
sin antibiótico; Tet, tetraciclina; Spec, espectinomicina; Ery, eritromicina.

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Lozano y col.

Para explorar si la inducción de la producción de violaceína es una respuesta a la inhibición del

alargamiento del polipéptido, sometimos C. violaceum al choque frío. Las disminuciones repentinas
de temperatura pueden inhibir el alargamiento de polipéptidos al generar estructuras secundarias
en el ARNm (20), y estudios previos indicaron paralelos en las respuestas entre los antibióticos
inhibidores de la traducción y el choque frío (21). Descubrimos que la transferencia rápida de
cultivos de caldo de fase exponencial de 28 ° C a 16 ° C inducía la producción de violaceína enC.
violaceum (Figura 2A).
El sistema regulador de dos componentes Air es necesario para la respuesta a la inhibición de la
traducción. Para identificar los elementos que participan en la transducción del estímulo de la inhibición
de la traducción en la respuesta de la producción inducida de violaceína, examinamos mutantes de
transposones aleatorios para detectar la pérdida de esta capacidad. Debido a que la higromicina A no está
disponible comercialmente, examinamos las respuestas a concentraciones subletales de tetraciclina, otro
fuerte inductor de la producción de violaceína (Fig. 2A). Los mutantes se seleccionaron para una

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caracterización adicional si la pantalla revelaba al menos dos mutantes independientes con inserciones de
transposones en el mismo gen, y estos genes eran diferentes de los de detección de quórumcviI / cviR
sistema. Para probar el papel de estos genes en la respuesta reguladora a la interrupción del alargamiento
del polipéptido, evaluamos adicionalmente la producción de violaceína de cada mutante cuando se trataba
con espectinomicina, eritromicina o inducción de choque frío a 16 ° C. Identificamos cinco genes que,
cuando se alteran, disminuyen la producción de violaceína en respuesta a cada uno de estos estímulos (Fig.
2B). También identificamos mutantes con respuestas alteradas a un subconjunto de tratamientos (Fig. S2).

(i) Mutantes con respuestas similares a los inhibidores del alargamiento de polipéptidos.
Las cepas con mutaciones en un grupo de tres genes que codifican un sistema regulador putativo
de dos componentes no responden a los tres antibióticos probados o al choque frío (Fig. 2B).
Denominamos a este grupo la respuesta inducida por antibióticos (aire) sistema, compuesto por
genes que codifican proteínas que se predice que sirven como sensor de histidina quinasa (AirS), un
regulador de respuesta (AirR) y una proteína de dominio de unión a oxidorreductasa
molibdopterina (OxMoco) (número de acceso InterPro IPR036374) (AirM). losaireS y airM
los genes parecen estar organizados en un operón. En muchos sistemas reguladores de dos componentes,
los genes reguladores de respuesta y sensor se cotranscriben. Sin embargo, en este sistema,airMS y airR se
transcriben de manera convergente (Fig. 3A y B). En particular, otros tres genes sensores de histidina
quinasa en el genoma están dispuestos de manera similar cerca de genes que codifican un dominio
OxMoco. También se observan sistemas similares en otrosCromobacteria
y Burkholderia spp. (Figura S3). Para determinar siairM es esencial para la inducción de la
producción de violaceína, o si el fenotipo de la airM transposón mutante refleja un efecto
polar en aireS, borramos el airMS operón y luego complementó el mutante con
aireS o con airMS. Complementación con airMS restauró la respuesta a la tetraciclina, mientras que
suministraba aireS solo no lo hizo (Fig. 3C), lo que sugiere que airM proporciona un papel funcional
importante para el sistema regulador de dos componentes.
Además de los mutantes con inserciones que interrumpen el aire sistema, identificamos cepas
que contienen inserciones de transposones en un gen de fosfoenolpiruvato sintasa (ppsA;
CLV04_1656) y un supuesto gen de ligasa de coenzima A (CoA) de ácidos grasos de cadena larga (
fadD2; CLV04_3834) que también muestran una inducción de violaceína atenuada en respuesta a la
tetraciclina u otras condiciones que inhiben el alargamiento del polipéptido (Fig. 2B).
(ii) Mutantes con efectos específicos de antibióticos. También identificamos varios mutantes
que no indujo la producción de violaceína, pero sólo para un subconjunto específico de antibióticos
(Fig. S2A). Tras el examen, estos mutantes, incluido el recientemente descritocdeR
(CLV04_2412) represor transcripcional del cdeAB-oprM bomba de e fl ujo de múltiples fármacos (22),
simplemente se había vuelto más resistente al antibiótico respectivo, y en dosis más altas, la
inducción de violaceína todavía era evidente (Fig. S4).
Además, las cepas con mutaciones en un regulador transcripcional de la familia
GntR (CLV04_3464) y en un transportador ABC (CLV04_3178) mostraron una inducción
más pronunciada de violaceína en respuesta a la presencia de tetraciclina, eritromicina
o espectinomicina. Cepas con mutaciones en una supuesta enoil-CoA hidratasa (fadB2;
CLV04_1011) igualmente mostraron mayor inducción de violaceína en presencia de los tres
antibióticos y a la inducción de choque frío a 16 ° C, pero estos mutantes también presentaron

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C. violaceum Produce Violacein en respuesta a los antibióticos.

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FIG. 3 Sistema de respuesta inducida por antibióticos. Sistema regulador de dos componentes identificado por
análisis de mutantes. (A) Organización genética. (B) Dominios funcionales en proteínas predichas. SP, péptido señal;
OxMoco, superfamilia de dominios de unión a molibdopterina oxidorreductasa (nº de acceso de InterPro
IPR036374); TM, dominio transmembrana; NC, dominio no citoplásmico; HisK, transducción de señales histidina
quinasa, superfamilia de dominios de dimerización / fosfoacceptor (IPR036097); HATPasa, superfamilia de histidina
quinasa / ATPasa similar a HSP90 (IPR036890); REC, dominio receptor de fosfoacceptor similar a CheY (IPR001789);
BetR, regulador transcripcional betaproteobacteriano (IPR013975). (C) Producción de violaceína en el tipo salvaje
(WT) que lleva un vector vacío y en elairMS mutante con vector vacío o vector que lleva aireS o airMS.
* * **, PAG 0,0001; ns, no signi fi cativo (PAG 0,05).

un nivel basal más alto de producción de violaceína incluso en ausencia de estos estímulos
(Fig. S2B).
Respuestas adicionales a concentraciones subletales de antibióticos.
Concentraciones subletales de fenotipos inducidos por tetraciclina distintos de la producción
de violaceína en C. violaceum. Por ejemplo, C. violaceum producido biopelículas sobre vidrio
en respuesta a concentraciones subletales de tetraciclina en un aire-de manera dependiente
(Fig. S5). También probamosC. violaceum en un ensayo de infección oral con Drosophila
melanogaster, que era de interés debido a la estrecha asociación filogenética de la cepa con
Chromobacterium subtsugae, un insecto patógeno (Fig. S6). C. violaceum delicado D.
melanogaster en presencia de tetraciclina, pero no en su ausencia, y esta virulencia inducida
por tetraciclina requirió la aire sistema (Fig. 4). C. violaceum ATCC 12472, un patógeno
humano que produce violaceína, no muestra una fuerte actividad insecticida en comparación
con C. violaceum ATCC 31532 (figura 4). Anticipamos queC. violaceum La actividad insecticida
es independiente de la violaceína, como se informa en C. subtsugae actividad insecticida
contra el escarabajo de la patata de Colorado (23).
La expresión de violelaceína está bajo el control del sistema de detección de quórum CviI / CviR,
y está regulada negativamente por vioS, un regulador de otro modo no caracterizado (24, 25).
Probamos la formación de biopelículas y la actividad insecticida en unvioS mutante, que produce
violaceína constitutivamente, y en un vioS cviI doble mutante, que no produce violaceína. Tanto la
producción de biopelículas como la actividad insecticida se expresan en lavioS
mutante y no en el vioS cviI doble mutante, lo que indica que están regulados por el sistema
de detección de quórum CviI / CviR y reprimidos por VioS (Fig. 4; Fig. S5).
Cambios transcripcionales en respuesta a concentraciones subletales de antibióticos.
Comprender mejor la respuesta fisiológica a concentraciones subletales de antibióticos
y el papel de los aire sistema en él, utilizamos análisis de secuenciación de ARN global
(RNA-Seq). C. violaceum tipo salvaje (WT) y airR mutantes se cultivaron ambos sin

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FIG 4 Actividad insecticida de C. violaceum se ve reforzada por la tetraciclina. Actividad insecticida deC. violaceum

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contra Drosophila melanogaster con y sin una concentración subletal de tetraciclina. C. violaceum
(CvATCC31532) tipo salvaje (WT), aireS, vioS, y vioS cviI mutantes, y C. violaceum Se evaluó ATCC 12472
(CvATCC12472) de tipo salvaje (WT). Tet, tetraciclina.

antibióticos y desafiados por separado con tetraciclina y espectinomicina, y los conjuntos de ARN se
sometieron a análisis de secuenciación de ARN. Cada antibiótico indujo una respuesta
transcripcional distinta pero superpuesta en el tipo salvaje (Fig. S7A). Utilizando las categorías
Clusters of Ortologous Groups (COG), analizamos los 640 genes que respondieron de manera
similar a ambos antibióticos (Tabla S1A). Los genes de la motilidad se enriquecieron entre los genes
que se regularon negativamente en respuesta a la tetraciclina y la espectinomicina (Fig. S7B). Los
genes implicados en la traducción, la estructura ribosómica y la biogénesis, y la biosíntesis, el
transporte y el catabolismo de metabolitos secundarios se enriquecieron entre los que se
incrementaron en respuesta a ambos antibióticos (Fig. S7B).
Una comparación de la respuesta transcripcional WT con la airR La respuesta mutante identificó
83 genes que estaban regulados diferencialmente, lo que sugiere que fueron modulados directa o
indirectamente por el aire sistema. Estas transcripciones incluyeron el grupo de genes de violaceína
y otros dos grupos de genes que codifican las rutas biosintéticas de metabolitos secundarios (Tabla
S1A). Otros genes expresados diferencialmente se clasificaron en varias categorías funcionales sin
un patrón distinto.
También se encontró que algunos genes que se describieron anteriormente como identificados en el
cribado mutante de transposón para respuestas de inducción de violaceína alteradas estaban regulados en
respuesta a tetraciclina y espectinomicina. Por ejemplo, la alteración de un gen que codifica un regulador
transcripcional de la familia MarR (CLV04_1869) resultó en la pérdida de la inducción de violaceína
específicamente en respuesta a la tetraciclina (Fig. S2), y este gen se incrementó en respuesta tanto a la
espectinomicina como a la tetraciclina (Tabla S1B) . Por el contrario, la interrupción defadB2, con una
función predicha de una enoil-CoA hidratasa, dio como resultado una regulación al alza más fuerte de la
producción de violaceína pero también una expresión de fondo más alta (Fig. S2), y este gen fue regulado a
la baja en respuesta tanto a la espectinomicina como a la tetraciclina (Tabla S1B).

Mecanismos de inducción de violaceína en respuesta a inhibidores del alargamiento. Dos

reguladores conocidos de la producción de violaceína, vioS y cviR, se expresaron diferencialmente
en presencia de tetraciclina o espectinomicina (Tabla S1A). VioS es una proteína pequeña sin
dominio de respuesta reconocible que reprime la producción de violaceína (24-26), y CviR es el
activador transcripcional sensible a feromonas de un sistema regulador dependiente del quórum
que activa la producción de violaceína (25-27). Los resultados de RNA-Seq para estos genes de
interés se corroboraron y expandieron usando PCR con transcriptasa inversa cuantitativa dirigida
(qRT-PCR) (Fig. 5A). Transcripción devioS está regulado a la baja por niveles subletales de tetraciclina
en el tipo salvaje y en el airR mutante, mientras que cviR se regula al alza en presencia de
tetraciclina, pero solo en el tipo salvaje, no en el airR
mutante (Fig. 5A). El aparente requisito deairR por cviR La inducción se confirmó
complementando la airR mutante con airR en transFigura 5A). Por lo tanto,airR es necesario
para la inducción de cviR expresión en respuesta a la tetraciclina.
Devescovi y col. Recientemente demostró que VioS es suficiente para inhibir la expresión del
promotor transcripcional corriente arriba del grupo de genes biosintéticos de violaceína y

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C. violaceum Produce Violacein en respuesta a los antibióticos.

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FIG 5 Una concentración subletal de derivaciones de tetraciclina vioS represión de la producción de violaceína mediada por la expresión diferencial de vioS y
cviR. (A) niveles de ARNm de vioS y cviR desde el C. violaceum tipo salvaje (WT) que lleva un vector vacío, un airR mutante que lleva un vector vacío, y un airR
mutante que lleva una copia de tipo salvaje de airR en presencia y ausencia de tetraciclina. **,PAG 0,01; ***,PAG 0,001; ****,PAG 0,0001; ns, no signi fi cativo (PAG
0,05). (B) Modelo propuesto para la inducción de violaceína por inhibidores de la traducción. (C) Sobreexpresión decviI y cviR bajo la regulación de arabinosa. (D)
Sobreexpresión devioS bajo regulación de arabinosa en presencia de una concentración subletal de tetraciclina. (E) Complemento
tación de vioS mutante con vioS gen regulado por arabinosa, con y sin tetraciclina. (F) Producción de violelaceína porvioS y vioS airMS
mutante. (G) Crecimiento devioS mutante y vioS airMS mutante. La leyenda del símbolo se aplica a los paneles F y G.

contrarresta la activación de este promotor por CviR–NORTE-hexanoiloL-lactona homoserina (C6-

HSL) en Escherichic coli (24). Aunque el mecanismo devioS-inhibición mediada de la
vioA promotor no se conoce, los datos sugieren que VioS y CviR-AHL compiten por el
vioA promotor o que VioS se une al complejo CviR-AHL, bloqueando así su actividad. Estas observaciones
sugieren que las condiciones que favorecen los niveles de CviR sobre los niveles de VioS

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favorecer la producción de violaceína. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la inducción de

violaceína por concentración subletal de antibióticos resultó de dos mecanismos independientes,
disminuyóvioS expresión y aumento cviR expresión mediada por el aire sistema (Fig. 5B).

Extrajimos tres predicciones de este modelo (Fig.5B): (i) el aumento de los niveles del activador
de violaceína CviR evitaría la represión por VioS, (ii) la sobreexpresión constitutiva de vioS
bloquearía la inducción de violaceína mediante antibióticos inhibidores de la traducción, y
(iii) el aire El sistema mediaría la respuesta de inducción de violaceína a antibióticos inhibidores de
la traducción incluso en ausencia de vioS. Validamos las predicciones i y ii, de la siguiente manera.
Sobreexpresión decviR induce violaceína sin antibióticos añadidos, mientras que la sobreexpresión
de cviI, el gen autoinductor sintasa sensible al quórum no induce la producción de violaceína (Fig.
5C). Esta observación sugiere que en estas condiciones, la respuesta dependiente del quórum está
limitada por los niveles de CviR pero no por los niveles de autoinductores. Además, la

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sobreexpresión constitutiva devioS bloquea la inducción de violaceína en presencia de antibióticos
inhibidores de la traducción (Fig. 5D y E).
Para probar la predicción iii, primero generamos el vioS airMS doble mutante.
Inesperadamente, este doble mutante produjo menos violaceína que elvioS mutante único sin
tetraciclina (Fig. 5F) y sin afectar la aptitud del crecimiento (Fig. 5G). Los resultados sugirieron cierta
actividad del sistema Air incluso en ausencia de tetraciclina. De acuerdo con esta posibilidad, la
comparación del tipo salvaje yairR Los datos de RNA-Seq mutante en ausencia de antibióticos
mostraron que la aire el sistema afectó la regulación de al menos 15 genes (Tabla S1C). Por lo tanto,
laaire el sistema parece tener alguna actividad incluso sin una señal de inhibición de la traducción.
Es importante destacar que los datos de la figura 5F muestran queaire El sistema modula la
producción de violaceína independientemente de VioS, como predijimos anteriormente.

DISCUSIÓN
En este estudio, examinamos una interacción interbacteriana mediada por niveles
subletales de antibióticos. Encontramos esoC. violaceum produce violaceína en respuesta a
niveles subletales de higromicina A liberada de Streptomyces sp. 2AW y en respuesta a otros
antibióticos bacteriostáticos estructuralmente diversos que inhiben el paso de elongación de
la traducción. Análisis genético enC. violaceum reveló un complejo regulador de dos
componentes recientemente descrito, el aire que participa en la regulación de la producción
de violaceína, así como de la virulencia y la producción de biofilm, todo lo cual está regulado
por el sistema de detección de quórum CviI / CviR. Análisis transcriptómico del tipo salvaje y el
airR mutante mostró una regulación a la baja mediada por antibióticos de vioS y regulación al alza de
cviR, revelando un mecanismo en el que se supera la represión VioS de la violaceína. El trabajo
anterior mostró que unvioS mutante de C. violaceum detecta diferentes lactonas de acil-
homoserina (26), incluida la producida por Burkholderia thailandensis (28). Aunque las
interacciones conStreptomyces y Burkholderia ambos dependen de un metabolito secretado
regulado por la detección de quórum, los mecanismos que sustentan su regulación difieren. Este
nuevo mecanismo de competencia interbacteriana difiere de la estrategia de competencia
previamente identi fi cada de la escucha dependiente de acil-homoserina lactona (28) y sugiere que
C. violaceum pueden detectar y responder a otros miembros de la comunidad microbiana en parte
mediante el uso de reguladores transcripcionales que detectan los efectos inhibidores de los
metabolitos secundarios producidos por sus vecinos. OtroCromobacteria Las cepas tienen una
maquinaria reguladora diferente y responden a los antibióticos de manera diferente a C. violaceum
ATCC 31532; por lo tanto, el trabajo reportado aquí pertenece solo a esta cepa, y no pretendemos
dar a entender que esta es una respuesta reguladora conservada entre todos
Chromobacterium violaceum son.
La idea de que los antibióticos sirven como señales en las comunidades microbianas (11) está
respaldada por nuestros hallazgos de que los niveles subletales de higromicina A producidos por
Streptomyces sp. 2AW inducen la producción de violaceína porC. violaceum cuando las bacterias crecen en
las proximidades. Se requieren más experimentos para determinar si la higromicina A desempeña un papel
de señalización en las comunidades naturales. Como se observa en las bacterias patógenas humanas, las
concentraciones subletales de antibióticos enC. violaceum también influyen en el comportamiento social,
como la patogenia, la formación de biopelículas, la detección de quórum y el metabolito secundario

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C. violaceum Produce Violacein en respuesta a los antibióticos.

producción (29). En esos sistemas, parece que los antibióticos funcionan como señales a través del
daño celular causado por el antibiótico inductor y detectado por las redes generales de respuesta al
estrés (14). Entre los diversos antibióticos probados,C. violaceum produce violaceína sólo en
respuesta a inhibidores de la etapa de elongación de la traducción del polipéptido. Recientemente,
Liu et al. informó de un fenómeno similar en el que los inhibidores de la traducción inducen la
motilidad deslizante enBacillus subtilis (30). C. violaceum también produce violaceína en respuesta
al choque frío, lo que proporciona otro ejemplo del conocido paralelismo entre las respuestas a los
antibióticos inhibidores de la traducción y el choque frío (21). Estos hallazgos sugieren que la
actividad de los antibióticos, en este caso la inhibición de la etapa de elongación del polipéptido de
la traducción, crea un estrés celular que inicia una cascada de señalización.
C. violaceum mostró una respuesta exquisita a la competencia de interferencia mediada por
antibióticos que bloquean el alargamiento de péptidos. La violaceína tiene una amplia actividad contra
diversas bacterias grampositivas (15), y la solubilidad extremadamente baja de la violaceína en agua

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permite que se acumule alrededor de las células.C. violaceum también produce un antibiótico no
caracterizado que es activo contra B. thailandensis y está regulado por la detección de quórum
(28), ilustrando que C. violaceum puede montar respuestas tanto amplias como específicas a los
competidores.
Nuestro trabajo demuestra una conexión entre el regulador de detección de quórum VioS, la
perturbación de la traducción y un sistema regulador distintivo de dos componentes, que revela una
gestión inusualmente refinada del sistema de detección de quórum. Tiene sentido biológico que la
respuesta a la competencia por interferencia esté regulada por la detección de quórum, porque es poco
probable que la producción de antibióticos a una densidad celular baja genere una concentración de
antibiótico lo suficientemente alta como para inhibir a otros organismos. La presencia de elementos
genéticos dedicados y específicos comovioS-airMSR diferencia esta regulación de las respuestas canónicas
al estrés identificadas en otros sistemas de competencia y muestra una especialización genética para
detectar y responder a señales de competidores potenciales.
los aire El sistema consta de un sistema regulador de dos componentes, un sensor (AirS) y un
regulador de respuesta (AirR), y una proteína de unión a molibdopterina oxidorreductasa (AirM), un
elemento inesperado basado en reguladores prototípicos de dos componentes. En un análisis
amplio de la base de datos, encontramosaireM-como genes asociados con sistemas reguladores de
dos componentes principalmente en betaproteobacterias, pero el aire system es el primero que se
identifica con una función asociada. losaire El sistema es desconcertante, porque un sensor de
membrana predicho, AirS, detecta una perturbación citoplasmática de la actividad de los
ribosomas. Presumimos que la perturbación de la traducción activa de los ribosomas crearía varios
cambios celulares detectados por elaire sistema. No podemos inferir la naturaleza de la señal
detectada por AirS, ya que no hay una anotación de dominios de sensores conocidos en la
secuencia de AirS. La función predicha de AirM, una proteína oxidorreductasa, sugiere que la señal
podría implicar un cambio oxidativo. Esto es compatible con la regulación positiva observada del
complejo de ubiquinona oxidorreductasa de NADH, aunque la expresión de las vías del estrés
oxidativo no pareció cambiar (datos no mostrados).
Otra señal potencial para el aire sistema podría ser una alteración en la composición lipídica de
la membrana. Nuestro cribado genético identificó dos genes, un gen de ligasa CoA de ácidos grasos
de cadena larga (fadB2) y un gen enoil-CoA hidratasa (fadD2), que son homólogos de genes que
participan en el catabolismo de los ácidos grasos (31). La enoil-CoA hidratasa está regulada a la baja
por concentraciones subletales de tetraciclina y espectinomicina, y el mutante con pérdida de
función produce violaceína sin exposición a antibióticos. El ácido graso de cadena larga CoA podría
eliminar los fosfolípidos asociados con la membrana, y la regulación a la baja de la enoil-CoA
hidratasa mediada por antibióticos podría cambiar el grupo de acilos-CoA saturados e insaturados,
alterando así la composición de los nuevos fosfolípidos agregados a la membrana. En particular, los
mutantes en la fosfoenolpiruvato sintasa, una enzima clave en la gluconeogénesis, recapitulan la
respuesta de laaire
sistema. La interrupción de la glucogénesis podría afectar la producción de glicerol 3-fosfato,
un sustrato clave para la síntesis de nuevos triacilgliceroles para la fabricación de
membranas, cuando la concentración de glucosa cae, como en la fase estacionaria. Sin
embargo, no podemos eliminar la posible interacción de otros productos de la
gluconeogénesis con la actividad delaire sistema.

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Lozano y col.

los aire Se necesita un sistema para la máxima producción de violaceína sin una
concentración subletal de tetraciclina en un mutante que carece del regulador negativo. vioS,
lo que indica que el sistema está activo sin estrés por antibióticos y puede tener una función
de limpieza. Esto está respaldado por la expresión génica diferencial de varios genes
mediados por laaire sistema sin antibióticos. Además, la presencia de un tercer elemento en
este sistema de dos componentes puede indicar que elaire El sistema integra múltiples
señales de diferentes vías celulares, como se ha demostrado en otros sistemas reguladores
de dos componentes con elementos auxiliares (32).
Hipotetizamos que C. violaceum coopta una red de señalización preexistente para integrar una
respuesta generada por la perturbación del ribosoma. Esto podría expandir el modelo de
"detección de competencia", mediante el cual las bacterias se adaptan no solo a las redes de
respuesta al estrés general, sino también a los moduladores transcripcionales, como los sistemas
reguladores de dos componentes que responden a cualquier respuesta fisiológica generada por los

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antibióticos. El ribosoma es uno de los objetivos más comunes de los antibióticos (33), y ser capaz
de detectar la inhibición de su función en lugar de detectar cada antibiótico de forma
independiente podría permitirC. violaceum tener una respuesta única para muchos competidores
en lugar de respuestas separadas para especies individuales. Esta respuesta única a la inhibición de
la traducción podría hacerC. violaceum ATCC 31532 es un indicador útil del modo de acción de
nuevos antibióticos.
Nuestro descubrimiento de la producción de antibióticos de C. violaceum en respuesta a la
antibiosis fue facilitado por el hecho de que este "contragolpe químico" (es decir, violaceína) es de
color púrpura. Con esta casualidad en mente, una pregunta central que surge del estudio actual es
si fenómenos similares están generalizados pero son menos visibles. Parece probable que las
comunidades microbianas posean formas emergentes de competencia química menos obvias pero
igualmente importantes. Los nuevos enfoques y tecnologías (34, 35) han preparado el campo para
un enfoque más completo para descubrir respuestas mediadas químicamente que sustentan las
interacciones microbianas.

MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas y condiciones de cultivo bacteriano. Streptomyces sp. 2 AW (36),Streptomyces higroscopicus
NRRL 2388 (19), Chromobacterium violaceum ATCC 31532 WT, C. violaceum ATCC 31532 vioSCv017) (26),
C. violaceum ATCC 31532 vioS cviI (Cv026) (26) y C. violaceum ATCC 12472 se cultivaron en LB (10 g litro 1
triptona, 5 g litro 1 extracto de levadura, 10 g litro 1 NaCl). S. higroscopicus NRRL 2388 y los mutantes
correspondientes fueron un regalo de Kevin Reynolds en la Universidad Estatal de Portland. Los antibióticos
se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.) (Ceftazidima, cloranfenicol, eritromicina, ácido fusídico,
higromicina B, ácido nalidíxico, paromomicina, piperacilina, polimixina B, puromicina, tetraciclina,
trimetoprima, vancomicina) . Prospect, IL, EE. UU.) (Apramicina, blasticidina S, rifampicina, espectinomicina),
de American Bio (Natick, MA, EE. UU.) (Kanamicina), de MP Biomedicals (Santa Ana, CA, EE. UU.)
(Estreptomicina) y de Enzo Ciencias de la vida (Farmingdale, NY, EE. UU.) (Kasugamicina).
Ensayo de interacción entre especies. Streptomyces sp. 2AW yS. higroscopicus NRRL2388 se colocaron en
placas LB y se incubaron durante 3 a 5 días, cuando de 5 a 10 l de C. violaceum Se colocó un cultivo líquido
desarrollado durante 16 ha 28 ° C en dos posiciones diferentes de las placas. Las placas se incubaron a 28 ° C hasta
que la producción de violaceína enC. violaceum fue observado.
Ensayo de inducción de violelaceína. Fracciones de un extracto de metanol de Streptomyces sp. 2AW
cultivados en medio sólido (18) se probaron directamente contraC. violaceum. Cada fracción se colocó en placas LB, y
luego 100 l de C. violaceum cultivos líquidos crecidos hasta una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 4,0 a 28 ° C se
extendió sobre las placas. Las placas se incubaron durante 2 días a 28 ° C. Los siguientes antibióticos fueron
evaluado vertiendo directamente 10 l de solución madre en placas LB: apramicina (100 g ml 1), blasticidina S
(25 g ml 1), ceftazidima (20 g ml 1), cloranfenicol (34 g ml 1), eritromicina (50 g ml 1),
ácido fusídico (10 g ml 1), higromicina B (50 g ml 1), kanamicina (50 g ml 1), kasugamicina (10 g ml 1), ácido
nalidíxico (10 g ml 1), paromomicina (10 g ml 1), piperacilina (50 g ml 1), polimixina B (50 g ml 1), puromicina (25
g ml 1), rifampicina (20 g ml 1), espectinomicina (50 g ml 1), estreptomicina (100 g ml 1), tetraciclina (10 g ml 1),
trimetoprima (5 g ml 1), y vancomicina (10 g ml 1).
C. violaceum mutagénesis de transposones y cribado genético de mutantes defectuosos en violaceína
producción. pSAM_BT21 se generó a partir de pSAM_BT20 (37) intercambiando el gen de resistencia a ampicilina
por un casete de resistencia a kanamicina amplificado a partir de pENTR / D-TOPO usando cebadores
KanTopo_MluIFor / KanTopo_MluIRev (ver Tabla S2 en el material suplementario) e insertado en el sitio MluI. C.
violaceum y E. coli S17-1 pir con pSAM_BT21 con kanamicina (50 g ml 1) primero se cultivaron individualmente
durante 16 ha 28 ° C y 37 ° C, respectivamente, con agitación. Las células se lavaron y se resuspendieron.
en medio fresco a una DO600 de 2.0. Un volumen deE. coli Se mezcló S17-1 pir con pSAM_BT21 con 2 volúmenes de C.
violaceum. Se recolectaron células (6.000 gramo, 6 min), resuspendido en 100 l de medio fresco,
y manchado en placas LB. La mezcla de conjugación se incubó a 28 ° C durante 6 hy luego se raspó y se
resuspendió en 2,5 ml de LB. Se sembraron alícuotas de cien microlitros en LB que contenía gentamicina.

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C. violaceum Produce Violacein en respuesta a los antibióticos.

(50 g ml 1), ampicilina (200 g ml 1), y tetraciclina (0,125 g ml 1) para la selección de C. violaceum
transconjugantes defectuosos en la producción de violaceína. Las placas se incubaron durante 2 días a 28 ° C.
Para cada mutante, se recogió 1 ml de cultivo líquido desarrollado durante 16 h (6.000 gramo, 6 min) y las células se
resuspendieron en 400 l de TE (Tris HCl 10 M [pH 7,4], EDTA 1 M [pH 8,0]). Las muestras se hirvieron durante 6 min y se
centrifugaron (6.000gramo, 6 min) y se utilizaron 2 l de sobrenadante como molde para la amplificación del ADN. Las
ubicaciones de los transposones se determinaron mediante PCR cebada arbitrariamente (38), que consistió en una PCR
anidada utilizando el cebador de primera ronda GenPATseq1 y AR1A o AR1B y los cebadores de segunda ronda GenPATseq2 y
AR2 (Tabla S2). Los productos de PCR de la segunda ronda se purificaron mediante extracción en gel (kit de extracción en gel
QIAquick; Qiagen) y luego se secuenciaron utilizando el cebador GenPATseq2. La secuenciación por PCR fue realizada por el
Centro de análisis de ADN en Science Hill en la Universidad de Yale.
Ensayo de producción de violaceína en respuesta a antibióticos y choque frío. Producción de violelaceína
por mutantes identificados como defectuosos para la inducción de violaceína en respuesta a la tetraciclina (0,125 g
ml 1) se evaluó en presencia de espectinomicina (2 g ml 1), eritromicina (2 g ml 1), y en cultivos líquidos a 16 ° C y 28 ° C.
Respuestas dependientes de la dosis de la producción de violaceína a la tetraciclina (0,25 a 4 g ml1),
espectinomicina (4 a 64 g ml 1), y eritromicina (2 a 16 g ml 1) se evaluaron en varios mutantes en placas LB.
Las respuestas a estos antibióticos y al choque frío se evaluaron visualmente basándose en el color púrpura

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de la violaceína.
Deleción cromosómica del airMS operón. los airMS El operón se eliminó mediante intercambio alélico
y se reemplazó con un casete de resistencia al cloranfenicol. losairMS El casete de deleción se construyó
mediante una versión modificada de la PCR de extensión superpuesta (OE) (39). Fragmentos 1 kb aguas
arriba y 1 kb aguas abajo delairMS El operón se amplificó utilizando los cebadores MuCv0535 / 6_Afor y
MuCv0535 / 6_Arev o los cebadores MuCv0535 / 6_Bfor y MuCv0535 / 6_Brev, respectivamente (Tabla S2).
Los productos resultantes tenían homología solapada, y la amplificación adicional con los cebadores
MuCv0535 / 6_Afor y MuCv0535 / 6_Brev dio como resultado un único producto combinado de
aproximadamente 2 kb que representa una fusión de las secuencias aguas arriba y aguas abajo. Este
producto de PCR se clonó en pENTR / D-TOPO, generando pairMS_ENTR. Los cebadores MuCv0535 / 6_Arev
y MuCv0535 / 6_Bfor se diseñaron para introducir un sitio SphI en la región superpuesta para permitir la
introducción de un gen de resistencia seleccionable. Se amplificó un casete de resistencia al cloranfenicol a
partir de pACYC184 usando los cebadores pACYC184Cm_For / pACYC184Cm_Rev, que contienen sitios SphI
en la región 5 =, y se clonó en pENTR / D-TOPO, generando pCm_ENTR.airMS operón. Amultitud El elemento
se recuperó de pmob_ENTR (40) usando AscI y se clonó en un sitio AscI en la columna vertebral de pENTR,
generando pairMS_Cm_mob_ENTR. Mezclas de conjugación deC. violaceum y E. coli Se prepararon S17-1 pir
que portaban el vector pairMS_Cm_mob_ENTR siguiendo el procedimiento para generar mutantes de
transposón. Doble recombinanteC. violaceum Los transconjugantes se seleccionaron en función de su
capacidad para crecer en cloranfenicol (34 g ml 1)
y se examinó la incapacidad de crecer con kanamicina (50 g ml 1). los airMS El mutante de deleción se
confirmó mediante PCR utilizando MuCv0535 / 6_Afor y MuCv0535 / 6_Brev y evaluando la producción de
violaceína en presencia de tetraciclina. Se utilizó la misma metodología para eliminarairMS en el C.
violaceum vioS mutante.
Ensayos de complementación y sobreexpresión. La expresión de amplio rango de huéspedes y el vector
pJN105 inducible por arabinosa se modificó mediante la introducción del casete de resistencia al cloranfenicol
recuperado de pCm_ENTR en el sitio SphI, generando pJN105Cm. aireS se amplificó utilizando los cebadores
CV0536_For y CV0536_Rev. airMS se amplificó utilizando los cebadores CV0535 / 6_For y CV0536_Rev. airR
se amplificó utilizando los cebadores CviR_For y CviR_Rev. vioS se amplificó utilizando los cebadores
CV1055_For y CV1055_Rev. cviI se amplificó utilizando los cebadores CviI_For y CviI_Rev, y cviR se amplificó
utilizando los cebadores CviR_For y CviR_Rev. Para todos estos genes, se agregó un sitio XbaI en la región 5
= al cebador directo y un sitio SacI en la región 5 = al cebador inverso, para una integración direccional de
cada gen frente al cebador.araBAD promotor en pJN105Cm. Los plásmidos se transfirieron al huésped
correspondiente utilizando el mismo protocolo de conjugación utilizado para generar los mutantes de
transposón. Genes bajo el control delaraBAD El promotor se indujo con arabinosa (0,05 a 1 mg ml 1).
Drosophila melanogaster ensayo de infección oral. Las moscas Canton-S (Cs) (sin wolbachia) se utilizaron como
líneas estándar de tipo salvaje. Drosophila las reservas se mantuvieron a 25 ° C en medio de harina de maíz (8 g litro 1
agar, 80 g litro 1 polenta, 40 g litro 1 levadura, 40 g litro 1 sacarosa, 53,6 ml litro 1 Moldex). C. violaceum
las cepas se esparcieron a partir de reservas de glicerol congeladas sobre placas LB y se incubaron a 28ºC durante la noche. A
continuación, las colonias aisladas se inocularon en medio LB y se cultivaron a 28ºC durante 20 h. Los cultivos se centrifugaron
(4.000 rpm, 20 min, 4ºC). Se decantó el sobrenadante, se resuspendieron los sedimentos en el
líquido restante, y las concentraciones de los cultivos se ajustaron a una DO600 de 200 (aproximadamente 100 veces
la concentración del cultivo original de la noche a la mañana). Para el tratamiento con antibióticos, tetraciclina (2,5 g
ml 1) se añadió a los cultivos concentrados inmediatamente antes de alimentar a las moscas con los cultivos.
Las moscas hembras adultas se sacrificaron en viales vacíos durante 2 ha 29 ° C. Se colocaron filtros de papel encima de los alimentos.
medio y 150 l de una mezcla 1: 1 del pellet concentrado (OD600 200) y sacarosa al 2,5%
adicional; para el control negativo de sacarosa, LB sustituyó al sedimento bacteriano. Las moscas hambrientas se transfirieron a los viales
de infección y se mantuvieron a 29 ° C. La supervivencia se evaluó a las 2 h después de la infección para tener en cuenta cualquier
mortalidad independiente de la infección. El número de moscas muertas por vial se registró dos veces al día durante aproximadamente 5
días después de la infección. Se analizaron las posibles diferencias en la supervivencia entre los tratamientos para determinar su
importancia con el análisis de supervivencia de Kaplan Meier utilizando el software GraphPad Prism.
Análisis filogenético. Cromobacteria Los genomas de las especies se recuperaron de la base de datos
NCBI, junio de 2017 (Tabla S3). La reconstrucción filogenómica se logró utilizando el software de análisis
filogenético y evolutivo molecular (PhaME) (41). PhaME identificó polimor-

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Lozano y col.

phisms (SNP) de las alineaciones del genoma central, y las relaciones filogenéticas se infirieron por máxima
probabilidad utilizando FastTree.
Análisis de RNA-Seq. C. violaceum WT y airR Las cepas mutantes se cultivaron sin antibióticos, con
tetraciclina (0,125 g ml 1) o con espectinomicina (2 g ml 1) en 5 ml de LB a 28 ° C con agitación en
duplicar. Se prepararon muestras de ARN a partir de 250 l de células cultivadas hasta una DO600 de 3.2. Los cultivos se
mezclaron con 750 l de TRIzol y se incubaron a 65 ° C durante 10 min. Las muestras se congelaron a –80 ° C durante 10 min.
y se descongeló a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió cloroformo (200 l) y las muestras se agitaron e
incubaron a temperatura ambiente durante 3 min y se centrifugaron (12.000gramo, 15 min, 4 ° C). La fase acuosa se
recuperó, se mezcló con 500 l de isopropanol, se incubó a temperatura ambiente durante 10 min y se centrifugó
(12.000gramo, 10 min, 4 ° C). El sedimento se lavó con 1 ml de etanol al 75% y se secó al aire durante 10 min, se
resuspendió con 50 l de agua libre de RNasa y finalmente se incubó a 60ºC durante 15 min. Se eliminó el ADN de 5 g
de ARN total usando el kit TURBO DNase (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.).
Las muestras de ARN se trataron con el kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.), Se
construyeron bibliotecas de ADNc con un tamaño promedio de 150 a 200 pb y se secuenciaron en un Illumina HiSeq 2500 de
dos extremos emparejados. 75 plataforma. La preparación de la biblioteca y la secuenciación fueron realizadas por el Yale
Center for Genome Analysis. Las secuencias de baja calidad se recortaron con Trimmomatic (42). Las lecturas mapeadas y los

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niveles estimados de expresión génica se calcularon utilizando RSEM con una lista de transcripciones de marcos de lectura
abiertos (ORF) recuperados de laC. violaceum genoma (conjunto de GenBank nº de acceso GCA_002865685.1) (43). La expresión
diferencial se evaluó usando limma (44) usando la función "voom"
para modelar la relación de varianza media de los recuentos de lectura convertidos a log2 recuentos por millón (logCPM). Los
genes que no se expresaron apreciablemente (transcripciones por millón [TPM] 5) se descartaron, como
recomendado (44). Genes con un ajustadoPAG El valor de 0,01 se identificó como expresado
diferencialmente.
Se identificó que los genes tenían una respuesta generalizada a la inhibición de la elongación
traslacional si se expresaban diferencialmente en el WT en presencia de tetraciclina y en presencia de
espectinomicina, en relación con aquellos sin antibiótico (Tabla S1A). Genes para los cuales la respuesta a la
inhibición traslacional está mediada, directa o indirectamente, por laaire sistema se identificaron si no se
expresaron diferencialmente en respuesta a la tetraciclina o estreptomicina en el airR fondo mutante (pero
estaban en WT), o si estos genes se expresaron diferencialmente cuando el WT se comparó con el
airR mutante en presencia de ambos antibióticos (Tabla S1D).
qRT-PCR. Se utilizó PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (qRT-PCR) para validar la expresión genética
diferencial detectada para vioS y cviR en el análisis de RNA-Seq. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla S2.
C. violaceum PESO pJN105Cm, airR pJN105Cm y airR pJN105Cm_airR se cultivaron con cloranfenicol (34 g ml 1) y con o
sin tetraciclina (0,125 g ml 1) por triplicado como se informó anteriormente. Se recuperó el ARN total y se trató la
ADNasa de la misma manera que el ARN recuperado para el análisis de ARN-Seq. Se sometieron a transcripción
inversa 200 nanogramos de ARN tratado con ADNasa en ADNc utilizando el sistema de síntesis de primera hebra
SuperScript III (Invitrogen). La PCR cuantitativa se llevó a cabo en un volumen de 10 l utilizando la mezcla maestra
verde PowerUp SYBR (Applied biosystems) con 1 l de ADNc y cebadores de PCR 200 nM. Estas reacciones se
realizaron utilizando el sistema en tiempo real CFX96 (Bio-Rad) con los siguientes parámetros de ciclo: 50 ° C durante
10 min, 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 10 sy 60 ° C durante 30 s. Se incluyeron PCRs de
plantilla de transcriptasa inversa menos (RT menos) como controles negativos para con fi rmar la ausencia de
contaminación del ADN genómico. Se incluyeron curvas estándar de ADN diluido en serie diez veces en cada placa.
Se realizaron análisis de la curva de fusión para verificar la especificidad de los productos de PCR. Los niveles de
expresión bajo cada condición se normalizaron aldnaG gen de mantenimiento, y se utilizó el método Pfaf fl para
calcular el cambio de veces en la expresión génica (45). Las diferencias entre los grupos se probaron para
determinar la signi fi cación estadística (Student'st prueba) utilizando el software GraphPad Prism 7.
Caracterización de C. violaceum vioS airR. C. violaceum vioS pJN105Cm, vioS airMS pJN105Cm y
vioS airMS pJN105Cm_airMS se cultivaron con cloranfenicol (34 g ml 1) y arabinosa (0,2 mg ml 1) con agitación durante 2 días a 28
° C. Se extrajeron muestras periódicamente para evaluar el crecimiento bacteriano mediante dilución en serie y placa en LB y
para cuantificar la producción de violaceína. La violelaceína se cuantificó mediante una extracción cruda de violaceína (46). Se
centrifugaron alícuotas de un mililitro de cultivos de cada cepa (14.000gramo, 20 min) y las células se resuspendieron en 1 ml
de etanol para disolver la violaceína. Los sobrenadantes se recuperaron después de la centrifugación (12.000gramo, 10 min) y
se transfirieron a placas de 96 pocillos. La concentración de violelaceína se determinó espectrofotométricamente a 575 nm en
un lector de placas Synergy HT (BioTek).

MATERIAL SUPLEMENTARIO
El material complementario está disponible solo en línea.
FIG S1, Archivo TIF, 1,6 MB.
FIG S2, Archivo TIF, 1,4 MB.
FIG S3, Archivo TIF, 0,7 MB.
FIG S4, Archivo TIF, 2 MB.
FIG S5, Archivo TIF, 0,8 MB.
FIG S6, Archivo TIF, 0,3 MB.
FIG S7, Archivo TIF, 0,5 MB.
TABLA S1, Archivo XLSX, 0,1 MB.
TABLA S2, Archivo PDF, 0,1 MB.
TABLA S3, Archivo PDF, 0,1 MB.

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C. violaceum Produce Violacein en respuesta a los antibióticos.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a Bailey Kleven por su asistencia técnica y a Sara Knaack por
discutir el análisis transcriptómico.
Esta investigación fue apoyada por la Oficina del Rector de la Universidad de Yale y por fondos
de la Fundación de Investigación de Antiguos Alumnos de Wisconsin a través de la Oficina del
Vicerrector de Investigación y Educación de Graduados de la Universidad de Wisconsin-Madison.
EVS recibió el apoyo de la subvención MCB-1716232 de la National Science Foundation.
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